Beberapa studi menunjukkan bahwa saponin dari berbagai sumber yang berbeda menurunkan level kolesterol serum baik pada hewan maupun manusia. Campuran misel
BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di laboratorium mikrobiologi rumen, National Institute of Livestock and Grassland Science, Tsukuba, Jepang. Waktu penelitian berlangsung selama 4 bulan.
Ekstraksi Lerak dan Analisis Senyawa Saponin
Buah lerak diperoleh dari Purwodadi, Jawa Tengah. Buah lerak (termasuk biji) dikeringkan dengan oven pada suhu 60oC sampai mencapai 90% bahan kering lalu digiling sehingga terbentuk tepung lerak. Tepung lerak kemudian direndam dengan methanol (1 : 4, b/v) selama 24 jam dan selanjutnya disaring sehingga diperoleh supernatan. Pelet/endapan sisa penyaringan kemudian diekstraksi menggunakan methanol baru dengan volume yang sama (1:4, b/v) selama 24 jam dan dilanjutkan dengan penyaringan kembali. Supernatan yang diperoleh kemudian dicampur dengan hasil penyaringan sebelumnya dan diuapkan dengan rotary evaporator. Hasil ekstrak methanol kemudian dikeringbekukan dengan freeze dryer
dan disimpan dalam freezer sebelum digunakan. Senyawa sekunder lerak baik dalam tepung maupun ekstrak dianalisis kandungan tanin dan saponinnnya di Balai Penelitian Ternak, Ciawi, Bogor.
Substrat Fermentasi dan Perlakuan
Cairan rumen yang digunakan untuk percobaan in vitro berasal dari sapi perah Holstein non-laktasi yang berfistula. Sapi fistula dipelihara dalam kandang koloni yang diberi ransum yang terdiri dari hay rumput timothy (67% bahan kering/BK), jagung (19%) dan bungkil kedelai (14%) sebanyak 2 kali sehari pada pukul 09.00 dan 17.00 (3.6 kg BK per pemberian). Sapi fistula sudah disertifikasi oleh The Animal Care Committee of National Institute of Livestock and Grassland Science, Japan. Cairan rumen yang digunakan untuk percobaan in vitro diambil dari sapi fistula pada pagi hari (pukul 10.00) dan disaring dengan kain tipis berlapis.
Substrat yang digunakan untuk percobaan in vitro merupakan campuran antara rumput alam dan pakan konsentrat yang dibawa dari Indonesia. Pakan
konsentrat terdiri atas bungkil kedelai, bungkil kelapa, onggok, pollard, molases,
Dicalcium Phosphate (DCP), NaCl dan CaCO3. Rumput alam diperoleh dari lahan sekitar laboratorium lapang Fakultas Peternakan IPB kemudian dikeringkan dan digiling sehingga diperoleh tepung. Hasil analisis proksimat pakan konsentrat dan rumput disajikan pada Tabel 2.
Tabel 2. Komposisi nutrien hijauan, konsentrat dan total ransum yang digunakan sebagai substrat fermentasi in vitro
Nutrien Rumput Lapang (R) Konsentrat (K) Total ransum* R:K=50:50 ---% BK--- Abu 9.37 6.60 7.99 Protein Kasar (PK) 8.98 19.07 14.03 Lemak Kasar (LK) 1.03 3.00 2.02 Serat Kasar (SK) 37.67 12.20 24.94 BETN 42.95 59.13 51.04 TDN 48.82 75.16 61.99
Hasil analisis proksimat di Laboratorium Ilmu dan Teknologi Pakan (2009).
TDN (Hartadi et al. 1980) = 92.64-3.338(SK)-6.945(LK)-0.762(BETN)+1.115(PK)+0.031(SK)2 -0.133(LK)2+0.036(SK)(BETN)+0.207(LK)(BETN)+0.100(LK)(PK)-0.022(LK)2(PK)
*Hasil perhitungan
Percobaan dilakukan menggunakan 5 perlakuan dan 4 ulangan. Substrat yang digunakan adalah campuran hijauan dan konsentrat (50:50 BK/BK) dengan perlakuan level ekstrak lerak yang digunakan sebagai berikut :
P1 : Substrat + ekstrak lerak 0 mg/ml (kontrol) P2 : Substrat + ekstrak lerak 0.001 mg/ml P3 : Substrat + ekstrak lerak 0.01 mg/ml P4 : Substrat + ekstrak lerak 0.1 mg/ml P5 : Substrat + ekstrak lerak 1 mg/ml
Fermentasi In vitro
Sampel substrat dari setiap perlakuan (0.1 g) ditimbang dalam 20 ml tabung fermentor. Setiap tabung ditambahkan 5 ml larutan buffer dan 5 ml cairan rumen serta larutan ekstrak lerak sesuai perlakuan (Kajikawa et al., 1990). Selama
22
mencampur bahan dan larutan tersebut selalu dijaga dalam kondisi anaerob dengan mengalirkan gas CO2. Setelah itu, tabung fermentor kemudian di tutup dengan tutup karet dan dipastikan tidak ada gas O2 yang masuk. Tabung fermentor kemudian diinkubasi dalam water bath pada suhu 39oC.
Sampel larutan hasil fermentasi kemudian diambil sebanyak 0.5 ml pada jam ke-12, -24 and -48 jam setelah inkubasi untuk analisis populasi protozoa. Tekanan gas juga diukur pada jam inkubasi tersebut menggunakan alat pengukur tekanan gas (GL Sciences Inc. PM222 (Kpa)). Setelah 48 jam inkubasi, 1 ml dari fase gas diambil menggunakan syringe dan disimpan dalam tabung vial 30 ml untuk pengukuran produksi metan. Selanjutnya, tutup karet pada tabung fermentor dibuka dan pH setiap tabung diukur dengan pH meter. Sampel larutan hasil fermentasi diambil sebanyak 1 ml untuk analisis VFA dan 1.5 ml untuk ekstraksi DNA dan dianalisis keragaman mikrobanya dengan PCR-DGGE (Biorad).
Analisis populasi Protozoa, Produksi Total Gas, Metan, Hidrogen dan VFA
Pengukuran populasi protozoa dilakukan dengan mengambil sampel larutan hasil fermentasi sebanyak 0.5 ml pada jam ke 12, 24 and 48 jam setelah inkubasi dan dicampur dengan 2 ml larutan fiksasi lalu dikocok sempurna. Larutan fiksasi terdiri atas 20 ml 35% formaldehyde, 180 ml ddH2O, 0.12 g methylgreen dan 1.6 g NaCl (Ogimoto & Imai 1981). Jumlah populasi protozoa dihitung dengan Fuch Rosenthal Counting Chamber (4 mm x 4 mm x 0.2 mm) dengan menggunakan rumus :
Jumlah protozoa/ml = N x 1/0.0032 x FP N = jumlah koloni protozoa terhitung dalam 16 chamber
P = Pengenceran
Tekanan gas diukur pada jam ke 12, 24 dan 48 setelah inkubasi. Nilai tekanan gas (Kpa) yang diperoleh kemudian dikonversi menjadi produksi gas total (ml) dengan rumus :
Produksi gas(ml) = tekanan gas (Kpa) x volume fase gas tabung fermentor (ml) 101.325
Keterangan : 1 Kpa=101.325 atm
Analisis konsentrasi metan dan hidrogen diukur menggunakan Biogas Analyzer (TRI lyzer TM2, temperature 50oC). Sampel fase gas yang diambil pada jam ke 48 inkubasi, diinjeksikan ke dalam methane analyzer untuk memperoleh data produksi gas metan dan hidrogen. Produksi VFA total dan parsial pada 48 jam inkubasi diukur menggunakan gas chromatography/GC (6890 series, FID, Hewlett-Packard, Wilmington, DE, USA) dengan kolom 5% Thermon 1000 and 0.5% H3PO4
pada 80/100 mesh Chromosorb W (Wako Pure Chemical,Osaka, Japan).
Analisis Keragaman Mikroba Rumen dengan PCR-DGGE
Setiap 1.5 ml larutan hasil fermentasi diambil dengan pipet yang diperbesar lubangnya agar partikel pakan dan larutan dapat terambil merata. Sampel kemudian di sentrifus pada 15.000 g selama 5 menit. Supernatan dibuang dan pelet yang tersisa digunakan untuk ekstraksi DNA dengan menggunakan kit (QIAmp stool kit). PCR-DGGE dilakukan dengan menggunakan 16S rDNA yang diperoleh dari 16S rRNA sebagai template pada reaksi PCR. Sintesis cDNA menggunakan primer V3-FwGC dan V3-Rv dengan target semua bakteri 16S rDNA V3 region dan panjangnya 190-200 bp. Karakteristik primer yang digunakan adalah primer V3-FwGC yang mengandung GC Clamp dengan sekuen 5`-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3` dan primer V3-Rv dengan sekuen 5`-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3` (Muyzer et al., 1993). Variabel V3 region untuk 16S rDNA tersebut diamplifikasi menggunakan PCR dengan kondisi denaturasi awal pada suhu 94oC selama 2 menit, kemudian amplifikasi sebanyak 30 siklus yang terdiri dari denaturasi pada suhu 94oC selama 30 detik, annealing pada suhu 55oC selama 45 detik dan extension pada suhu 72oC selama 30 detik. Extension terakhir dilakukan pada suhu 72oC selama 9 menit. Produk PCR kemudian diseparasi pada 8% (w/v) polyacrylamide gel dengan gradien denaturasi mulai 30% sampai 60% menggunakan sistem DGGE. Elektroforesis dilakukan pada 90 volt selama 16 jam pada suhu yang konstan (65oC) pada buffer TAE 0.5X.
Pita-pita yang terbentuk pada gel setelah elektroforesis selesai, kemudian divisualisasi dengan menggunakan pewarnaan perak (silver staining). Sebelumnya, gel hasil elektroforesis dipotong bagian stacking gel kemudian difiksasi dalam 200
24
ml larutan fiksasi (1 ml asam asetat glasial, 20 ml etanol dan 179 ml akuades) selama 2 jam. Selanjutnya, dicuci dengan H2O sebanyak 2 kali dan direndam dalam larutan pewarna perak (0.25 g AgNO3 dalam 250 ml H2O) sebanyak 2 kali selama 20 menit dan 35 menit. Gel kemudian dicuci dengan H2O sebanyak 2 kali lalu direndam dalam larutan developer (200 ml H2O, 3 g NaOH, 0.02 g NaBH3 dan 0.8 ml
formaldehyde) selama 7 menit sampai terlihat pita-pita pada gel. Selanjutnya, gel dicuci dengan H2O dan dilapis plastik wrap kemudian di foto menggunakan
scanner. Keragaman mikroba rumen yang digambarkan oleh pita-pita pada gel di klasterisasi menggunakan program NTsys 2.1.
Identifikasi pita-pita baru yang muncul pada gel dilakukan dengan teknik kloning dan sekuensing. Pita pada gel DGGE dipotong dan diamplifikasi dengan primer 1 dan 2 (Muyzer et al. 1993) menggunakan ExTaq DNA polymerase. Sekuen nukleotida dari primer 1 yaitu CCTACGGGAGGCAGCAG-3’; primer 2, 5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’. Kondisi PCR yang digunakan adalah denaturasi awal 94oC selama 2 menit, kemudiam amplifikasi sebanyak 30 siklus yang terdiri dari denaturasi pada suhu 94oC selama 30 detik, annealing pada suhu 55oC selama 30 detik dan extension pada suhu 72oC selama 30 detik. Extension terakhir dilakukan pada suhu 72oC selama 7 menit. Setelah produk PCR dipurifikasi dengan
QIAquick PCR purification kit (QIAGEN, Hilden, Germany), kemudian di-ligasi dengan PCR2.1 (Invitrogen Corp, Carlsbad, CA, USA) dan di masukkan ke dalam
One Shot TOP10 Electrocom E. coli (Invitrogen Corp, Carlsbad, CA, USA). Produk yang dikloning menjadi plasmid kemudian diamplifikasi menggunakan primer 2 dan 3 (Muyzer et al., 1993) untuk mengkonfirmasi posisi amplicon pada gel DGGE. Sekuen nukleotida dari primer 3 yaitu 5’-CGCCCGCCGCGCGCGGGCGGGGC GGGGGCACGGGGGG CCTACGGGAGGCAGCAG. Sekuen dari klon tersebut kemudian di identifikasi menggunakan 3730 DNA analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) dan dibandingkan dengan basis data pada GenBank
menggunakan program DDBJ BLAST (http://www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-e.html).
Analisis Data
Data yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan ANOVA (analysis of variance). Apabila terdapat perbedaan rataan yang nyata antar perlakuan, maka dilanjutkan dengan uji Duncan (Mattjik & Sumertajaya, 2002).
HASIL DAN PEMBAHASAN