Phalaenopsis x Renanthera Phalaenopsis x Vandopsis
BAHAN DAN METODE Induksi varian dengan iradiasi sinar gamma
Kalus klon SGN–PV2.11, 377 dan 642 hasil inisiasi in vitro masing-masing sebanyak 80 berukuran kira-kira satu sentimeter, diletakkan di dalam 80 botol kultur
jaringan. Iradiasi dilakukan di Pusat Pelelitian dan Pengembangan Teknologi Isotop dan Radiasi, Badan Tenaga Nuklir Nasional, Pasar Jum’at Jakarta, dengan menggunakan sinar Gamma dari ionisasi Cobalt60 melalui alat irradiator gamma chamber 4000A tipe Irpasena, dengan satu seri dosis akut yaitu 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 Gy. Iradiasi dilakukan setiap dosis masing-masing 10 botol. Setelah diradiasi, kalus segera dikeluarkan dan dipindahkan pada media regenerasi yang mengandung zat pengatur tumbuh serta diinkubasikan di ruang terang bersuhu 25 °C.
Pengamatan pada kalus dilakukan mulai satu minggu setelah iradiasi. Pengamatan dilakukan pada jumlah kematian kalus yang telah diradiasi tersebut untuk menentukan LD50. LD50 ditentukan dengan cara menghitung dosis yang menyebabkan 50% kalus mati dengan menggunakan program CurveFit 1.3. Setelah diperoleh LD50 dari percobaan tersebut di atas, dilakukan kembali iradiasi dengan dosis sesuai LD50 tersebut. Untuk mendapatkan varian somaklonal diradiasi kalus dengan dosis 0; 2,5; 5; 10; 15 dan 20 Gy. Pengamatan dilakukan terhadap persentase kalus yang bertahan hidup, jumlah kalus yang mampu beregenerasi menjadi tanaman Daya regenerasi tanaman pasca iradiasi sinar gamma
Kalus klon SGN-PV2, 642 dan 377 yang hidup setelah iradiasi sinar gamma dosis 0, 2.5G ; 5G; 10 G; 15 G (SGN-PV2.11), 15 G (642) dan 20 G (377) diregenerasikan pada media regenerasi MR yaitu ½ MS yang diberi tambahan BAP 0,4 mg.l-1, 2,4-D 0,2 mg.l-1 serta 75 ml.l-1 air kelapa dan pepton 2 g.l-1. Selanjutnya plantlet diperbesar pada media MR1 yang mengandung BAP 0.5 mg.l-1 dan 2 g.l-1 pepton. Perlakuan diaplikasikan pada setiap klon berjumlah 15 botol, masing-masing botol berisi 1 gerombol kalus. Pengamatan dilakukan terhadap persentase kalus mampu membentuk plantlet, dan jumlah plantlet.
Pembentukan generasi M1V4 melalui embriogenesis langsung
Varian-varian klon SGN-PV2.11, 642 dan 377 yang diperoleh dari induksi variasi somaklonal menggunakan iradiasi dimultiplikasikan dengan cara menanam irisan daun masing-masing varian pada media organogenesis. Irisan daun plantlet tersebut ditanam pada beberapa media antara lain ELl (1/2 MS + 0,2 mg.l-1 TDZ + 1 mg.l-1 IAA), EL2 (1/2 MS + 0,2 mg.1-1 TDZ + 0,2 mg.l-1 IAA), EL3 (1/2 MS + 3,5 mg.1-1 TDZ + 1 mg.l-1 IAA). Plb yang diperoleh dari eksplan daun, diperbanyak dalam 3 kali subkultur sebelum akhirnya diregenerasikan menjadi plantlet.
Multiplikasi dilakukan sebanyak paling sedikit 4 kali atau hingga diperoleh M1V4 bertujuan agar diperoleh mutan yang benar-benar solid, karena dengan proses multiplikasi tersebut akan terjadi proses seleksi diplontik. Media MR digunakan untuk meregenerasikan plb menjadi plantlet.
Keragaman fenotipik plantlet akibat iradiasi sinar gamma
Plantlet hasil regenerasi M1V4 diamati berdasarkan perbedaan morfologi dengan tanaman standar mengenai karakter kualitatif seperti warna dan bentuk daun serta analisis pita isoenzim. Selain itu karakter kuantitatif secara agronomi mengenai pertumbuhan plantlet seperti jumlah daun, panjang dan lebar daun, jumlah akar, panjang akar dan diameter akar yang diamati setelah 16 MST.
Analisis isoenzim diawali dahulu dengan identifikasi enzim-enzim spesifik yang dapat terdeteksi pada varian somaklonal. Kemudian setelah diketahui beberapa enzim spesifik tanaman tersebut, varian tahan dideteksi menggunakan enzim spesifik tersebut, untuk mencirikan mutan yang diperoleh. Analisis isoenzim dilakukan menggunakan elektrophoresis gel starch dengan metode Solties (1992). Beberapa tahapan yang harus dilakukan adalah pembuatan larutan buffer pengekstrak yang dilakukan dengan mencampur larutan l0 mM L-ascorbat 0,07 gram, 40 mM L-sistein 0.1939 gram, Triton X-100 0.12 ml, PVP-40 sebanyak 0,25 gram dan 0.1M Na2HPO4. 2H20 dan ditambahkan akuades sampai 100 ml pada pH 7,0. Pembuatan larutan buffer gel yang terdiri dari 5mM L-Histidin monohidrat 1,040 gram yang dilarutkan dalam akuades sampai volume dengan pH 6.0. Pembuatan larutan buffer elektroda, 50 mM asam sitrat monohidrat 10.55 gram dan 150 mM tris hidroksimetil aminometan 18.16 gram dilarutkan dalam akuades sampai dengan pH 6.0. Selanjutnya pembuatan gel pati, pati dicampur dengan sepertiga bagian buffer gel dan dua pertiga bagian lagi dimasak lebih dahulu hingga mendidih. Setelah matang diangkat lalu dicampurkan dengan campuran pati, kemudian dimasak lagi hingga kelihatan bening. Selanjutnya divakum hingga gelembung udara dalam gel habis. Gel secepatnya dituang pada cetakan yang sebelumnya telah diolesi parafin cair dan lubang pada kaki cetakan ditutup dengan perekat. Setelah gel dingin, ditutup dengan plastik yang telah diolesi dengan parafin. Gel bisa disimpan pada suhu 5-10 °C. Pelaksanaan analisis isoenzim dilakukan pada daun segar dari sampel yang digunakan sebanyak 100-200 mg, dihaluskan dengan terlebih dahulu memberikan buffer ekstrak sebanyak 0.5 ml, lalu digerus hingga halus. Cairan daun gerusan
diserap dengan kertas saring yang telah dipotong secukupnya, Selanjutnya kertas yang telah menyerap sel daun tersebut disisipkan pada gel yang telah dilubangi. Cetakan yang telah disisipkan kertas saring yang berisi contoh cairan daun dimasukkan dalam kotak plastik yang berisi buffer elektroda. Kaki cetakan hams terendam dalam buffer elektroda lalu diletakkan dalam ruangan es pada suhu 5-10 °C. Selanjutnya dialiri listrik 100 Volt 30 menit dan dilanjutkan 3-4 jam pada 150 Volt. Untuk mengontrol karak migrasi molekul, disalah satu sisinya diberi penanda Bromofenol blue. Setelah selesai pengaliran listrik, gel dibelah menjadi dua atau tiga (sesuai ketebalannya) pada posisi horisontal di atas alat pemotong. Sebelumnya kertas saring dikeluarkan dari lubang-lubangnya. Lembaran gel dimasukkan ke dalam nampan kemudian diberi pewarna yang masing-masing telah disiapkan. Setelah itu kotak plastik ditutup dengan aluminium foil dan diinkubasi pada suhu ruang sampai muncul pita-pita pada gel. Perendaman ini dilakukan 1-2 jam tergantung jenis enzim. Gel dicuci dengan air mengalir sampai bersih, kemudian potongan gel yang telah terlihat pita-pitanya dapat difiksasi dengan 50% etanol yaitu etanol: akuades: asam asetat:gliserol = 5:4:2:1. Pengamatan segera dilakukan setelah pencucian dan hasilnya dapat diabadikan dengan kamera.