Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Agromikrobiologi, Laboratorium Balai Pengkajian Bioteknologi BPPT Serpong dari bulan Maret - Desember 2007. Kandungan hara dari sampel tanah dianalisis di Balai Penelitian Tanah, Badan Litbang Pertanian, Kementerian Pertanian Bogor.
Bahan dan Alat yang Digunakan
Bahan-bahan yang digunakan, larutan chloramine T 2% dalam akuades, media nutrient agar (NA), tryptic soy agar (TSA), pseudomonas agar, akuades
steril, alkohol 95%, H2O2 3%, larutan gula 75%, tanaman inang Pueraria
javanica(kacang ruji).
Alat yang digunakan adalah plastik klip, zeolit ukuran 2-3 mm, gelas plastik, saringan bertingkat (125 m, 106 m dan 50 m), autoklaf, gelas erlenmeyer, cawan Petri, tabung reaksi, jarum ose, kertas saring, kertas cakram, pinset, timbangan analitik, laminar air flow, sentrifus dan inkubator.
Pelaksanaan Penelitian
Eksplorasi dan Isolasi FMA dari Rizosfir Kelapa Sawit.
Eksplorasi dan isolasi Fungi Mikoriza Arbuskular dan bakteri
endosimbiotik mikoriza dilakukan pada tanggal 27 Maret 2007 di kebun percobaan Aek Pancur milik Pusat Penelitian Kelapa Sawit Medan yang terkena
serangan berat Ganoderma dengan metoda yang dikembangkan oleh Sieverding
(1991). Sampel tanah diambil dari tanaman kelapa sawit yang masih terlihat sehat
di daerah yang terkena serangan berat Ganoderma. Sampel tanah diambil dengan
membersihkan vegetasi yang terdapat di atasnya seperti rumput-rumputan. Pengambilan sampel tanah dilakukan pada masing-masing varietas yaitu Pisifera (tahun tanam 1981), Tenera (tahun tanam 1986), Dura Dumpy (tahun tanam 1986) dan Deli Dura (tahun tanam 1993), dengan populasi masing-masing 4 pohon yang dipilih secara acak dan pada masing-masing pohon dibuat dua titik yang saling berseberangan dengan jarak yang sama dari pohon kelapa sawit (di bawah ujung tajuk) untuk memperoleh contoh tanah yang mewakili, yang tiap titik banyaknya 500 gram, sehingga pada tiap tanaman diperoleh 2 sampel tanah dengan berat masing-masing 500 g. Pengambilan contoh tanah dilakukan dengan mengambil tanah sampai dengan kedalaman 10-15 cm dan akar muda terambil. Kondisi piringan sekeliling pohon kelapa sawit pada saat pengambilan sampel bersih dari gulma maupun tanaman penutup. Sampel tanah dimasukkan ke dalam kantung plastik klip, diberi identitas, tanggal eksplorasi dan lokasi pengambilan.
Isolasi Fungi Mikoriza Arbuskular, Trappingdan Perbanyakan Inokulum. Terhadap sampel tanah yang diperoleh dilakukan isolasi spora FMA secara langsung untuk identifikasi jenis FMA dan mendapatkan spora FMA dari
masing-37
masing varietas kelapa sawit untuk isolasi bakteri endosimbiotik mikoriza. Sementara untuk mendapatkan jumlah spora FMA yang akan diinokulasikan pada
bibit kelapa sawit dilakukan trappingatau pemerangkapan spora. Teknik trapping
yang digunakan mengikuti metode Brundrett et al. (1994). Sebagai tanaman
inang digunakan Pueraria javanica. Bibit P. javanica disemaikan pada baki
yang berisi media zeolit steril. Sebelum disemai, bibit P. javanica disterilkan
dengan menggunakan alkohol 95% selama 10 detik dan direndam dengan H2O2
3% selama 3 menit kemudian dibilas dengan air steril sebanyak 5 kali. Persemaian dilakukan 3-4 hari sebelum trapping. Bibit tanaman yang dipilih adalah yang mempunyai panjang ± 5 cm dengan pertumbuhan akar muda bagus.
Media pembawa (carrier) yang digunakan adalah zeolit. Zeolit dicuci bersih
dengan air mengalir, ditiriskan, dimasukkan ke dalam karung dan disterilkan
dengan autoklaf dengan suhu121 oC, tekanan 1 atm selama 20 menit.
Zeolit steril dimasukkan ke dalam sepertiga bagian pot dan kemudian
ditambahkan sampel tanah yang hendak di trapping sepertiga bagian pot dan
ditutup kembali dengan zeolit steril. Bibit P. javanica yang sehat diletakkan ke dalam pot, usahakan agar akar bersentuhan dengan sampel tanah dan kemudian ditutup kembali dengan zeolit steril. Identitas dan keterangan yang jelas
ditempelkan pada pot berupa asal tanah, tanggal trapping dan jenis tanaman inang.
Tanaman dipelihara di rumah kaca sampai selama 3 bulan. Tanaman disiram setiap hari dan diberi hara dengan kadar fosfor (P) rendah (Hyponex merah dengan komposisi N:P:K = 25%:5%:20%) seminggu sekali. Setelah 3 bulan dilakukan perbanyakan spora dengan membuat kultur pot spora campuran (komposit) dengan tanaman inang sorghum untuk mendapatkan jumlah inokulum yang sesuai untuk pengujian potensi komposit FMA dalam menginduksi
ketahanan kelapa sawit terhadap cekaman biotik G. boninense.
Identifikasi Spora Fungi Mikoriza Arbuskular
Identifikasi spora FMA dilakukan dengan metode Brundrett et al. (1994).
Pembuatan preparat spora menggunakan bahan pengawet polyvinyl
alcohol-lacto-glycerol (PVLG) dan bahan pewarna Melzer’s yang diletakkan secara terpisah bersisian pada satu kaca preparat. Spora-spora hasil isolasi dari rizosfir kelapa sawit setelah dihitung jumlahnya, diletakkan dalam larutan PVLG dan kemudian
dipindahkan ke dalam larutan pewarna Melzer’s. Selanjutnya spora-spora dipecahkan secara hati-hati dengan cara menekan kaca penutup preparat menggunakan ujung pinset dan diamati morfologi dari spora-spora. Perubahan warna spora dalam Melzer’s adalah salah satu indikator menentukan tipe spora.
Isolasi Bakteri Endosimbiotik Mikoriza dari Spora FMA.
Untuk mendapatkan bakteri yang berasosiasi dengan FMA dilakukan ekstraksi spora FMA dari tanah dengan menggunakan metode tuang saring basah (Gardemann & Nicolson 1963; Brundrett et al.1994).
Sampel tanah ditimbang sebanyak 100 g dan dimasukkan ke dalam gelas beker 500 ml. Tambahkan air sampai setengahnya, dikocok dan dilakukan penyaringan bertingkat dengan menggunakan saringan 125 m, 106 m dan 50
m. Penyaringan diulangi sampai air tidak berwarna keruh lagi. Isi pada saringan 50 m kemudian dipindahkan ke dalam tabung sentrifus 50 ml dan tambahkan air dan ditimbang untuk menyeimbangkan berat. Kemudian disentrifus pada kecepatan 5000 rpm selama 5 menit untuk memisahkan tanah dari kotoran. Supernatan dibuang, kemudian ditambahkan air kembali sampai setengah volume dan ditambahkan larutan 75% gula sampai penuh, dikocok dan disentrifus kembali pada 6000 rpm selama 20 detik. Spora dikumpulkan dengan menuangkan supernatan ke dalam saringan 106 m, dicuci dengan air untuk menghilangkan larutan gula dan spora dipindahkan ke dalam botol vial, ditambahkan air diinokulasikan pada kecambah kelapa sawit. Untuk isolasi bakteri endosimbiotik mikoriza dari spora FMA digunakan metode yang dikembangkan oleh Reimann (2005). Di dalam cawan Petri spora disterilisasi dengan larutan 2% Chloramine-T selama 15 menit. Setelah itu spora dipindahkan lagi ke dalam cawan Petri steril dan dicuci dengan air steril dengan menggunakan pipet steril untuk menghilangkan larutan Chloramine-T. Spora kemudian dipindahkan ke kertas saring steril dan biarkan kering. Kemudian dengan menggunakan jarum steril yang terlebih dahulu dicelupkan ke dalam air steril spora, dipecahkan di atas kaca preparat dan dipindahkan satu persatu ke dalam cawan Petri yang mengandung media agar, kemudian ditumbuhkan selama 2 hari di dalam inkubator dengan suhu 28 oC. Media agar yang digunakan adalah nutrient agar(NA) dengan konsentrasi
39
1x, 10x, 100x, media tryptic soy agar (TSA) dengan konsentrasi 1x, 10x, 100x
dan media pseudomonas agar base (PAB) konsentrasi 1x. Bakteri yang tumbuh
kemudian dimurnikan dengan transfer koloni dengan metode goresan cawan Petri. Isolat bakteri yang sudah murni dipindahkan ke dalam agar miring dan disimpan
pada suhu 4oC sampai akan digunakan. Pada saat akan digunakan terlebih dahulu
dibuat inokulum cair bakteri dengan menumbuhkan isolat pada media nutrient
broth, tryptic soy broth dan pseudomonas cair dalam gelas erlenmeyer dan
diletakkan dalam shaker selama 48 jam pada suhu 28 oC.
Identifikasi Bakteri Endosimbiotik Mikoriza Berdasarkan 16S rDNA.
Bakteri endosimbiotik mikoriza yang diperoleh kemudian diidentifikasi
berdasarkan 16S rDNA (Gabor et al. 2003).
Ekstraksi DNA. Total DNA bakteri diekstraksi menggunakan Instagene Matrix Kit
(Biorad). Koloni bakteri yang berumur satu hari pada agar miring ditambahkan dengan 1,0 mL air steril untuk mendapatkan suspensi bakteri. Suspensi bakteri dipindahkan ke tabung eppendorf 1,5 mL, tambahkan air steril dan disentrifugasi pada 10 000 × g selama 1 menit. Supernatannya dibuang dan pelet dilarutkan
dengan 200 L Instagene Matrix. Suspensi bakteri diinkubasi pada 56 C selama
15-30 menit pada heat block, divorteks dengan kecepatan tinggi selama 10 detik
dan diletakkan kembali pada heat block, kemudian diinkubasi pada 100 C selama
8 menit, di vorteks kembali dengan kecepatan tinggi selama 10 detik, kemudian
repelleteddi 10 000 × g selama 2-3 detik. Supernatan yang berisi DNA disimpan
pada -20oC.
Polymerase Chain Reaction. Lima L template DNA dicampur dengan 45 L
larutan PCR yang terdiri dari: 5 L MgCl2 25 mM, 4 L campuran dNTP 2,5
mM, 5 L PCR buffer 10x, 0,25 L LA tag, 2 L Primer 8F 10 M, 2 L Primer
1492 R 10 M dan 26,75 L ddH2O sehingga volume total reaksi 50 L.
Amplifikasi dari sintesis peptida dilakukan menggunakan primer universal 8F (5
'GGTTACCTTGTTACGACTT 3') dan 1492R (5
'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3') dari AlphaDNA (Canada). Reaksi PCR dilakukan sebagai berikut: denaturasi awal pada 96 C selama 3 menit dan 30
siklus yang terdiri dari denaturasi pada 96 C selama 45 detik, annealing pada 56
C selama 30 detik, dan elongasi pada 72 C selama 2 menit. Reaksi ini
diselesaikan dengan final extension pada 72 C selama 7 menit. Produk PCR
dianalisis dengan elektroforesis dalam gel agarose 0,8% (b/v) dengan running
buffer TAE 1x pada 100 V selama 30 menit. Gel divisualisasikan di bawah iluminator UV dan pita DNA yang muncul dipotong dan dimurnikan dengan menggunakan Gene Aid Kit.
Sekuensing DNA. Primer yang digunakan untuk siklus sekensing adalah 765R (5
'CTGTTTGCTCCCCACGTTTC 3') dan 1141R (5 'GGGTTGCGCTCGTTGC 3') dari AlphaDNA (Canada). Larutan solusi siklus sekuensing terdiri dari: 2 L 5x
buffer sequencing, 2 L primer campuran (765 R dan 1141R), 4 L big dye V3.1,
4 L template DNA dan 8 L H2O dengan volume reaksi akhir campuran 20 L.
Urutan siklus dilakukan sebagai berikut: denaturasi awal pada 96 C selama 3 menit, 25 siklus reaksi yang terdiri dari denaturasi pada 96 C selama 1 menit, annealing pada 55 C selama 1 menit, dan elongasi pada 60 C selama 2 menit
sebelum pendinginan reaksi pada 4 C. DNA yang dihasilkan dari siklus
sekuensing terlebih dahulu dimurnikan dengan presipitasi DNA menggunakan etanol, natrium asetat, dan EDTA diikuti dengan sentrifugasi dan pelet yang terbentuk dibilas dengan etanol 70%. Pelet DNA dilarutkan kembali dengan 12
L ddH2O dan urutan DNA dibaca dengan menggunakan Genetic Analyzer 3130
(Applied Biosystems, USA). Contigs DNA dirakit menggunakan program ATGC yang menghubungkan primer 765R dan 1141R. Sekuen yang dihasilkan dibandingkan dengan sekuens DNA yang tersedia di database GenBank dari NCBI dengan menggunakan program BLAST.
Konstruksi Pohon filogenetik. Alignment urutan16S rDNA dilakukan dengan
menggunakan program Clustal X. Pohon filogenetik dibangun dengan
membandingkan urutan 16S rDNA kedua puluh bakteri endosimbiotik mikoriza hasil isolasi dengan urutan 16S rDNA dua puluh bakteri dari database DNA GeneBank dan divisualisasikan menggunakan Program Tree View 1.6.6.
Hubungan filogenetik diperoleh dengan analisis neighbor-joining dikombinasikan
41