KONSENTRAT BERBEDA DENGAN PEMBERIAN EKSTRAK LERAK
BAHAN DAN METODE Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Biokimia, Fisiologi dan Mikrobiologi Nutrisi, Departemen Ilmu Nutrisi dan Teknologi Pakan, Laboratorium Lapang Fakultas Peternakan IPB, dan Balai Penelitian Ternak Ciawi. Kuantifikasi bakteri rumen dengan real time PCR dilaksanakan di Laboratorium Genetika Molekuler, Jurusan Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan Fapet IPB.
Substrat Fermentasi dan Rancangan Percobaan
Bahan pakan yang digunakan sebagai ransum konsentrat yaitu bungkil kedelai (10%), bungkil kelapa (19%), pollard (34%), onggok (27.5%), molases (5%), CaCO3(3%), DCP (1%) dan garam (0.5%). Hijauan yang digunakan merupakan rumput lapang yang dipanen di sekitar laboratorium lapang, Fakultas Peternakan IPB. Komposisi nutrien hijauan dan konsentrat yang digunakan untuk fermentasi in vitro
dianalisis dengan metode proksimat (Tabel 7).
Tabel 7. Komposisi Nutrien hijauan, konsentrat dan total ransum yang digunakan sebagai substrat fermentasi in vitro tahap II
Nutrien Rumput Lapang Konsentrat Ransum 1* H:K=90:10 Ransum 2* H:K=80:20 Ransum 3* H:K=70:30 ---% BK--- Abu 9.37 6.60 9.09 8.82 8.54 Protein kasar (PK) 8.98 19.07 9.99 10.99 12.01 Lemak kasar (LK) 1.03 3.00 1.23 1.42 1.62 Serat kasar (TDN) 37.67 12.20 35.12 32.58 30.03 BETN 42.95 59.13 44.57 46.19 47.80 TDN 48.82 75.16 51.45 54.09 56.72
Hasil analisis proksimat di Laboratorium Ilmu dan Teknologi Pakan (2009).
TDN (Hartadi et al.1980) = 92.64-3.338( SK)-6.945(LK)-0.762(BETN)+1.115(PK)+0.031(SK)2 -0.133(LK)2+0.036(SK)(BETN)+0.207(LK)(BETN)+0.100(LK)(PK)-0.022(LK)2(PK)
*Hasil perhitungan
Hasil uji in vitro tahap sebelumnya menunjukkan bahwa level ekstrak lerak sebesar 1 mg/ml nyata meningkatkan produksi propionat, menurunkan gas metan serta dapat mengubah komposisi/keragaman spesies bakteri rumen. Namun, kisaran level yang digunakan pada uji tersebut cukup panjang yaitu sekitar 10 kali lipat dengan level dibawahnya (0.1 mg/ml dan 1 mg/ml), sehingga masih ada kemungkinan level optimum ekstrak lerak berada di tengah-tengah kisaran level tersebut. Penelitian tahap kedua ini mengevaluasi pengaruh penambahan ekstrak lerak pada level 0.6 dan 0.8 mg/ml pada berbagai rasio hijauan tinggi terhadap profil enzim, karakteristik fermentasi dan dinamika jumlah bakteri rumen secara in vitro. Penggunaan hijauan tinggi dimaksudkan untuk mendekati kenyataan di lapangan
42
bahwa sebagian besar peternakan sapi potong rakyat masih menggunakan hijauan tinggi (70%-90%).
Rancangan percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap pola faktorial dengan dengan faktor pertama adalah rasio hijauan : konsentrat serta faktor kedua adalah level ekstrak lerak yang digunakan. Adapun perlakuan yang akan digunakan adalah :
A = Hijauan (90) : Konsentrat (10)
B = Hijauan (90) : Konsentrat (10) + ekstrak lerak 0.6 mg/ml C = Hijauan (90) : Konsentrat (10) + ekstrak lerak 0.8 mg/ml D = Hijauan (80) : Konsentrat (20)
E = Hijauan (80) : Konsentrat (20) + ekstrak lerak 0.6 mg/ml F = Hijauan (80) : Konsentrat (20) + ekstrak lerak 0.8 mg/ml G = Hijauan (70) : Konsentrat (30)
H = Hijauan (70) : Konsentrat (30) + ekstrak lerak 0.6 mg/ml I = Hijauan (70) : Konsentrat (30) + ekstrak lerak 0.8 mg/ml
Parameter yang diukur adalah dinamika populasi bakteri rumen, populasi protozoa, profil enzim hidrolisis (amilase, carboxymethylcellulase dan xylanase), kecernaan in vitro, konsentrasi NH3 dan profil VFA.
Fermentasi In vitro
Penelitian dilakukan menggunakan teknik fermentasi secara in vitro dalam sistem inkubator secara anaerobik dengan pH media 6.9 pada suhu 39oC selama 48 jam (Tilley & Terry 1963). Cairan rumen diperoleh dari sapi potong Peranakan Ongol berfistula yang diberi pakan rumput alam dan konsentrat komersial (50:50). Pengambilan cairan rumen dilakukan dengan mengambil campuran padatan dan cairan rumen dari bagian fistula. Selanjutnya isi rumen diperas dan cairan disaring dengan menggunakan kain kasa. Hasil saringan dimasukkan ke dalam termos sebelumnya diisi air hangat 30oC dan segera dibawa ke laboratorium.
Tabung fermentor yang telah diisi dengan 0.5 g sampel ransum perlakuan ditambahkan 10 ml cairan rumen dan 40 ml larutan McDougall. Tabung lalu dimasukkan ke dalam shaker water bath dengan suhu 39oC dan dikocok dengan
dialiri CO2 selama 30 detik (pH 6.5-6.9). Kemudian tabung fermentor ditutup dengan karet berventilasi dan difermentasi selama 24 jam. Setelah 24 jam, tutup karet fermentor dibuka dan ditetesi 2-3 tetes HgCl2 untuk membunuh mikroba. Tabung fermentor kemudian di sentrifus dengan kecepatan 4000 rpm selama 10 menit. Substrat akan terpisah menjadi endapan dibagian bawah dan supernatan di bagian atas. Supernatan dipisahkan untuk analisis NH3 dan VFA, sedangkan residu yang tersisa digunakan untuk analisa kecernaan bahan kering (KCBK) dan bahan organik (KCBO). Residu hasil fermentasi disentrifuse pada kecepatan 4000 g selama 15 menit dan ditambahkan 20 ml larutan pepsin-HCl 0.2 %. Campuran tersebut lalu diinkubasi selama 24 jam tanpa tutup karet. Sisa pencernaan disaring dengan kertas saring whatman No.41 dengan bantuan pompa vakum. Hasil saringan dimasukkan ke dalam cawan porselen. Bahan kering didapat dengan cara dikeringkan dalam oven pada suhu 105oCselama 24 jam dan ditimbang. Selanjutnya bahan dalam cawan dipijarkan atau diabukan dalam tanur listrik selama 6 jam pada suhu 450-600oC. Sebagai blanko dipakai residu asal fermentasi tanpa sampel bahan pakan. Koefisien cerna bahan kering (KCBK) dan koefisien cerna bahan organik (KCBO) dihitung dengan cara :
% 100 ) ( ) ( ) ( ) ( % x g BKsampel g BKblanko g BKresidu g BKsampel KCBK % 100 ) ( ) ( ) ( ) ( % x g BOsampel g BOblanko g BOresidu g BOsampel KCBO
Kuantifikasi Spesies Bakteri dengan Real Time PCR
Sebelum pengambilan sampel cairan rumen untuk pengukuran populasi bakteri menggunakan teknik real time PCR, terlebih dahulu dilakukan analisis populasi bakteri menggunakan media agar-BHI (Brain Heart Infusion Agar) pada inkubasi 4 dan 24 jam untuk mengetahui jumlah bakteri hidup yang optimal. Hasil analisis pendahuluan menunjukkan bahwa pada inkubasi 4 jam populasi bakteri masih rendah yang berada di kisaran 105 dan pada inkubasi 24 jam populasi bakteri lebih tinggi dan berada di kisaran 107. Berdasarkan hasil tersebut, selanjutnya pengambilan sampel cairan rumen yang akan digunakan untuk pengukuran populasi bakteri menggunakan teknik molekuler dilakukan pada 24 jam inkubasi. Populasi
44
bakteri dikuantifikasi dengan real time PCR (Rotor Gene Q 1.7.94) dengan mengambil setiap 1.5 ml larutan hasil fermentasi selama 24 jam menggunakan pipet yang diperbesar lubangnya agar partikel pakan dan larutan dapat terambil merata. Sampel kemudian di sentrifus pada 10.000 g selama 5 menit. Supernatan dibuang dan pelet yang tersisa digunakan untuk ekstraksi DNA dengan menggunakan kit (QIAmp stool kit, QIAGEN). Setiap bakteri yang berbeda seperti total bakteri, F. succinogenes, R. albus, dan P. ruminicola ditentukan dengan SYBR green qPCR assay. Populasi setiap bakteri yang berbeda dihitung sebagai rasio relatif terhadap populasi total bakteri.
Optimasi PCR dan primer yang digunakan untuk menganalisis setiap populasi bakteri dilakukan dengan prosedur yang terdapat pada panduan mesin real time PCR dengan kondisi berikut : denaturasi awal 950C selama 5 menit, kemudian amplikasi sebanyak 40 siklus dengan denaturasi 95oC selama 10 detik, dilanjutkan kombinasi
annealing/extension pada 60oC selama 30 detik. Sekuen primer yang digunakan untuk beberapa spesies bakteri rumen disajikan pada Tabel 8.
Tabel 8. Sekuen primer beberapa spesies bakteri rumen
Spesies Sekuen primer
Total bakteri Forward 5’CAACGAGCGCAACCC3’ Reverse 5’CCATTGTAGCACGTGTGTAGCC3’ F. succinogenes Forward 5’CGTATGGGATGAGCTTGC3’ Reverse 5’GCCTGCCCCTGAACTATC3’ R. albus Forward 5’CCCTAAAAGCAGTCTAGTTCG3’ Reverse 5’CCTCCTTGCGGTTAGAACA3’ P.ruminicola Forward 5’GGTTATCTTGAGTGAGTT3’ Reverse 5’CTGATGGCAACTAAAGAA3’
Pembuatan standar masing-masing bakteri untuk analisis real time PCR dilakukan dengan mengamplifikasi ekstrak DNA dari cairan rumen normal dengan primernya (Tabel 8) pada suhu annealing 55oC. Produk PCR yang dihasilkan
diamplifikasi di elektroforesis dengan agarose1% untuk mengetahui pita-pita yang dihasilkan. Apabila sudah diperoleh pita tunggal, maka produk PCR tersebut di purifikasi dengan kit (QIAquick purification kit). Hasil purifikasi kemudian diukur kemurniannya pada OD260/OD280 serta diukur konsentrasi DNA-nya pada OD260. Konsentrasi DNA yang di peroleh (µg/µl) kemudian dikonversi ke copy number
dengan menggunakan rumus :
Konsentrasi DNA (copy number) = (C x 10-9) x NA
BM C = konsentrasi DNA awal (ng/ µl) BM = Bobot molekul (Dalton)
NA = Konstansta Avogadro (6.022 x 1023)
Selanjutnya, di buat pengenceran berseri untuk dibuat kurva standar mulai dengan konsentrasi 101 sampai 1010.
Perhitungan Populasi Protozoa
Perhitungan populasi protozoa menggunakan 0.5 ml larutan fiksasi (Methyl green formaline saline/MFS) yang dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan dicampur dengan cairan rumen 0.5 ml kemudian diaduk hingga merata (Ogimoto & Imai 1981). Sampel cairan diteteskan pada counting chamber (hemacytometer) dan ditutup dengan cover glass sampai rata. Hemacytometer yang digunakan mempunyai ketebalan 0,1 mm, dengan luas kotak terkecil 0,0625 mm. Kotak yang dibaca sebanyak 5 buah dan masing-masing kotak terdiri atas 16 kotak kecil. Populasi protozoa diamati dengan mikroskop lensa obyektif dengan pembesaran 40x dan okuler 10x.
Populasi protozoa/ml dihitung dengan rumus : 1
Populasi protozoa/ml = x 1000 x C x Fp 0.1 x 0.065 x 5 x 16
Keterangan : C = jumlah koloni yang dihitung
Fp = faktor pengencer ( 2 )
Pengukuran Aktivitas Enzim
Pengukuran aktivitas enzim menggunakan cairan rumen perlakuan yang difermentasi selama 4 dan 24 jam sebagai sumber enzim. Aktivitas enzim karboksimetil selulase, amilase dan xylanase dianalisis dengan inkubasi campuran
46
assay (2 ml) selama 60 menit untuk enzim karboksimetil selulase dan amilase serta 15 menit untuk enzim xylanase pada suhu 39oC (Patra et al. 2006). Sebanyak 2 ml larutan campuran assay yang mengandung 1 ml buffer phospat 0.1 M (pH 7.0), 0.5 ml cairan rumen perlakuan dan 0.5 ml substrat. Substrat yang digunakan adalah 1% (b/v) karboksimetil selulosa, 1% (b/v) pati dan 0.25% (b/v) xylan untuk selulase, amilase dan xylanase. Gula-gula hasil reduksi yang dihasilkan diestimasi sebagai monosakarida dengan metode dinitrosalicylic acid (Miller 1959). Satu unit aktivitas enzim didefinisikan sebagai jumlah enzim yang menghasilkan 1 mg monosakarida per jam per ml pada suhu 390C.
Estimasi protease dengan cara membuat campuran assay yang terdiri dari 1 ml buffer phospat 0.1 M (pH 7.0), 0.25 ml 1% kasein, 0.25 ml cairan rumen dan 0.5 ml air destilasi. Campuran tersebut kemudian diinkubasi selama 2 jam pada suhu 390C. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 2 ml 10% trichloracetic acid (TCA). Cairan supernatan diperoleh dengan sentrifugasi dan protein yang dihidrolisis diestimasi menurut metode Lowry et al. (1951). Aktivitas enzim didefinisikan sebagai miligram produk yang dilepaskan per ml per jam.
Pengukuran Profil VFA dan Konsentrasi NH3
Profil VFA dianalisis menggunakan gas chromatography (GC). Sampel cairan hasil fermentasi selama 4 jam diambil sebanyak 2 ml dan disimpan dalam tabung microcentrifuge. Sebelum dianalisis, setiap tabung ditambah dengan asam sulfosalisilat sebanyak 30 mg kemudian disentrifuse dengan kecepatan 12000 g selama 8 menit dengan suhu 7oC. Supernatan yang diperoleh diambil menggunakan syringe dan dinjeksi ke dalam GC untuk analisis profil VFA.
Konsentrasi NH3 dianalisis menggunakan metode mikrodifusi Conway (Obrink 1954). Sebelum digunakan, bibir cawan Conway dan tutupnya terlebih dahulu diolesi dengan vaselin. Supernatan yang hasil fermentasi diambil 1 ml, kemudian ditempatkan pada salah satu ujung alur cawan Conway. Sebanyak 1 ml larutan Na2CO3 jenuh ditempatkan pada salah satu ujung cawan Conway bersebelahan dengan supernatan (tidak boleh campur). Kemudian larutan asam borat berindikator sebanyak 1 ml ditempatkan dalam cawan kecil yang terletak di tengah cawan conway. Cawan Conway yang sudah diolesi vaselin dan ditutup rapat hingga
kedap udara, lalu larutan Na2CO3 dicampur dengan supernatan hingga merata dengan cara menggoyang-goyangkan dan memiringkan cawan tersebut lalu dibiarkan selama 24 jam pada suhu kamar. Setelah 24 jam dibuka, asam borat berindikator dititrasi dengan H2SO4 0.005 N sampai terjadi perubahan warna dari merah menjadi biru. Kadar NH3 dihitung dengan rumus :
sampel sampel SO