Analisis Data - METODE PENELITIAN - AKTIVITAS ENZIM PROTEASE KAPANG ENDOFIT YANG DIISOLASI DARI

BAB III. METODE PENELITIAN

3.5. Analisis Data

Isolat kapang endofit yang mampu menghasilkan enzim protease dilakukan pengukuran aktivitas enzim, jika tidak mampu menghasilkan enzim protease maka tidak dilanjutkan pengukuran aktivitas enzim. Data aktivitas enzim protease diuji normalitas dan homogenitas untuk menentukan uji rata-rata aktivitas enzim menggunakan analisis statistik parametrik atau nonparametrik. Data aktivitas enzim protease isolat kapang endofit yang dipengaruhi ketiga suhu terhadap waktu inkubasi selama 7 hari pada media produksi enzim substrat susu skim dianalisis menggunakan statistik parametrik analisis variansi satu jalur. Data aktivitas enzim protease menggunakan substrat susu skim kemudian diuji lanjut post-hoc Duncan untuk melihat perbedaan nyata antara variabel independen.

Data aktivitas enzim protease isolat kapang endofit yang dipengaruhi ketiga suhu terhadap waktu inkubasi selama 7 hari pada media produksi enzim substrat kasein dianalisis menggunakan statistik nonparametrik Kruskal-Wallis. Data aktivitas enzim protease menggunakan substrat kasein kemudian diuji lanjut stepwise step-down untuk melihat perbedaan nyata antara variabel independen.

Analisis statistik ini menggunakan software IBM SPSS statistik 20.0 dengan tingkat kepercayaan 95%. Data pengukuran kadar protein dianalisis secara deskriptif menggunakan Microsoft Excel 2016 disajikan dalam bentuk grafik.

23 BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1. Skrining Aktivitas Enzim Protease Kapang Endofit

Skrining aktivitas enzim protease dilakukan untuk mengetahui sifat proteolitik pada kapang endofit daun pepaya. Hasil skrining aktivitas enzim protease kapang endofit daun pepaya menunjukkan bahwa dari ketiga isolat yang memiliki kemampuan terbaik dalam menghasilkan enzim protease adalah isolat kapang endofit JE-DP4 karena menghasilkan zona bening sebesar 38,5 mm dengan diameter koloni sebesar 26,5 mm (Tabel 2). Hal ini menunjukkan bahwa isolat JE-DP4 merupakan kapang endofit proteolitik karena mampu menghasilkan enzim protease ekstraseluler yang mendegradasi protein susu dalam media skim milk agar sehingga membentuk zona bening. Enzim protease yang dihasilkan oleh isolat kapang endofit JE-DP4 digunakan untuk mempertahankan hidupnya di dalam jaringan tanaman inang (Safitri, Muchlissin, Mukaromah, Darmawati, &

Ethica, 2018; Pavithra, Sathish, & Ananda, 2012).

Tabel 2. Hasil skrining aktivitas enzim protease kapang endofit daun tanaman adanya aktivitas hidrolitik enzim protease yang dilepaskan oleh miselium kapang.

Abdennabi, Triki, Salah, & Gharsallah (2017), melaporkan dalam penelitiannya aktivitas enzim protease kapang endofit Fusarium sp. ditunjukkan dengan zona bening yang terbentuk disekitar koloni sebesar 36 mm. Hal ini menunjukkan bahwa aktivitas enzim protease kapang dapat terlihat dari zona bening yang terbentuk.

Kapang endofit JE-DP4 bersifat proteolitik karena mampu memproduksi enzim protease ekstraseluler. Enzim protease ekstraseluler, yaitu enzim pemecah protein yang diproduksi di dalam sel untuk dilepaskan keluar dari sel. Enzim

protease ekstraseluler penting untuk hidrolisis protein di lingkungan bebas sel dan memungkinkan sel untuk menyerap serta memanfaatkan produk hidrolitik tersebut (Hamza, 2017). Identifikasi isolat kapang endofit JE-DP4 perlu dilakukan untuk membandingkan aktivitas enzim protease yang dihasilkan oleh jenis kapang yang sama termasuk tinggi atau rendah. Identifikasi kapang juga dapat mengetahui kapang endofit bersifat patogen atau tidak patogen, sehingga kapang endofit aman digunakan untuk memenuhi kebutuhan industri pangan atau kesehatan. Kapang endofit umumnya bersifat menguntungkan bagi tanaman inangnya, beberapa kapang endofit ada yang bersifat patogen (Rodriguez et al., 2009).

Isolat kapang endofit JE-DP4, JE-BP1, dan JE-BP3 sebelumnya disimpan dalam media malt extract agar. Isolat kapang endofit JE-DP4 masih mampu menghasilkan zona bening sedangkan JE-BP1 dan JE-BP3 tidak menghasilkan zona bening. Hal ini dapat disebabkan oleh perbedaan jumlah induktor masing-masing jenis dan strain kapang (Choliq, 2008). Isolat kapang endofit JE-BP1 dan JE-BP3 tidak menghasilkan zona bening juga dapat disebabkan karena kehilangan kemampuan aktivitas enzimnya akibat terlalu lama disimpan di media malt extract agar. Media malt extract agar memiliki kandungan protein yang sedikit. Hal ini menyebabkan tidak adanya yang menginduksi kemampuan kapang endofit tersebut untuk menghasilkan enzim protease sehingga tidak dapat menyintesis enzim protease ekstraseluler. Enzim protease ekstraseluler merupakan enzim induktif yang sintesisnya dipengaruhi oleh induktor (Peterson, Grinyer, &

Nevalainen, 2011).

Indeks hidrolisis protein menunjukkan aktivitas enzim protease. Aktivitas relatif protease isolat kapang endofit JE-DP4 mempunyai nilai indeks hidrolisis protein >1, yaitu sebesar 1,45 pada hari ke-7 inkubasi (Tabel 2). Hasil pengukuran indeks hidrolisis protein tersebut termasuk ke dalam kategori rendah karena nilai aktivitas relatif proteasenya <2. Soeka & Sulistiani (2014), melaporkan dalam penelitiannya nilai indeks hidrolisis protein sebesar 1,50 termasuk kategori rendah. Nilai indeks hidrolisis protein >2 menunjukkan aktivitas enzim yang tinggi. Nilai indeks hidrolisis protein yang dihasilkan oleh kapang endofit semakin tinggi maka zona bening yang terbentuk akan semakin besar (Hastuti et al., 2017). Maitig, Alhoot, & Tiwari (2018), melaporkan dalam penelitiannya

bahwa Aspergillus sp. memiliki nilai indeks hidrolisis protein sebesar 2,09 setelah 96 jam inkubasi. Nilai indeks hidrolisis protein kapang endofit tersebut sebesar 2,09 lebih besar dibandingkan nilai indeks hidrolisis protein yang dihasilkan isolat kapang endofit JE-DP4 sebesar 1,45.

Isolat kapang endofit yang mampu menghasilkan enzim protease adalah JE-DP4, sehingga yang akan diukur aktivitas enzim protease isolat tersebut. Isolat kapang endofit JE-DP4, JE-BP1, dan JE-BP3 sebelumnya telah di skrining aktivitas enzim protease setelah berhasil diisolasi dari daun pepaya. Pengujian ulang aktivitas enzim protease perlu dilakukan ketika ingin mengukur aktivitas enzim untuk memastikan aktivitas enzim protease masih aktif. Enzim dari kapang endofit memiliki peran penting dalam pertanian, industri, dan kesehatan karena stabilitasnya pada suhu tinggi dan pH yang ekstrim dibandingkan sumber enzim dari tanaman dan hewan (Jalgaonwala & Mahajan, 2011; Sathish et al., 2012).

Kapang endofit memiliki fleksibilitas metabolisme yang baik dalam kelangsungan hidupnya sehingga menjadikannya mikroorganisme terpilih untuk produksi enzim tertentu (Zaferanloo, Virkar, Mahon, & Palombo, 2013).

4.2. pH Pertumbuhan Kultur pada Media Produksi Enzim Protease

pH pertumbuhan isolat kapang endofit JE-DP4 pada media produksi enzim protease menggunakan substrat kasein pada hari ke-1 inkubasi sebesar 6,9 kemudian mengalami penurunan hingga hari ke-3 menjadi sebesar 5,8. Setelah mengalami penurunan, pH mengalami kenaikan pada waktu inkubasi berikutnya hingga hari ke-7 sebesar 6,5 (Gambar 7a). pH pertumbuhan isolat kapang endofit JE-DP4 pada media produksi enzim protease menggunakan substrat susu skim pada hari ke-1 inkubasi sebesar 7,0 kemudian mengalami penurunan hingga hari ke-3 menjadi 6,3. Setelah mengalami penurunan, pH mengalami kenaikan pada waktu inkubasi berikutnya hingga hari ke-7 sebesar 6,8 (Gambar 7b). pH pertumbuhan pada awal produksi enzim cenderung mengalami penurunan karena terjadi proses pemecahan karbohidrat menjadi asam-asam organik. pH pertumbuhan mengalami kenaikan karena media tertutup oleh amonia dari pemecahan senyawa-senyawa yang mengandung nitrogen (Sumarlin, 2008).

Enzim mempunyai konformasi sisi aktif yang sesuai dengan substrat untuk membentuk kompleks enzim-substrat yang tinggi. Hal ini karena gugus pemberi

dan penerima proton di sisi katalitik enzim berada pada tingkat ionisasi yang diinginkan, sehingga dapat menghasilkan produk yang tinggi (Fathimah &

Wardani, 2014).

Gambar 7. Nilai pH pertumbuhan kapang endofit JE-DP4; a. menggunakan substrat kasein, b. menggunakan substrat susu skim

Aktivitas enzim protease tertinggi isolat kapang endofit JE-DP4 menggunakan substrat kasein sebesar 46,72 U/mL (Gambar 8) terjadi pada pH pertumbuhan sebesar 6,9. Aktivitas enzim protease tertinggi isolat kapang endofit JE-DP4 menggunakan substrat susu skim sebesar 11,30 U/mL (Gambar 9) terjadi pada pH pertumbuhan sebesar 6,4. Aktivitas enzim protease tertinggi berada pada tingkat ionisasi yang sesuai untuk berikatan dengan substrat dan konformasi enzim yang sangat stabil sehingga efektifitas pengikatan enzim-substrat menjadi tinggi (Malle, Telussa, & Lasamahu, 2015). Perubahan keaktifan enzim diakibatkan oleh ioniasi gugus ionik enzim pada sisi aktif atau sisi lain yang tidak langsung memengaruhi sisi aktif. Gugus ionik berperan menjaga konformasi sisi aktif dalam mengikat dan mengubah substrat menjadi produk (Baehaki, Rinto, &

Budiman, 2011). Perubahan muatan ion oleh asam amino penyusun enzim atau substrat karena pH dapat menyebabkan aktivitas enzim menurun (Yusriah &

Kuswytasari, 2013).

Aktivitas enzim protease tertinggi yang dihasilkan oleh isolat kapang endofit JE-DP4 aktif pada kisaran pH 6. Hal ini menunjukkan bahwa enzim

protease yang dihasilkan dapat dikelompokkan ke dalam protease asam. Menurut de Souza et al. (2015), enzim protease yang dihasilkan pada kisaran pH 2,0-6,0 dapat dikelompokkan ke dalam protease asam. pH enzim protease kapang dapat diklasifikasikan sebagai protease asam, alkalin, dan netral (Yusriah &

Kuswytasari, 2013). Muthulakshmi et al. (2011), melaporkan bahwa enzim protease yang dihasilkan oleh Aspergillus flavus menunjukkan aktivitas tertingginya pada pH 4. Ramadhani, Rukmi, & Pujiyanto (2015), melaporkan bahwa aktivitas enzim protease tertinggi oleh Aspergillus niger PAM18A aktif pada pH 9. Kapang endofit yang berbeda strain menunjukkan aktivitas enzim protease tertinggi pada pH yang berbeda (Siala et al., 2009).

pH pertumbuhan kultur pada media produksi enzim protease menggunakan substrat kasein dan susu skim mengalami kenaikan dan penurunan pH yang stabil dari hari ke-1 hingga hari ke-7 inkubasi berkisar antara 5,8-7,1. Hal ini menunjukkan bahwa enzim protease isolat kapang endofit JE-DP4 mampu bekerja aktif pada kisaran pH asam hingga netral. Zaferanloo et al. (2014), melaporkan dalam penelitiannya bahwa enzim protease kapang endofit aktif dalam kisaran pH yang luas, yaitu 3,0-9,0. Agrawal et al. (2016), juga melaporkan dalam penelitiannya kapang endofit Alternaria alternata mampu menghasilkan enzim protease dalam kisaran pH 3,0-12. Mikroorganisme memiliki kondisi yang sesuai untuk pertumbuhan, reproduksi, dan aktivitas fisiologis lainnya. Produktivitas enzim oleh kultur kapang sangat tergantung pH media fermentasi. pH media pertumbuhan memengaruhi permebilitas kapang dalam mensekresikan enzim protease. Suhu dan kondisi pH dalam produksi enzim protease cenderung mencerminkan kondisi iklim yang ditemukan di lingkungan tempat tanaman tumbuh (Zaferanloo et al., 2013).

4.3. Pengaruh Suhu dan Waktu Inkubasi terhadap Aktivitas Protease

Hasil analisis kurva standar tirosin diperoleh persamaan regresi linier y = 9,738x + 0,056 dengan koefisien regresi linier (R²) = 0,9934 (Lampiran 2). Kurva standar tirosin digunakan untuk mengukur konsentrasi tirosin. Pembuatan kurva standar menggunakan larutan standar tirosin karena tirosin merupakan salah satu asam amino hasil produk hidrolisis protein. Menurut Yusriah & Kuswytasari (2013), larutan standar tirosin digunakan untuk mengukur aktivitas enzim protease dalam memecah protein menjadi asam amino penyusunnya.

Konsentrasi tirosin yang dilepaskan pada hidrolisis protein menggunakan substrat media produksi berupa kasein dan susu skim terus meningkat seiring bertambahnya waktu inkubasi (Lampiran 5). Hal ini menunjukkan bahwa aktivitas enzim protease terus meningkat hingga tercapai aktivitas tertinggi pada waktu inkubasi yang paling sesuai. Menurut Ratnayani, Nazib, Sibarani, & Laksmiwati (2018), konsentrasi tirosin yang semakin besar menunjukkan semakin tinggi aktivitas enzim protease yang dihasilkan dan semakin banyak molekul protein yang dipecah menjadi monomer penyusunnya.

Aktivitas enzim protease isolat kapang endofit JE-DP4 diuji pada ketiga suhu, yaitu suhu 30°C, 37°C, dan 44°C pada pH konstan 7,5. Suhu 30°C merupakan suhu optimal untuk pertumbuhan kapang (K. M. Sharma et al., 2017).

Suhu 37°C menjadi suhu yang optimal untuk menghasilkan enzim protease (Ramya & Bharathi, 2015). Suhu 44°C digunakan untuk mengukur aktivitas enzim yang dihasilkan pada suhu tinggi. pH 7,5 diperoleh dari bufer Tris-HCl.

Kisaran pH 7,0-7,5 menjadi kondisi yang baik untuk menjaga kestabilan enzim (Pasaribu, Nurhayati, & Nurilmala, 2018). Menurut K. M. Sharma et al. (2017), pH yang sesuai untuk menghasilkan enzim protease kapang adalah 7,0-7,5. pH memengaruhi kecepatan aktivitas enzim dalam mengkatalisis suatu reaksi (Yusriah & Kuswytasari, 2013). Pengujian aktivitas enzim protease pada ketiga suhu, waktu inkubasi, dan substrat dilakukan untuk meningkatkan produktivitas enzim. Pengaruh ketiga suhu terhadap aktivitas enzim protease isolat kapang endofit JE-DP4 menggunakan substrat kasein dan susu skim selama 7 hari inkubasi dapat dilihat (Gambar 8) dan (Gambar 9).

Gambar 8. Nilai aktivitas enzim protease kapang endofit JE-DP4 pada ketiga suhu menggunakan substrat kasein selama 7 hari inkubasi; a. 30°C, b.

37°C, c. 44°C a

Berdasarkan analisis statistik Kruskal-Wallis diperoleh nilai Asymp. Sig sebesar 0,037 atau probabilitas di bawah 0,05 (0,037 < 0,05) menunjukkan bahwa terdapat perbedaan signifikan rata-rata aktivitas enzim protease menggunakan substrat kasein dari ketiga suhu terhadap waktu inkubasi selama 7 hari. Aktivitas enzim protease menggunakan substrat kasein terdapat perbedaan nyata, sehingga dilakukan uji lanjut stepwise step-down. Hasil uji lanjut menunjukkan bahwa pada hari ke-7 dan hari ke-2 terdapat perbedaan nilai aktivitas enzim protease yang signifikan. Pada hari ke-7 menunjukkan nilai tertinggi pada kolom subset 2 sebesar 18,333 sedangkan pada hari ke-2 menunjukkan nilai terendah pada kolom subset 1 sebesar 3,000. Hal ini menunjukkan bahwa aktivitas enzim protease tertinggi menggunakan substrat kasein dihasilkan pada hari ke-7 inkubasi dengan rata-rata aktivitas enzim dari ketiga suhu sebesar 28,97 U/mL. Pada hari ke-2 inkubasi menunjukkan rata-rata nilai aktivitas enzim protease terendah dari ketiga suhu sebesar 8,01 U/mL (Lampiran 10).

Aktivitas enzim protease isolat kapang endofit JE-DP4 menggunakan substrat kasein pada suhu 30°C hari ke-1 belum dihasilkan enzim protease karena kapang masih dalam fase adaptasi. Aktivitas enzim protease tertinggi menggunakan substrat kasein pada suhu 30°C terjadi pada hari ke-7 sebesar 25,37 U/mL sedangkan aktivitas enzim protease terendah terjadi pada hari ke-2 sebesar 7,20 U/mL (Gambar 8a). Aktivitas enzim protease isolat kapang endofit JE-DP4 terus meningkat dari hari ke-1 hingga hari ke-7 inkubasi, yaitu sebesar 7,20 U/mL hingga 25,37 U/mL. Produksi enzim protease tertinggi isolat kapang endofit JE-DP4 menggunakan substrat kasein dihasilkan pada hari ke-7 inkubasi sebesar 25,37 U/mL. Waktu inkubasi menjadi parameter aktivitas metabolisme dan pertumbuhan kapang. Waktu inkubasi di atas waktu optimal akan menyebabkan penurunan tingkat pertumbuhan dan produktivitas enzim karena berkurangnya nutrisi dalam media fermentasi. Kekurangan nutrisi menyebabkan kondisi stres dan tidak menguntungkan bagi mikroorganisme sehingga terjadi penurunan aktivitas enzim (Khusro, 2016).

Muthulakshmi et al. (2011), melaporkan dalam penelitiannya produksi enzim protease tertinggi oleh Aspergillus flavus sebesar 49,30 U/mL membutuhkan waktu inkubasi hingga hari ke-7. Pada hari ke-8 terjadi penurunan

aktivitas enzim menjadi sebesar 40 U/mL. Oleh karena itu, waktu inkubasi untuk mengukur aktivitas enzim protease isolat kapang endofit JE-DP4 dilakukan hingga hari ke-7. Al-Askar, Abdulkhair, & Rashad (2014), melaporkan bahwa aktivitas enzim protease oleh Fusarium solani dari hari pertama inkubasi secara bertahap meningkat dan mencapai aktivitas enzim tertinggi pada hari ke-7. Enzim protease diproduksi dalam jumlah tinggi pada fase pertumbuhan eksponensial hingga fase stasioner (Ilmiah, Mubarik, & Wahyuntari, 2018).

Aktivitas enzim protease tertinggi isolat kapang endofit JE-DP4 menggunakan substrat kasein pada suhu 37°C sebesar 46,72 U/mL sedangkan aktivitas enzim protease terendah sebesar 8,92 U/mL (Gambar 8b). Aktivitas enzim protease pada suhu 37°C hari ke-1 inkubasi nilainya tinggi sebesar 46,72 U/mL. Waktu inkubasi berikutnya nilai aktivitas enzim protease meningkat secara bertahap hingga hari ke-7, yaitu sebesar 8,92 U/mL hingga 28,64 U/mL. Menurut Yuniati et al. (2015), aktivitas enzim protease yang tinggi pada waktu awal produksi karena masih tersedianya banyak nutrisi yang diperlukan oleh kapang untuk melakukan metabolisme sel dan suhu 37°C merupakan suhu optimal dihasilkannya enzim protease. Suhu mempunyai 2 mekanisme berlawanan dalam memengaruhi aktivitas enzim, yaitu aktivasi dan denaturasi. Aktivasi akan meningkatkan laju reaksi seiring dengan kenaikan suhu. Denaturasi mengakibatkan pembukaan struktur kuartener dan tersier enzim karena suhu tinggi (Vitolo, 2015).

Rata-rata aktivitas enzim protease tertinggi isolat kapang endofit JE-DP4 menggunakan substrat kasein dihasilkan pada suhu 37°C sebesar 22,64 U/mL karena pada suhu 30°C rata-rata aktivitas enzim protease yang dihasilkan sebesar 14,74 U/mL dan suhu 44°C sebesar 20,96 U/mL. Menurut Ramya & Bharathi (2015), suhu yang optimal untuk menghasilkan aktivitas enzim protease tertinggi adalah suhu 37°C. Aktivitas enzim meningkat seiring bertambahnya suhu hingga tercapai suhu optimal. Setiap enzim memiliki suhu optimal untuk menghasilkan aktivitas enzim tertinggi (Sayem, Alam, & Hoq, 2006). Kenaikan suhu menyebabkan aktivitas enzim meningkat karena terjadi peningkatan energi kinetik yang mempercepat gerak vibrasi, translasi, dan rotasi enzim maupun substrat. Hal ini dapat menambah intensitas tumbukan antara enzim dan substrat. Intensitas

tumbukan yang bertambah akan memudahkan dalam membentuk kompleks enzim dengan substrat sehingga produk yang terbentuk akan semakin banyak (Noviyanti et al., 2013).

Peningkatan suhu di atas suhu optimal akan menurunkan laju reaksi enzim sehingga aktivitas enzim akan menurun. Aktivitas enzim menurun terjadi karena perubahan konformasi enzim yang menyebabkan ikatan-ikatan kovalen dalam mempertahankan struktur enzim terputus, sehingga gugus aktif enzim mengalami kerusakan (Kusumadjaja & Dewi, 2005; Fathimah & Wardani, 2014).

Peningkatan energi termal molekul yang membentuk struktur protein enzim menyebabkan rusaknya interaksi-interaksi non kovalen yang menjaga struktur 3 dimensi enzim secara bersama-sama sehingga enzim mengalami denaturasi.

Interaksi-interaksi non kovalen terdiri atas ikatan hidrogen, ikatan van der walls, ikatan hidrofobik, dan interaksi elektrostatik. Struktur lipatan enzim membuka pada bagian permukaannya akibat denaturasi sehingga menyebabkan terjadinya penurunan aktivitas enzim (Baehaki et al., 2011).

Aktivitas enzim protease tertinggi isolat kapang endofit JE-DP4 menggunakan substrat kasein pada suhu 44°C terjadi pada hari ke-7 sebesar 32,90 U/mL sedangkan aktivitas enzim protease terendah terjadi pada hari ke-2 sebesar 7,92 U/mL (Gambar 8c). Aktivitas enzim protease isolat kapang endofit JE-DP4 menggunakan substrat kasein pada suhu 44°C terus meningkat hingga hari ke-7 inkubasi dari sebesar 7,92 U/mL hingga 32,90 U/mL. Siala et al. (2009), melaporkan dalam penelitiannya aktivitas enzim protease yang dihasilkan oleh Aspergillus niger menggunakan substrat kasein sebesar 94,240 U/mL. Nilai aktivitas enzim protease kapang endofit tersebut sebesar 94,240 U/mL lebih tinggi dibandingkan aktivitas enzim protease yang dihasilkan oleh isolat kapang endofit JE-DP4 sebesar 46,72 U/mL. Menurut Choliq (2008), kemampuan kapang dalam menghasilkan enzim protease yang tinggi dipengaruhi oleh perbedaan variasi gen penyandi protease setiap jenis dan strain kapang.

Gambar 9. Nilai aktivitas enzim protease kapang endofit JE-DP4 pada ketiga suhu menggunakan substrat susu skim selama 7 hari inkubasi; a. 30°C, b.

37°C, c. 44°C a

Berdasarkan hasil analisis variansi satu jalur diperoleh nilai probabilitas pada kolom signifikansi sebesar 0,000 atau probabilitas di bawah 0,05 (0,000 <

0,05) yang menunjukkan bahwa terdapat perbedaan nyata rata-rata aktivitas enzim protease menggunakan substrat susu skim selama 7 hari yang dipengaruhi oleh ketiga suhu. Aktivitas enzim protease menggunakan substrat susu skim terdapat perbedaan nyata, sehingga dilakukan uji lanjut Duncan untuk melihat perbedaan rata-rata aktivitas enzim yang signifikan setiap harinya. Hasil uji lanjut diperoleh nilai tertinggi pada hari ke-4 dan ke-5 masing-masing sebesar 8,386 dan 9,250.

Hal ini menunjukkan bahwa rata-rata aktivitas enzim protease tertinggi menggunakan substrat susu skim dari ketiga suhu terjadi pada waktu inkubasi hari ke-4 dan ke-5 masing-masing sebesar 8,38 U/mL dan 9,25 U/mL. Pada hari ke-1 dan ke-7 diperoleh nilai terendah masing-masing sebesar 0,000 dan 0,890. Hal ini menunjukkan bahwa rata-rata aktivitas enzim protease terendah menggunakan substrat susu skim dari ketiga suhu dihasilkan pada waktu inkubasi hari ke-1 dan hari ke-7 masing-masing sebesar 0,87 U/mL dan 0 U/mL (Lampiran 13).

Aktivitas enzim protease isolat kapang endofit JE-DP4 menggunakan substrat susu skim pada suhu 30°C hari ke-1 belum dihasilkan enzim protease karena kapang masih dalam fase adaptasi. Aktivitas enzim protease tertinggi menggunakan substrat susu skim pada suhu 30°C terjadi pada hari ke-4 inkubasi sebesar 7,82 U/mL sedangkan aktivitas enzim protease terendah terjadi pada hari ke-2 sebesar 2,26 U/mL. Pada waktu inkubasi berikutnya hingga hari ke-6, aktivitas enzim protease menurun menjadi sebesar 5,70 U/mL. Pada hari ke-7 inkubasi aktivitas enzim protease sudah tidak dihasilkan karena kapang endofit mengalami fase kematian dan substrat protein susu skim telah habis didegradasi oleh kapang (Gambar 9a). Produksi enzim secara bertahap meningkat seiring bertambahnya waktu. Sintesis enzim dimulai pada 24 jam pertama ketika konsumsi nutrisi tinggi. Produksi enzim menurun secara bertahap seiring dengan pertambahan waktu inkubasi karena ketersediaan nutrisi menjadi berkurang yang menyebabkan kondisi tidak menguntungkan bagi kapang dan adanya produksi metabolit toksik (Al-Askar et al., 2014; Khusro, 2016).

Aktivitas enzim protease isolat kapang endofit JE-DP4 menggunakan substrat susu skim pada suhu 37°C hari ke-1 belum dihasilkan enzim protease

karena kapang masih dalam fase adaptasi sehingga belum terjadi peningkatan jumlah biomassa sel kapang. Aktivitas enzim protease tertinggi menggunakan substrat susu skim pada suhu 37°C terjadi pada hari ke-5 sebesar 9,11 U/mL sedangkan aktivitas enzim protease terendah terjadi pada hari ke-2 sebesar 4,95 U/mL (Gambar 9b). Aktivitas enzim protease dihasilkan pada fase eksponensial hingga fase stasioner akhir karena terjadi peningkatan jumlah biomassa miselium dan aktivitas enzim. Substrat protein terdegradasi selama fase eksponensial yang digunakan untuk pertumbuhan kapang (Ilmiah et al., 2018). Sel-sel kapang mulai kekurangan nutrisi pada hari ke-6 inkubasi sehingga menyebabkan aktivitas enzim menurun menjadi sebesar 5,06 U/mL. Penurunan aktivitas enzim disebabkan oleh inaktivasi enzim karena kapang mulai mengalami fase kematian dan substrat protein semakin berkurang. Sel-sel kapang mulai mengalami lisis yang menyebabkan fase kematian pada hari ke-7 inkubasi. Fase kematian terjadi hingga akhir proses fermentasi (Ilmiah et al., 2018).

Pada akhir waktu produksi enzim terjadi penurunan aktivitas enzim disebabkan karena berkurangnya jumlah substrat, yang dapat menghambat pembentukan kompleks enzim-substrat dan perubahan struktur enzim yang menyebabkan penurunan laju reaksi (Ramadhani et al., 2015). Perubahan struktur enzim mengakibatkan sisi aktif enzim mengalami perubahan bentuk sehingga tidak efektif dalam mengikat substrat (Yuniati et al., 2015). Enzim berperan sebagai metabolit primer yang diproduksi pada fase logaritmik dari pertumbuhan

Dalam dokumen AKTIVITAS ENZIM PROTEASE KAPANG ENDOFIT YANG DIISOLASI DARI DAUN TANAMAN PEPAYA (Carica papaya L.) IRMA HERAWATI (Halaman 35-0)