Abstrak
Di daerah mikorizosfir ditemukan berbagai helper bakteri yang dapat menghasilkan senyawa yang bekerja sinergis dengan FMA dalam menghambat pertumbuhan patogen Ganoderma boninense. Penelitian terdahulu menemukan bakteri B10 (Bacillus subtilis B10) memiliki kemampuan menghambat pertumbuhan G. boninense, selanjutnya tujuan penelitian ini adalah mendapatkan dan mengidentifikasi senyawa yang dihasilkan oleh bakteri Bacillus subtilis B10
yang memiliki kemampuan menghambat pertumbuhan G. boninense dan
sekaligus mempercepat proses perkecambahan spora FMA. Hasil penelitian menunjukkan bahwa bakteri Bacillus subtilis B10 menghasilkan senyawa intra seluler yang memiliki aktivitas menghambat pertumbuhanGanoderma boninense. Ekstraksi menggunakan pelarut organik menunjukkan senyawa tersebut memiliki aktivitas penghambatan terhadap G. boninensepada fraksi etil asetat yang artinya senyawa tersebut bersifat semi polar. Hasil analisis menggunakan Liquid Chromatography–Mass Spectrometer (LC-MS) menunjukkan senyawa aktif tersebut memiliki bobot molekul 255,39 g/mol. Hasil analisis spektroskopi dengan
1H-NMR menunjukkan senyawa tersebut memiliki rumus molekul C12H17NO5, dan dipostulasikan sebagai 2-(4-aminophenoxy)-6-methyl-tetrahydro-2H-pyran-3,4,5-triol. Senyawa tetrahydro pyran dikenal memiliki aktivitas sebagai antifungi. Kata kunci: bakteri endosimbiotik mikoriza, senyawa aktif, ekstraksi, identifikasi senyawa
Abstract
In the area of mycorrhizosphere found a variety of helper bacteria that can produce substrates or compounds that work synergistically with the arbuscular mycorrhiza fungi (AMF) in inhibiting the growth of pathogen Ganoderma boninense. Our previous research found that B10 bacteria (Bacillus subtilis B10) have the ability to inhibit the growth of G. boninense. Thus the purpose of this study was to find and identify the substances produced by Bacillus subtilis B10 which has the ability to inhibit the growth of G. boninenseand also accelerate the germination process of AMF spores. The results showed thatBacillus subtilisB10 produced intra-cellular substances which have activity inhibiting the growth of
Ganoderma boninense. Extraction using organic solvents showed that this compound has inhibitory activity againstG. boninensein fraction of ethyl acetate which means that this compound is semi-polar. Results of analysis using Liquid Chromatography - Mass Spectrometer (LC-MS) showed that the active compound has a molecular weight of 255.39. Spectroscopy analysis by1H-NMR showed that the compounds having molecular formula of C12H17NO5, and postulated as of 2-(4-aminophenoxy)-6-methyl-tetrahydro-2H-pyran-3,4,5-triol. The compound of tetrahydro pyran have been known to have an activity as an antifungal.
Keywords: mycorrhizal symbiotic bacteria, active substances, extraction, substances identification
Pendahuluan
Beberapa bakteri endosimbiotik mikoriza memiliki potensi sebagai antagonis terhadap patogen tular tanah akan tetapi bekerja sinergis dengan FMA. Potensi ini perlu dieksplorasi lebih lanjut untuk mendapatkan informasi tentang pengaruh bakteri endosimbiotik mikoriza yang berasosiasi dengan FMA terhadap pertumbuhan dan kesehatan tanaman yang difasilitasi oleh FMA. Di daerah mikorizosfir ditemukan berbagai bakteri bermanfaat yang dapat menghasilkan substrat atau senyawa yang bekerja sinergis dengan FMA. Sebagai contoh perkecambahan spora FMA meningkat dengan adanya bahan yang mudah menguap yang dihasilkan oleh aktinomisetes (Azcon 1987). Bakteri pengikat nitrogen (N) di daerah rizosfir juga menguntungkan bagi perkembangan fungi mikoriza yang menyumbangkan asam amino dan ammonium kepada fungi mikoriza (Li & Hung 1987). Beberapa mikroorganisme di daerah mikorizosfir membantu melemahkan akar sehingga memudahkan penetrasi akar oleh Fungi Mikoriza Arbuskular. Hal ini dibuktikan oleh hasil Azcon-Aguillar & Barea (1985) dimana infeksi Trifolium parviflorum oleh FMA distimulasi oleh strain
Pseudomonas sp, yang melepaskan enzim selulolitik dan pektinolitik, sehingga memudahkan FMA untuk melakukan penetrasi dengan memisahkan sel sebelah luar dari korteks akar. Penelitian lain yang dilakukan oleh Barea et al. (1998) menemukan strain Pseudomonas, yang dapat menstimulasi perkembangan miselium dari perkecambahan spora Glomus mosseae di dalam tanah dan sekaligus mengkolonisasi akar.
81 Beberapa isolat bakteri Pseudomonas fluorescens yang diisolasi dari rizosfir digolongkan sebagai Plant Growth Promoting Bacteria(PGPB) dan Plant Health Promoting Bacteria (PHPB) karena kemampuan bakteri tersebut membantu perkecambahan benih dan menghambat perkembangan fitopatogenik mikroorganisme, seperti melindungi tanaman mentimun dari serangan fungi patogen Phytium spp dan melindungi tanaman kacang dari Phytium ultimum
(Luna-Romero et al. 2007). Selanjutnya bakteri ini dipertimbangkan sebagai biofungisida yang potensial karena kemampuannya dalam melindungi tanaman dari fitopatogen.
Penekanan pertumbuhan patogen oleh mikroorganisme antagonis melibatkan satu atau beberapa mekanisme tergantung dari mikrooorganisme antagonis yang terlibat. Pengaruh langsung terhadap patogen termasuk di antaranya kompetisi dengan patogen untuk mengkolonisasi atau menginfeksi akar, kompetisi mendapatkan sumber karbon dan nitrogen sebagai hara, kompetisi untuk besi (Fe) melalui produksi senyawa pengkelat Fe atau siderofor, penghambatan pertumbuhan patogen dengan senyawa antimikroba seperti antibiotik dan HCN dan lain sebagainya (Barea et al2005).
Hasil isolasi dan seleksi bakteri endosimbiotik mikoriza pada percobaan sebelumnya, diperoleh satu bakteri B10 yang memiliki aktivitas tinggi dalam menghambat pertumbuhan G. boninense. Hasil identifikasi dengan 16S rDNA menunjukkan bahwa bakteri tersebut adalah Bacillus subtilis B10. Bacillus spp merupakan bakteri yang sangat umum terdapat di tanah yang memilliki potensi sangat besar sebagai agen biokontrol karena menghasilkan antibiotik lipopeptida siklik yang aktif terhadap berbagai mikroorganisme. Senyawa antifungi yang telah berhasil diidentifikasi adalah iturin dan golongan bacillomycin yang dihasilkan oleh B. subtilis dan fusaricidin yang dihasilkan oleh Paenibacillus polymyxa
(dahulu dikenal dengan Bacillus polymyxa) (Beatty & Jensen 2002). Menurut Xiang et al. (2008) interaksi antara B. subtilis JA dan fungi patogen tanaman
Botrytis cinereamenghasilkan senyawa mudah menguap yang dihasilkan oleh B. subtilis JA, dimana senyawa tersebut merupakan inhibitor dengan spektrum luas yang bermanfaat sebagai biokontrol fungi patogen. Analisis komponen senyawa mudah menguap dari B. subtilis JA dengan GC/MS menunjukkan bahwa lebih
dari 14 komponen senyawa mudah menguap berhasil diekstrak, termasuk heksanol, pyrazine, ketone, benzene, fenol, aldehid dan alkana alifatik.
Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi senyawa aktif yang dihasilkan oleh bakteri endosimbiotik mikoriza B. subtilis B10 yang memiliki kemampuan menghambat pertumbuhan G. boninense secara in vitro dan juga meningkatkan persentase berkecambah spora FMA Gigaspora margarita.
Bahan dan Metode
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Agromikrobiologi, Labaratorium Analitik dan Laboratorium Recovery Balai Pengkajian Bioteknologi BPPT Serpong dari bulan Oktober 2008 - Desember 2010.
Bahan dan Alat yang Digunakan
Bakteri endosimbiotik mikoriza yang digunakan adalah jenis bakteri yang memberikan hasil terbaik pada Penelitian 2, yaitu bakteri yang dapat meningkatkan persentase berkecambah spora FMA dan memiliki kemampuan sebagai antagonis terhadap G. boninense. Bahan-bahan yang dibutuhkan: media untuk fermentasi dengan kultur kocok, pelarut organik yang berbeda polaritasnya untuk ekstraksi senyawa aktif, aluminium silika gel 60 F254 (Merck). Alat yang digunakan adalah autoklaf, shaker, rotavapor, kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC), LC-MS, ultrasonikasi, spektroskopi infra merah dan NMR.
Pelaksanaan Percobaan
Proses fermentasi bakteri endosimbiotik mikoriza terseleksi.
Bakteri endosimbiotik mikoriza terseleksi Bacillus subtilis B10 diinokulasikan pada media cair nutrient broth dalam erlenmeyer 100 mL yang diisi 50 mL media cair. Kemudian diinkubasikan dalam shaker incubator dengan kecepatan 150 rpm selama 8 jam pada suhu 28 oC (kultur vegetatif). Tahap berikutnya inokulasi kultur fermentatif yang dibuat dengan cara menginokulasikan 50 mL kultur vegetatif ke dalam media cair nutrient broth
83 dalam erlenmeyer 2000 mL yang diisi 1000 mL media cair (5 % V/V). Kultur fermentatif diinkubasi dalam shaker incubator dengan kecepatan 150 rpm selama 14 jam pada suhu 28oC.
Ekstraksi senyawa metabolit sekunder dari bakteri endosimbiotik mikoriza Bacillus subtilisB10.
Ekstraksi senyawa metabolit sekunder dari bakteri dilakukan dengan metode yang dikembangkan oleh Harborne (1987). Sampel hasil fermentasi disentrifuse pada 3000 rpm selama 20 menit, supernatan dan pelet yang terbentuk dipisahkan. Supernatan (ekstra sel) kemudian diekstraksi secara bertingkat dengan n-heksan, etil asetat dan butanol. Ketiga fraksi tersebut (n-heksan, etil asetat dan butanol) dipekatkan dengan rotary evaporator pada suhu 30 oC, kemudian ekstrak yang diperoleh ditimbang. Sementara untuk pelet dibilas dengan akuades steril sebanyak 2 kali, tambahkan kembali akuades steril ke dalam pelet dengan perbandingan 1 : 5 kemudian sel dilisis dengan menggunakan ultrasonicator
selama 60 menit. Pelet yang sudah dilisis disentrifuse pada kecepatan 3000 rpm selama 20 menit. Supernatan dan debris sel dipisahkan. Supernatan hasil pellet (intra sel) diekstrak secara bertingkat dengan n-Heksan etil asetat dan butanol. Ketiga fraksi tersebut (n-heksan, etil asetat dan butanol) ditampung dan dipekatkan dengan rotary evaporator pada suhu 30 oC. Ekstrak yang diperoleh kemudian ditimbang untuk dilakukan pengujian aktivitas senyawa aktif terhadap pertumbuhan G. boninense.
Uji aktivitas senyawa aktif terhadap fungiGanoderma boninense.
Uji antagonis anti fungi dilakukan dengan cara sebagai berikut: fungi patogen Ganoderma boninense ditumbuhkan dalam media agar PDA yang diletakkan pada bagian tengah sisi kanan media. Sampel senyawa aktif disiapkan dengan melarutkan sampel dalam DMSO (Dimetil Sulfoksida) dengan variasi konsentrasi 5000 ppm, 10000 ppm dan 15000 ppm. Sebanyak 20 μL sampel diteteskan pada kertas cakram8 mm, kemudian dimasukkan ke dalam cawan Petri yang telah ditumbuhkan fungiG. boninensedi bagian tengah media sisi kiri media agar PDA (posisi senyawa aktif berseberangan dengan posisi inokulum G. boninense). Setiap sampel dibuat 3 kali ulangan, dimana dalam satu Petri berisi 3
kertas cakram, yaitu kontrol positif (+), kontrol negatif (-) dan sampel senyawa aktif. Kontrol (+) yang dipakai adalah nystatin yang dibuat konsentrasi sesuai sampel (5000, 10000 dan 15000 ppm). Sementara untuk kontrol (-) adalah DMSO (dimetil sulfoksida). Cawan Petri yang telah berisi sampel uji diinkubasi pada suhu 28 oC selama 7 – 14 hari sampai terlihat pertumbuhan atau adanya lingkaran bening di sekitar kertas cakram 8 mm. Lingkaran bening tersebut merupakan tanda adanya senyawa bioaktif yang dihasilkan oleh bakteri endosimbiotik mikoriza B10 (B. Subtilis B10) yang menghambat pertumbuhan fungi patogen G. boninense.
Pemisahan senyawa bioaktif dengan kromatografi kolom.
Pemisahan senyawa bioaktif dilakukan dengan kromatografi kolom Sep– Pak Cartridges C–18. Sebanyak 10 mg sampel dilarutkan dalam 1 mL methanol for HPLC. Kolom Sep–Pak C-18 yang akan digunakan terlebih dahulu dielusi dengan acetonitril 10 % sebanyak 20 mL. Sampel kemudian dimasukkan ke dalam kolom secara perlahan, setelah sampel terlihat masuk kedalam kolom, elusi kembali dengan acetonitril secara bertingkat yaitu dengan acetonitril 10 % 20 mL, sebelum kolom kering elusi kembali dengan 20 mL acetonitril 20 %, acetonitril 40 %, acetonitril 80 % dan acetonitril 100%. Proses pemisahan kolom ini dilakukan dengan vakum basah dan kolom selalu dielusi dengan acetonitril dan tidak boleh dibiarkan kering. Hasil elusi kelima fraksi tersebut (acetonitril 10 %, 20 %, 40 %, 80 % dan 100 %) ditampung dan dipekatkan dengan rotary evaporator pada suhu 30 oC, kemudian setiap ekstrak yang diperoleh ditimbang. Kelima fraksi yang ditampung tersebut kemudian diuji aktivitas penghambatannya terhadap pertumbuhan G. boninense.
Identifikasi senyawa bioaktif dengan HPLC.
Identifikasi senyawa bioaktif dilakukan dengan metode Reverse Phase
kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC), menggunakan instrumen HPLC Water 2695, dengan detektor Photodiode Detector Array (PDA), kolom C18Puresil(5; 4,6 x 150 mm) volume injeksi 100 uL/injeksi dengan kecepatan alir 1 mL/menit, tekanan kolom 1267 psi. Sampel dielusi secara gradien menggunakan campuran
85 asetonitril dan air dari konsentrasi 15 % sampai 100 % selama 33 menit. Puncak (peak) yang diduga sebagai senyawa aktif ditampung, kemudian dipekatkan dengan pengurangan tekanan. Senyawa pekat diuji aktivitasnya untuk menghambat pertumbuhan G. boninense.
Elusidasi struktur kimia senyawa aktif.
Bobot molekul dan rumus molekul senyawa aktif ditentukan dengan Spectrum LC-MS (ESI positif ion). Gugus fungsional senyawa ditentukan dengan FTIR (Shimadzu 8300) dan struktur molekul senyawa ditentukan dengan, 1HNMR (Bruker AV-500 (500 MHz), HMBC NMR serta HMQC NMR.
Hasil dan Pembahasan
Hasil
Bakteri endosimbiotik mikoriza Bacillus subtilis B10 yang digunakan dalam penelitian merupakan bakteri yang terbukti memiliki kemampuan mempercepat perkecambahan spora fungi mikoriza arbuskular dan menghambat pertumbuhan fungi patogen G. boninense dari hasil penelitian sebelumnya. Hasil identifikasi bakteri tersebut secara morfologi, bakteri tersebut termasuk golongan bakteri Gam positif, berbentuk batang dan merupakan jenis Bacillus subtilis (Gambar 6).
Gambar 6 Morfologi sel bakteri Bacillus subtilis
B10 pada perbesaran 100x
Senyawa aktif yang terdapat dalam ekstrak kasar dipisahkan dengan kromatografi kolom menggunakan silika gel 60. Untuk mengetahui bioaktivitasnya, masing-masing fraksi ditampung dan diuji aktivitasnya terhadap pertumbuhan fungi patogen G. boninense dan kemampuannya meningkatkan persentase berkecambah spora FMA. Hasil uji bioaktivitas masing-masing fraksi terhadap pertumbuhan patogen G. boninense disajikan dalam Tabel 7, sedangkan aktivitas terhadap peningkatan persentase berkecambah spora FMA Gigaspora margaritadisajikan pada Tabel 8.
Tabel 7 Rata-rata luas zona bening yang terbentuk sebagai aktivitas antagonis senyawa aktif Bacillus subtilis B10 pada masing-masing fraksi pelarut dan kontrol positif nystatin terhadap G. boninense
Hasil uji bioaktivitas terhadap G. boninense menunjukkan bahwa fraksi etil asetat intra sel hasil kromatografi kolom mempunyai aktivitas yang lebih besar sedangkan pada fraksi n-heksan dan butanol baik ekstra sel maupun intra sel tidak menunjukkan bioaktivitas sama sekali. Hasil ini mengkonfirmasi bahwa
Fraksi Sampel Sampel (ppm)Konsentrasi Rata2 Luas Zona Bening (cm
2) Hari ke 4 Hari ke 7 Hari ke 12
Kontrol (+) nystatin 5000 0.00 9.13 1.05 10000 0.00 10.50 2.06 15000 0.00 11.92 4.03 Fraksi n-hexane/Ekstra-sel 5000 0.00 0.00 0.00 10000 0.00 0.00 0.00 15000 0.00 0.00 0.00
Fraksi Etil Asetat/Ekstra-sel 5000 0.00 0.00 0.00
10000 0.00 0.00 0.00
15000 0.00 0.00 0.00
Fraksi Butanol/Ekstra-sel 5000 0.00 0.00 0.00
10000 0.00 0.00 0.00
15000 0.00 0.00 0.00
Fraksi Etil Asetat/Intra-sel 5000 1.73 10.11 10.25
10000 2.09 10.43 10.61
15000 2.35 11.02 11.88
Fraksi Butanol/Intra-sel 5000 0.00 0.00 0.00
10000 0.00 0.00 0.00
15000 0.00 0.00 0.00
87 pemisahan senyawa aktif berhasil dilakukan dan menunjukkan bahwa senyawa aktif bersifat semi polar. Dari Tabel 7 juga terlihat bahwa fraksi etil asetat pada hari ketujuh memiliki bioaktivitas yang hampir sama dengan kontrol positif nystatin (biofungisida yang beredar di pasaran). Akan tetapi pada hari keduabelas bioaktivitas senyawa aktif fraksi etil asetat jauh lebih tinggi dibandingkan bioaktivitas antifungi nystatin, sehingga dapat disimpulkan bahwa bioaktivitas fraksi etil asetat intra sel dari bakteri endosimbiotik mikoriza Bacillus subtilisB10 jauh lebih unggul dibandingkan dengan antifungi yang beredar di pasaran, sehingga berpotensi untuk digunakan sebagai pengendali G. boninense.
Tabel 8 Rata-rata panjang hifa pada hari kelima sebagai aktivitas senyawa aktif
Bacillus subtilis B10 pada masing-masing fraksi dalam meningkatkan persentase berkecambah spora FMA Gigaspora margarita
Fraksi Sampel Senyawa Aktif (ppm)Konsentrasi Rata2 Panjang Hifa (µm)
Kontrol (tanpa inokulasi) 56,19
5000 0.00
Fraksi n-heksan/Ekstra-sel 10000 0.00
15000 0.00
5000 20,38
Fraksi Etil Asetat/Ekstra-sel 10000 47,94
15000 408,37
5000 50,20
Fraksi Butanol/Ekstra-sel 10000 99,30
15000 214,36
5000 48,56
Fraksi Etil Asetat/Intra-sel 10000 155,83
15000 155,30
5000 23,64
Fraksi Butanol/Intra-sel 10000 63,52
15000 92,68
Kemampuan senyawa aktif dari bakteri B. subtilis B10 dalam meningkatkan persentase berkecambah spora FMA Gigaspora margarita, muncul pada fraksi etil asetat yang artinya senyawa tersebut bersifat semi polar dan dikeluarkan secara ekstra seluler. Panjang hifa rata-rata pada fraksi tersebut adalah 408,37 µm, yang jauh lebih panjang dibandingkan dengan kontrol yang hanya 56,19 µm. Hal ini berbeda dengan kemampuan senyawa tersebut dalam
menghambat pertumbuhan patogen G. boninense yang dihasilkan secara intra seluler.
Hasil uji setara aktivitas senyawa aktif dari bakteri endosimbiotik mikoriza
Bacillus subtilisB10 dari fraksi etil asetat dapat dilihat pada Tabel 9.
Tabel 9 Uji setara aktivitas senyawa aktif pada beberapa konsentrasi dari bakteri endosimbiotik mikoriza Bacillus subtilis B10 terhadap pertumbuhan G. boninensedengan kontrol (+) antifungi nystatin
Perlakuan Konsentrasi (ppm) Rata-rata Luas zona bening pada (cm 2) Hari
ke 0 Hari ke 4 ke 10Hari ke 14Hari ke 18Hari ke 22Hari
Nystatin (Kontrol positif) 5000 0,00 0,00 9,38 4,15 0,59 0,00 10000 0,00 0,00 11,50 7,30 3,58 1,43 15000 0,00 0,00 12,14 10,52 5,91 3,82 Senyawa aktif bakteri B. subtilisB10 5000 0,00 0,00 16,12 15,90 15,90 15,90 10000 0,00 0,00 17,62 17,37 17,37 17,37 15000 0,00 0,00 17,88 17,88 17,88 17,88
Pada Tabel 9 terlihat bahwa pada hari keempat baik senyawa aktif maupun kontrol (+) nystatin dengan tiga tingkat konsentrasi belum menunjukkan aktivitas penghambatan terhadap G. boninense. Akan tetapi pada hari kesepuluh terlihat adanya penghambatan pertumbuhan G. boninense. Kekuatan penghambatan terhadap pertumbuhan G. boninense sangat tinggi pada perlakuan inokulasi senyawa aktif bakteri Bacillus subtilis B10, dimana pada konsentrasi terendah 5000 ppm memberikan luas zona bening mencapai 16,12 cm2, sementara kontrol (+) nystatin hanya 9,38 cm2. Hal yang sama juga terjadi pada konsentrasi yang lebih tinggi yaiu 10000 ppm dan 15000 ppm, dimana luas zona bening yang terbentuk pada perlakuan senyawa aktif bakteri B. subtilis B10 mencapai 17,62 dan 17,88 cm2secara berurutan. Hal yang menarik dari hasil penelitian ini adalah, aktivitas nystatin sebagai kontrol (+) terhadap pertumbuhan fungi G. boninense
mulai menurun pada hari ke 14 pada semua variasi konsentrasi bahkan pada konsentrasi 5000 ppm di hari ke 22, aktivitas nystatin sudah tidak ada (0,00 cm2).
89 Sebaliknya, aktivitas senyawa aktif bakteri B. subtilisB10 tetap stabil sampai hari ke 22 baik pada konsentrasi 5000 ppm maupun pada konsentrasi 10000 ppm dan 15000 ppm. Ini berarti senyawa aktif bakteri B. subtilis B10 memiliki aktivitas daya hambat yang lebih tinggi terhadap pertumbuhan fungiG. boninense.
Luas zona bening yang terbentuk sebagai aktivitas dari senyawa aktif dan control (+) nystatin terhadap G. boninense pada hari keempat (A) dan hari keempatbelas (B) dapat dilihat pada Gambar 7. Dari Gambar 7 tampak bahwa pada hari keempat bioaktivitas dari senyawa aktif maupun nystatin sebagai kontrol (+) belum menunjukkan adanya penghambatan terhadap G. boninense. Akan tetapi pada hari keempat belas luas zona bening yang dibentuk oleh senyawa aktif jauh lebih besar dibandingkan dengan kontrol (+) nystatin.
Gambar 7 Uji setara aktivitas senyawa aktif dari bakteri Bacillus subtilis B10 terhadap pertumbuhan G. boninense in vitro hari keempat (A) dan hari keduabelas (B). Senyawa aktif dari bakteri B10 memiliki daya hambat yang lebih besar dibandingkan nystatin (kontrol positif). Dari hasil uji setara aktivitas senyawa aktif bakteri B. subtilisB10in vitro, selain mampu menghambat pertumbuhan G. boninense, senyawa aktif tersebut
A A
B
B
juga memiliki kemampuan menyebabkan nekrotik pada miselia G. boninense
yang ditunjukkan dengan adanya warna coklat tua pada miselia yang berdekatan dengan senyawa aktif (Gambar 8). Hal yang sama tidak terjadi pada fungisida nystatin sebagai kontrol positif, sehingga dapat dikatakan bahwa senyawa aktif tersebut memiliki kemampuan untuk mematikan jaringan miselia G. boninense. Hal yang menarik adalah ketika ekstrak senyawa aktif diuji aktivitasnya terhadap pertumbuhan G. boninense, sel bakteri B. subtilis B10 masih dapat tumbuh di media PDA, walaupun ekstrak senyawa aktif tersebut sudah dimurnikan dengan pelarut organik dan dilakukan ultrasonikasi selama satu jam untuk menghancurkan sel bakterinya pada saat proses ekstraksi.
Gambar 8 Miselia fungi patogen G. boninense terlihat berwarna coklat (tanda panah) akibat mengalami nekrotik oleh aktivitas senyawa aktif dari bakteri B. subtilisB10
Analisis pendahuluan senyawa dari bakteri endosimbiotik mikoriza
Bacillus subtilis B10 dilakukan dengan menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT), kemudian diidentifikasi lebih lanjut menggunakan spektrometer LC-MS,
spektroskopi1H-NMR, HMBC NMR dan HMQC NMR. Data LC-MS digunakan
untuk mengetahui kemurnian serta bobot molekul suatu senyawa. Spektrum 1 H-NMR untuk menentukan jumlah dan posisi proton dalam senyawa. Analisis HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Coherence) dan HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence) NMR dilakukan untuk melihat ikatan kopling (penggandengan) antara H dan C.
Analisis LC-MS
Hasil analisis menggunakan LC-MS terhadap ekstrak dari bakteri endosimbiotik mikoriza Bacillus subtilis B10 menunjukkan adanya satu puncak
91 dominan, dengan waktu retensi 1,6 menit (T 1.6) dan luas area 335.77 merupakan produk hasil pemurnian kolom (Gambar 9). Dari hasil analisis menggunakan LC-MS diketahui bahwa senyawa aktif yang dihasilkan oleh isolat B10 memiliki bobot molekul sebesar 255,39 g/mol dimana LC-MS m/z (M+H)+ ditunjukkan sebesar 256,39 m/z (Gambar 10). Kemurnian produk dihitung dengan luas area produk dengan luas total area pada kromatogram dan diperoleh kemurnian produk 83,70 %.
0 2 4 6 8 10
Retention Time (Min)
168.4 50 60 70 80 90 100 % Inte ns ity BPI=>NR(2.00) T1.6 T3.3 T2.6 T2.0
Gambar 9 Kromatogram senyawa aktif dari bakteri endosimbiotik mikoriza Bacillus subtilisB10 dengan LC-MS
Data yang diperoleh dari pengukuran LC-MS ini memperlihatkan spektrum massa berupa ion positif dan molekul garam Na nya. Perhitungan bobot molekul dapat dilihat pada Tabel 9.
Tabel 10 Perhitungan bobot molekul senyawa aktif Bacillus subtilisB10
Ion molekul (m/z) Bobot molekul
255.39 (M) 255.39
256.39 (M + H)+ 255.39 + 1 = 256.39
279.39 (M + H)+Na 256.39 + 23 = 279.39
252.0 258.8 265.6 272.4 279.2 286.0 Mass (m/z) 0 920.7 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 % Intensity
Mariner Spec /31:32 (T /1.51:1.56) -25:27 (T -1.51:1.56) ASC=>NR(2.00)=>CT[BP = 256.4, 921]
256.39
257.39
257.06 260.14 279.04
Gambar 10 Spektra spektroskopi massa senyawa aktif dari bakteri endosimbiotik mikoriza Bacillus subtilisB10
Spektrometri Inframerah (FTIR)
Hasil analisis gugus fungsional menggunakan spektroskopi IR pada daerah 4000 500 cm-1 memberikan serapan tajam yang dapat digunakan untuk mengidentifikasi gugus fungsi dari senyawa aktif dari bakteri endosimbiotik mikoriza Bacillus subtilisB10 (Gambar 11).
Gambar 11 Spektrum FT IR senyawa aktif dari bakteri endosimbiotik mikoriza Bacillus subtilisB10
(M+H)+
(M+H)+Na
93 Serapan melebar pada bilangan gelombang () 3498,87 dan 2821,86 cm-1
menunjukkan adanya vibrasi O–H. Ikatan hidrogen menyebabkan puncak melebar dan terjadi pergeseran ke arah bilangan gelombang yang lebih kecil. Vibrasi O–H
bend muncul pada daerah 1415,75 dan 761,88 cm-1. Vibrasi C–H stretch muncul pada daerah 2931,80 cm-1. Adanya gugus amida didukung oleh pita serapan medium pada daerah 3437,15 dan 1670,35 cm-1. Serapan tajam pada puncak 1444,08 cm-1 menunjukkan adanya vibrasi C = C (ring stretch). Serapan tajam pada puncak 900 - 675 cm-1menunjukkan adanya gugus aromatik yang diperkuat dengan serapan tajam pada puncak 2931,80 ; 856,39 dan 761,88 cm-1. Serapan