BAB III. METODE PENELITIAN
4.3. Pengaruh Suhu dan Waktu Inkubasi terhadap Aktivitas Protease
Hasil analisis kurva standar tirosin diperoleh persamaan regresi linier y = 9,738x + 0,056 dengan koefisien regresi linier (R2) = 0,9934 (Lampiran 2). Kurva standar tirosin digunakan untuk mengukur konsentrasi tirosin. Pembuatan kurva standar menggunakan larutan standar tirosin karena tirosin merupakan salah satu asam amino hasil produk hidrolisis protein. Menurut Yusriah & Kuswytasari (2013), larutan standar tirosin digunakan untuk mengukur aktivitas enzim protease dalam memecah protein menjadi asam amino penyusunnya.
Konsentrasi tirosin yang dilepaskan pada hidrolisis protein menggunakan substrat media produksi berupa kasein dan susu skim terus meningkat seiring bertambahnya waktu inkubasi (Lampiran 5). Hal ini menunjukkan bahwa aktivitas enzim protease terus meningkat hingga tercapai aktivitas tertinggi pada waktu inkubasi yang paling sesuai. Menurut Ratnayani, Nazib, Sibarani, & Laksmiwati (2018), konsentrasi tirosin yang semakin besar menunjukkan semakin tinggi aktivitas enzim protease yang dihasilkan dan semakin banyak molekul protein yang dipecah menjadi monomer penyusunnya.
Aktivitas enzim protease isolat kapang endofit JE-DP4 diuji pada ketiga suhu, yaitu suhu 30°C, 37°C, dan 44°C pada pH konstan 7,5. Suhu 30°C merupakan suhu optimal untuk pertumbuhan kapang (K. M. Sharma et al., 2017).
Suhu 37°C menjadi suhu yang optimal untuk menghasilkan enzim protease (Ramya & Bharathi, 2015). Suhu 44°C digunakan untuk mengukur aktivitas enzim yang dihasilkan pada suhu tinggi. pH 7,5 diperoleh dari bufer Tris-HCl.
Kisaran pH 7,0-7,5 menjadi kondisi yang baik untuk menjaga kestabilan enzim (Pasaribu, Nurhayati, & Nurilmala, 2018). Menurut K. M. Sharma et al. (2017), pH yang sesuai untuk menghasilkan enzim protease kapang adalah 7,0-7,5. pH memengaruhi kecepatan aktivitas enzim dalam mengkatalisis suatu reaksi (Yusriah & Kuswytasari, 2013). Pengujian aktivitas enzim protease pada ketiga suhu, waktu inkubasi, dan substrat dilakukan untuk meningkatkan produktivitas enzim. Pengaruh ketiga suhu terhadap aktivitas enzim protease isolat kapang endofit JE-DP4 menggunakan substrat kasein dan susu skim selama 7 hari inkubasi dapat dilihat (Gambar 8) dan (Gambar 9).
Gambar 8. Nilai aktivitas enzim protease kapang endofit JE-DP4 pada ketiga suhu menggunakan substrat kasein selama 7 hari inkubasi; a. 30°C, b.
37°C, c. 44°C a
b
c
Berdasarkan analisis statistik Kruskal-Wallis diperoleh nilai Asymp. Sig sebesar 0,037 atau probabilitas di bawah 0,05 (0,037 < 0,05) menunjukkan bahwa terdapat perbedaan signifikan rata-rata aktivitas enzim protease menggunakan substrat kasein dari ketiga suhu terhadap waktu inkubasi selama 7 hari. Aktivitas enzim protease menggunakan substrat kasein terdapat perbedaan nyata, sehingga dilakukan uji lanjut stepwise step-down. Hasil uji lanjut menunjukkan bahwa pada hari ke-7 dan hari ke-2 terdapat perbedaan nilai aktivitas enzim protease yang signifikan. Pada hari ke-7 menunjukkan nilai tertinggi pada kolom subset 2 sebesar 18,333 sedangkan pada hari ke-2 menunjukkan nilai terendah pada kolom subset 1 sebesar 3,000. Hal ini menunjukkan bahwa aktivitas enzim protease tertinggi menggunakan substrat kasein dihasilkan pada hari ke-7 inkubasi dengan rata-rata aktivitas enzim dari ketiga suhu sebesar 28,97 U/mL. Pada hari ke-2 inkubasi menunjukkan rata-rata nilai aktivitas enzim protease terendah dari ketiga suhu sebesar 8,01 U/mL (Lampiran 10).
Aktivitas enzim protease isolat kapang endofit JE-DP4 menggunakan substrat kasein pada suhu 30°C hari ke-1 belum dihasilkan enzim protease karena kapang masih dalam fase adaptasi. Aktivitas enzim protease tertinggi menggunakan substrat kasein pada suhu 30°C terjadi pada hari ke-7 sebesar 25,37 U/mL sedangkan aktivitas enzim protease terendah terjadi pada hari ke-2 sebesar 7,20 U/mL (Gambar 8a). Aktivitas enzim protease isolat kapang endofit JE-DP4 terus meningkat dari hari ke-1 hingga hari ke-7 inkubasi, yaitu sebesar 7,20 U/mL hingga 25,37 U/mL. Produksi enzim protease tertinggi isolat kapang endofit JE-DP4 menggunakan substrat kasein dihasilkan pada hari ke-7 inkubasi sebesar 25,37 U/mL. Waktu inkubasi menjadi parameter aktivitas metabolisme dan pertumbuhan kapang. Waktu inkubasi di atas waktu optimal akan menyebabkan penurunan tingkat pertumbuhan dan produktivitas enzim karena berkurangnya nutrisi dalam media fermentasi. Kekurangan nutrisi menyebabkan kondisi stres dan tidak menguntungkan bagi mikroorganisme sehingga terjadi penurunan aktivitas enzim (Khusro, 2016).
Muthulakshmi et al. (2011), melaporkan dalam penelitiannya produksi enzim protease tertinggi oleh Aspergillus flavus sebesar 49,30 U/mL membutuhkan waktu inkubasi hingga hari ke-7. Pada hari ke-8 terjadi penurunan
aktivitas enzim menjadi sebesar 40 U/mL. Oleh karena itu, waktu inkubasi untuk mengukur aktivitas enzim protease isolat kapang endofit JE-DP4 dilakukan hingga hari ke-7. Al-Askar, Abdulkhair, & Rashad (2014), melaporkan bahwa aktivitas enzim protease oleh Fusarium solani dari hari pertama inkubasi secara bertahap meningkat dan mencapai aktivitas enzim tertinggi pada hari ke-7. Enzim protease diproduksi dalam jumlah tinggi pada fase pertumbuhan eksponensial hingga fase stasioner (Ilmiah, Mubarik, & Wahyuntari, 2018).
Aktivitas enzim protease tertinggi isolat kapang endofit JE-DP4 menggunakan substrat kasein pada suhu 37°C sebesar 46,72 U/mL sedangkan aktivitas enzim protease terendah sebesar 8,92 U/mL (Gambar 8b). Aktivitas enzim protease pada suhu 37°C hari ke-1 inkubasi nilainya tinggi sebesar 46,72 U/mL. Waktu inkubasi berikutnya nilai aktivitas enzim protease meningkat secara bertahap hingga hari ke-7, yaitu sebesar 8,92 U/mL hingga 28,64 U/mL. Menurut Yuniati et al. (2015), aktivitas enzim protease yang tinggi pada waktu awal produksi karena masih tersedianya banyak nutrisi yang diperlukan oleh kapang untuk melakukan metabolisme sel dan suhu 37°C merupakan suhu optimal dihasilkannya enzim protease. Suhu mempunyai 2 mekanisme berlawanan dalam memengaruhi aktivitas enzim, yaitu aktivasi dan denaturasi. Aktivasi akan meningkatkan laju reaksi seiring dengan kenaikan suhu. Denaturasi mengakibatkan pembukaan struktur kuartener dan tersier enzim karena suhu tinggi (Vitolo, 2015).
Rata-rata aktivitas enzim protease tertinggi isolat kapang endofit JE-DP4 menggunakan substrat kasein dihasilkan pada suhu 37°C sebesar 22,64 U/mL karena pada suhu 30°C rata-rata aktivitas enzim protease yang dihasilkan sebesar 14,74 U/mL dan suhu 44°C sebesar 20,96 U/mL. Menurut Ramya & Bharathi (2015), suhu yang optimal untuk menghasilkan aktivitas enzim protease tertinggi adalah suhu 37°C. Aktivitas enzim meningkat seiring bertambahnya suhu hingga tercapai suhu optimal. Setiap enzim memiliki suhu optimal untuk menghasilkan aktivitas enzim tertinggi (Sayem, Alam, & Hoq, 2006). Kenaikan suhu menyebabkan aktivitas enzim meningkat karena terjadi peningkatan energi kinetik yang mempercepat gerak vibrasi, translasi, dan rotasi enzim maupun substrat. Hal ini dapat menambah intensitas tumbukan antara enzim dan substrat. Intensitas
tumbukan yang bertambah akan memudahkan dalam membentuk kompleks enzim dengan substrat sehingga produk yang terbentuk akan semakin banyak (Noviyanti et al., 2013).
Peningkatan suhu di atas suhu optimal akan menurunkan laju reaksi enzim sehingga aktivitas enzim akan menurun. Aktivitas enzim menurun terjadi karena perubahan konformasi enzim yang menyebabkan ikatan-ikatan kovalen dalam mempertahankan struktur enzim terputus, sehingga gugus aktif enzim mengalami kerusakan (Kusumadjaja & Dewi, 2005; Fathimah & Wardani, 2014).
Peningkatan energi termal molekul yang membentuk struktur protein enzim menyebabkan rusaknya interaksi-interaksi non kovalen yang menjaga struktur 3 dimensi enzim secara bersama-sama sehingga enzim mengalami denaturasi.
Interaksi-interaksi non kovalen terdiri atas ikatan hidrogen, ikatan van der walls, ikatan hidrofobik, dan interaksi elektrostatik. Struktur lipatan enzim membuka pada bagian permukaannya akibat denaturasi sehingga menyebabkan terjadinya penurunan aktivitas enzim (Baehaki et al., 2011).
Aktivitas enzim protease tertinggi isolat kapang endofit JE-DP4 menggunakan substrat kasein pada suhu 44°C terjadi pada hari ke-7 sebesar 32,90 U/mL sedangkan aktivitas enzim protease terendah terjadi pada hari ke-2 sebesar 7,92 U/mL (Gambar 8c). Aktivitas enzim protease isolat kapang endofit JE-DP4 menggunakan substrat kasein pada suhu 44°C terus meningkat hingga hari ke-7 inkubasi dari sebesar 7,92 U/mL hingga 32,90 U/mL. Siala et al. (2009), melaporkan dalam penelitiannya aktivitas enzim protease yang dihasilkan oleh Aspergillus niger menggunakan substrat kasein sebesar 94,240 U/mL. Nilai aktivitas enzim protease kapang endofit tersebut sebesar 94,240 U/mL lebih tinggi dibandingkan aktivitas enzim protease yang dihasilkan oleh isolat kapang endofit JE-DP4 sebesar 46,72 U/mL. Menurut Choliq (2008), kemampuan kapang dalam menghasilkan enzim protease yang tinggi dipengaruhi oleh perbedaan variasi gen penyandi protease setiap jenis dan strain kapang.
Gambar 9. Nilai aktivitas enzim protease kapang endofit JE-DP4 pada ketiga suhu menggunakan substrat susu skim selama 7 hari inkubasi; a. 30°C, b.
37°C, c. 44°C a
b
c
7
Berdasarkan hasil analisis variansi satu jalur diperoleh nilai probabilitas pada kolom signifikansi sebesar 0,000 atau probabilitas di bawah 0,05 (0,000 <
0,05) yang menunjukkan bahwa terdapat perbedaan nyata rata-rata aktivitas enzim protease menggunakan substrat susu skim selama 7 hari yang dipengaruhi oleh ketiga suhu. Aktivitas enzim protease menggunakan substrat susu skim terdapat perbedaan nyata, sehingga dilakukan uji lanjut Duncan untuk melihat perbedaan rata-rata aktivitas enzim yang signifikan setiap harinya. Hasil uji lanjut diperoleh nilai tertinggi pada hari ke-4 dan ke-5 masing-masing sebesar 8,386 dan 9,250.
Hal ini menunjukkan bahwa rata-rata aktivitas enzim protease tertinggi menggunakan substrat susu skim dari ketiga suhu terjadi pada waktu inkubasi hari ke-4 dan ke-5 masing-masing sebesar 8,38 U/mL dan 9,25 U/mL. Pada hari ke-1 dan ke-7 diperoleh nilai terendah masing-masing sebesar 0,000 dan 0,890. Hal ini menunjukkan bahwa rata-rata aktivitas enzim protease terendah menggunakan substrat susu skim dari ketiga suhu dihasilkan pada waktu inkubasi hari ke-1 dan hari ke-7 masing-masing sebesar 0,87 U/mL dan 0 U/mL (Lampiran 13).
Aktivitas enzim protease isolat kapang endofit JE-DP4 menggunakan substrat susu skim pada suhu 30°C hari ke-1 belum dihasilkan enzim protease karena kapang masih dalam fase adaptasi. Aktivitas enzim protease tertinggi menggunakan substrat susu skim pada suhu 30°C terjadi pada hari ke-4 inkubasi sebesar 7,82 U/mL sedangkan aktivitas enzim protease terendah terjadi pada hari ke-2 sebesar 2,26 U/mL. Pada waktu inkubasi berikutnya hingga hari ke-6, aktivitas enzim protease menurun menjadi sebesar 5,70 U/mL. Pada hari ke-7 inkubasi aktivitas enzim protease sudah tidak dihasilkan karena kapang endofit mengalami fase kematian dan substrat protein susu skim telah habis didegradasi oleh kapang (Gambar 9a). Produksi enzim secara bertahap meningkat seiring bertambahnya waktu. Sintesis enzim dimulai pada 24 jam pertama ketika konsumsi nutrisi tinggi. Produksi enzim menurun secara bertahap seiring dengan pertambahan waktu inkubasi karena ketersediaan nutrisi menjadi berkurang yang menyebabkan kondisi tidak menguntungkan bagi kapang dan adanya produksi metabolit toksik (Al-Askar et al., 2014; Khusro, 2016).
Aktivitas enzim protease isolat kapang endofit JE-DP4 menggunakan substrat susu skim pada suhu 37°C hari ke-1 belum dihasilkan enzim protease
karena kapang masih dalam fase adaptasi sehingga belum terjadi peningkatan jumlah biomassa sel kapang. Aktivitas enzim protease tertinggi menggunakan substrat susu skim pada suhu 37°C terjadi pada hari ke-5 sebesar 9,11 U/mL sedangkan aktivitas enzim protease terendah terjadi pada hari ke-2 sebesar 4,95 U/mL (Gambar 9b). Aktivitas enzim protease dihasilkan pada fase eksponensial hingga fase stasioner akhir karena terjadi peningkatan jumlah biomassa miselium dan aktivitas enzim. Substrat protein terdegradasi selama fase eksponensial yang digunakan untuk pertumbuhan kapang (Ilmiah et al., 2018). Sel-sel kapang mulai kekurangan nutrisi pada hari ke-6 inkubasi sehingga menyebabkan aktivitas enzim menurun menjadi sebesar 5,06 U/mL. Penurunan aktivitas enzim disebabkan oleh inaktivasi enzim karena kapang mulai mengalami fase kematian dan substrat protein semakin berkurang. Sel-sel kapang mulai mengalami lisis yang menyebabkan fase kematian pada hari ke-7 inkubasi. Fase kematian terjadi hingga akhir proses fermentasi (Ilmiah et al., 2018).
Pada akhir waktu produksi enzim terjadi penurunan aktivitas enzim disebabkan karena berkurangnya jumlah substrat, yang dapat menghambat pembentukan kompleks enzim-substrat dan perubahan struktur enzim yang menyebabkan penurunan laju reaksi (Ramadhani et al., 2015). Perubahan struktur enzim mengakibatkan sisi aktif enzim mengalami perubahan bentuk sehingga tidak efektif dalam mengikat substrat (Yuniati et al., 2015). Enzim berperan sebagai metabolit primer yang diproduksi pada fase logaritmik dari pertumbuhan kapang untuk memanfaatkan nutrisi (protein) yang ada dalam media (Sumantha et al., 2006).
Aktivitas enzim protease tertinggi isolat kapang endofit JE-DP4 menggunakan substrat susu skim pada suhu 44°C terjadi pada hari ke-5 sebesar 11,30 U/mL sedangkan aktivitas enzim protease terendah terjadi pada hari ke-1 sebesar 2,62 U/mL. Pada hari ke-6 inkubasi aktivitas enzim mengalami penurunan menjadi sebesar 8,43 U/mL (Gambar 9c). Pada hari ke-7 inkubasi aktivitas enzim protease sudah tidak dihasilkan karena kapang sudah mengalami fase kematian.
Agrawal et al. (2016), melaporkan dalam penelitiannya aktivitas enzim protease yang dihasilkan oleh kapang endofit Alternaria alternata menggunakan substrat susu skim sebesar 53 U/mL. Nilai aktivitas enzim protease kapang endofit
Alternaria alternata menggunakan substrat susu skim sebesar 53 U/mL lebih tinggi dibandingkan aktivitas enzim protease yang dihasilkan oleh isolat kapang endofit JE-DP4 sebesar 11,30 U/mL. Aktivitas enzim yang rendah disebabkan karena rendahnya energi aktivasi yang tersedia. Energi aktivasi dibutuhkan untuk menciptakan kondisi tingkat kompleks aktif, baik molekul enzim dan molekul substrat. Peningkatan energi molekul substrat akan meningkatkan laju reaksi enzim (Noviyanti et al., 2013).
Rata-rata aktivitas enzim protease isolat kapang endofit JE-DP4 menggunakan substrat susu skim pada suhu 30°C sebesar 4,085 U/mL, suhu 37°C sebesar 4,792 U/mL, dan suhu 44°C sebesar 6,197 U/mL. Rata-rata aktivitas enzim protease tertinggi isolat kapang endofit JE-DP4 menggunakan substrat susu skim diperoleh pada suhu 44°C sebesar 6,197 U/mL. Produksi enzim protease tertinggi menggunakan substrat susu skim terjadi pada suhu 44°C. Hal ini menunjukkan bahwa enzim protease yang dihasilkan oleh isolat kapang endofit JE-DP4 dapat mentolerir suhu yang tinggi sehingga dapat diaplikasikan untuk proses produksi industri enzim yang menggunakan suhu tinggi. Pada umumnya mikroorganisme memiliki aktivitas enzim tertinggi pada suhu tertentu. Aktivitas enzim semakin meningkat dengan bertambahnya suhu hingga tercapai suhu optimal (Zaferanloo et al., 2014). Kenaikan suhu di atas suhu optimal akan menyebabkan aktivitas enzim menurun (Baehaki, Suhartono, Palupi, & Nurhayati, 2008).
