Beberapa studi menunjukkan bahwa saponin dari berbagai sumber yang berbeda menurunkan level kolesterol serum baik pada hewan maupun manusia. Campuran misel
HASIL DAN PEMBAHASAN Komposisi Lerak
Kandungan saponin dalam tepung lerak sebesar 3.87%, sedangkan dalam ekstrak metanol lerak sangat besar yaitu 81.5%, hampir 21 kalinya dibanding saponin dalam tepung lerak (Tabel 3).
Tabel 3. Kandungan senyawa tanin dan saponin pada tepung dan ekstrak lerak
Bahan Tanin (%) Sapogenin (%) Total Saponin (%)
Tepung Campuran segar 0.13 5.03 3.87
Ekstrak Metanol 0.09 14.07 81.5
Keterangan : Hasil analisis di Balai Penelitian Ternak Ciawi, Bogor
Saponin merupakan glikosida triterpenoid atau steroid yang banyak terdapat pada tanaman. Gula dapat berbentuk glukosa, galaktosa, asam glukoronat, xylosa, rhamnosa atau methylpentosa. Gula tersebut berikatan membentuk glikosida dengan
hydrophobic aglycone (sapogenin) yang berbentuk triterpenoid atau steroid menjadi saponin. Besarnya kompleksitas struktur saponin berasal dari variabilitas struktur aglycone, rantai samping dan posisi pengikatan gula pada aglycone (Francis et al. 2002). Beberapa saponin diketahui berfungsi sebagai antimikroba, menghambat jamur dan memproteksi tanaman dari serangan serangga. Selain itu, saponin juga merupakan sumber monosakarida (Morrissey & Osbourn 1999).
Keragaman Protozoa dan Bakteri Rumen Populasi Protozoa
Populasi total protozoa menurun (P<0.05) dengan pemberian ekstrak lerak 1 mg/ml pada semua waktu inkubasi yang diamati (Tabel 4). Komposisi spesies protozoa baik entodinium maupun holotrich tidak berbeda antar perlakuan. Namun, level ekstrak lerak yang lebih rendah (0.001 – 0.1 mg/ml) tidak mempengaruhi baik populasi total protozoa maupun komposisinya. Pada pengamatan 48 jam, populasi Entodinum dan Dasytricha jauh lebih kecil dibandingkan jam ke 12 inkubasi. Hal ini menunjukkan bahwa kedua spesies tersebut tidak dapat bertahan dalam kultur in vitro selama 48 jam.
26
Tabel 4. Populasi total protozoa serta komposisi spesiesnya selama 12, 24 dan 48 jam inkubasi dengan pemberian berbagai level ekstrak lerak
Parameter
Level ekstrak lerak (mg/ml)
0 0.001 0.01 0.1 1 SEM
Entodinium, jumlah sel/ml (Log10)
12 h 4.77a
4.83a 4.80a 4.77a < 2.70b 0.19
24 h 4.76a 4.84a 4.80a 4.76a < 2.70b 0.19
48 h 4.26ab
4.30a 4.24ab 4.16b < 2.70c 0.14
Diplodinium, jumlah sel/ml (Log10)
12 h 3.61a 3.46a 3.63a 3.45a < 2.70b 0.09
24 h 3.96a
3.97a 4.00a 3.96a < 2.70b 0.12
48 h 3.72a 3.67a 3.87a 3.68a < 2.70b 0.10
Dasytricha, jumlah sel/ml (Log10)
12 h 3.75a 3.66a 3.64a 3.44a < 2.70b 0.10
24 h 3.54a
3.59a 3.43a 3.59a < 2.70b 0.09
48 h <2.70 <2.70 <2.70 <2.70 <2.70 0.00
Total protozoa,jumlah sel/ml (Log10)
12 h 4.84a
4.88a 4.86a 4.81a < 2.70b 0.20
24 h 4.85a 4.91a 4.89a 4.85a < 2.70b 0.20
48 h 4.38a 4.40a 4.41a 4.31a < 2.70b 0.15
Superskrip berbeda pada baris yang sama menunjukkan perbedaan (P<0.01). SEM=standard error of mean
Sensitivitas protozoa terhadap ekstrak lerak dapat dikarenakan kemampuan saponin dari ekstrak lerak dalam mengikat sterol sehingga saponin tersebut akan mengikat sterol pada membran protozoa dan menyebabkan kerusakan membrane yang menyebabkan lisis atau kematian. Penurunan populasi protozoa dengan pemberian saponin telah banyak dilaporkan (Wallace et al. 1994; Lila et al. 2003, 2005). Newbold et al. (1997) melaporkan bahwa saponin dari S. sesban sangat toksik untuk protozoa sehingga menekan pertumbuhan protozoa dan memperbaiki aliran protein dari rumen. Teferedegne (2000) menyatakan bahwa saponin cenderung mempunyai lebih banyak pengaruh pada aktivitas protozoa rumen dibandingkan dengan produk degradasinya, sapogenin. Hal ini menunjukkan pentingnya glikosida dalam aktivitas saponin terhadap protozoa. Saponin dari daun
Sesbania pachycarpa juga mempunyai efek defaunasi dan juga berkontribusi pada meningkatnya efisiensi aktivitas mikroba (bakteri) sehubungan dengan menurunnya pemangsaan oleh protozoa (Muetzel et al. 2003).
Saponin dapat menghambat baik jumlah maupun komposisi spesies protozoa secara in vitro. Patra et al. (2006) menyatakan bahwa saponin yang diekstraksi dari
Acacia concinema dengan air, metanol maupun etanol dapat menghambat pertumbuhan protozoa entodinimum maupun diplodinium. Aktivitas antiprotozoa dari saponin merupakan pengaruh yang konsisten dalam ekosistem rumen, namun masih belum jelas spesies-spesies prototozoa yang sensitif terhadap saponin.
Beberapa hasil penelitian menunjukkan variasi pengaruh saponin terhadap populasi protozoa pada percobaan in vivo. Benchaar et al (2008) menyatakan bahwa saponin dari ekstrak Y. schidigera (10% saponin) sebesar 60 g/e/h pada sapi perah tidak mempengaruhi populasi protozoa baik jumlah maupun komposisi spesiesnya (Entodinium, Diplodinium, Isotricha, dan Dasytricha). Sementara, pada kajian in vitro menunjukkan bahwa suplementasi saponin Y. schidigera 1.0-6.0 ml/L dapat menurunkan populasi protozoa (Pen et al. 2006). Penambahan ekstrak daging buah lerak dalam ransum domba terbukti menurunkan populasi protozoa dan efektif sebagai agen defaunasi parsial dalam rumen tanpa kehilangan aktivitas antiprotozoanya dalam waktu 27 hari (Wina et al. 2006). Efek antiprotozoa juga terdapat pada saponin dari biji fenugreek serta daun Sesbania yang mampu menurunkan populasi protozoa hampir 50% (Goel et al. 2008).
Ivan et al. (2004) melaporkan bahwa defaunasi menggunakan daun
Enterolobium cyclocarpum sebesar 200 g/e/hari pada domba dapat menurunkan protozoa selama 4-11 hari sebesar 49-75% dan cenderung meningkat pada hari ke-20. Komposisi spesies protozoa rumen untuk Entodinium, Isotricha dan Dasytricha
relatif sama antar perlakuan, namun konsentrasi Polyplastron dan Enoplastron
meningkat dengan pemberian E.cyclocarpum
Keragaman Bakteri Rumen
Hasil analisis DGGE menunjukkan bahwa penambahan ekstrak lerak 1 mg/ml dapat mengubah keragaman bakteri rumen yang diperlihatkan dengan munculnya 1 pita baru (pita 1) dan 2 pita (pita 2 dan 3) yang meningkat ketebalannya dibandingkan dengan perlakuan lainnya (Gambar 4). Sementara itu, pemberian ekstrak lerak pada level yang lebih rendah (0.001 – 0.1 mg/ml) menghasilkan profil pita yang sama dengan perlakuan kontrol.
28
Gambar 4. Pola pita-pita yang muncul pada kultur yang diberi berbagai tingkat ekstrak lerak hasil dari analisis DGGE sebagai indikator keragaman bakteri rumen
Analisis similaritas menunjukkan adanya perbedaan struktur komunitas bakteri rumen dimana penambahan ekstrak lerak 1 mg/ml mempunyai klaster yang berbeda dengan perlakuan lainnya dengan koefisien similaritas sebesar 75% (Gambar 5).
Perlakuan ekstrak lerak pada level dibawahnya 0.01 mg/ml menghasilkan klaster similaritas yang sama dengan perlakuan kontrol yang menunjukkan bahwa ekstrak lerak pada level tersebut belum mempengaruhi keragaman bakteri rumen. Sementara, penambahan ekstrak lerak 0.1 mg/ml tidak mempengaruhi keragaman bakteri rumen dengan koefisien similaritas sebesar 96%.
Gambar 5. Hasil klasterisasi keragaman bakteri rumen berdasarkan hasil analisis DGGE pada kultur yang diberi berbagai level ekstrak lerak.
Hasil identifikasi pita-pita baru yang muncul pada gel DGGE dengan perlakuan 1 mg/ml ekstrak lerak menggunakan teknik kloning dan sekuensing menunjukkan bahwa sekuen yang diperoleh dari pita-pita tersebut mempunyai kemiripan dengan bakteri Prevotella ruminicola (98-100%), Butyrivibrio fibrisolvens
(99%), Coprococcus eutactus (99%) dan Treponema bryantii (94%) (Tabel 5). Defaunasi menggunakan saponin dari ekstrak lerak dapat menekan populasi protozoa secara parsial dan mengakibatkan beberapa bakteri dapat berkembang. Bakteri-bakteri tersebut diduga sering dimangsa oleh protozoa pada kondisi rumen normal. Telah banyak dilaporkan bahwa protozoa merupakan predator bagi sebagian bakteri dan memangsa bakteri untuk kebutuhan proteinnya. Selain itu, dengan menurunnya populasi protozoa dapat mengurangi kompetisi zat makanan (substrat) dengan bakteri sehingga beberapa bakteri dapat berkembang.
30
Tabel 5. Identifikasi bakteri pada pita-pita baru hasil DGGE pada kultur yang mendapat perlakuan 1 mg/ml ekstrak lerak
Pita Closest related species Similaritas sekuen
(%) 1 Coprococcus eutactus EFO31543 99
Clostridium methylpentosum Y18181 87
Treponema bryantii M57737 94 2 Prevotella ruminicola AJ009933 98
Subdoligranulum variabile AJ518869 88
Pseudobutyrivibrio ruminis atau
Butyrivibrio fibrisolvens
99
Prevotella nigrescens X73963 91
Spirochaeta zuelzerae M88725 88 3 Prevotella ruminicola AB004909 100
Acinetobacter lwoffii Z93442 100
Bakteri P.ruminicola merupakan bakteri yang dapat menghasilkan propionat melalui jalur akrilat, sedangkan T. bryantii juga termasuk bakteri yang aktif mendegradasi turunan xylan dan pektin menjadi suksinat yang merupakan prekursor propionat. B. fibrisolvens merupakan bakteri penghasil butirat dan C. eutactus
merupakan bakteri proteolitik yang mendegradasi protein (Hobson & Stewart 1997). Hal ini dapat mengarahkan proses fermentasi pakan untuk pembentukan propionat yang sangat diperlukan oleh ternak sapi potong sebagai sumber energi utama.
Hasil penelitian ini sama dengan hasil penelitian Cheeke (2000) yang menunjukkan bahwa secara in vitro, saponin dari ekstrak Y. schidigera dapat menstimulasi pertumbuhan bakteri P. ruminicola dan menekan pertumbuhan bakteri
S. bovis. Pengaruh tersebut diduga berhubungan dengan adanya membran luar pada bakteri P. ruminicola yang merupakan bakteri Gram negatif yang mempunyai lapisan hidrofilik sehingga dapat berperan sebagai penghalang (barrier) dan memproteksi bakteri (Nikaido 1994). Ozutsumi et al. (2006) menyatakan bahwa pada rumen yang mendapat perlakuan defaunasi terjadi peningkatan jumlah bakteri P. ruminicola, R. albus, dan R. flavefaciens dibandingkan pada rumen yang tidak mendapat perlakuan defaunasi. Sebaliknya, jumlah bakteri F. succinogenes lebih rendah pada perlakuan defaunasi. Wang et al. (2000) melaporkan penurunan
pertumbuhan kultur murni bakteri P. bryantii, S. bovis dan Ruminobacter amylophilus dengan pemberian saponin steroid yang menghambat perkembangan dinding sel bakteri. Hal ini memperjelas bahwa munculnya bakteri baru serta meningkatnya beberapa bakteri yang diidentifikasi pada penelitian ini terkait dengan peran ekstrak lerak sebagai antiprotozoa. Pada kondisi populasi protozoa terhambat, maka bakteri-bakteri tersebut dapat berkembang optimal.
Penelitian lain menunjukkan bahwa penambahan daun S. pachyarpa yang mengandung saponin tidak menghambat pertumbuhan bakteri selulolitik seperti F. succinogenes dan R. flavefaciens, tetapi berpengaruh negatif pada R. albus pada sistem in vitro (Muetzel et al 2003). Meskipun telah banyak diketahui bahwa ketiadaan protozoa dapat meningkatkan populasi bakteri, namun perlu diklarifikasi bahwa pengaruh tersebut lebih ditekankan pada peningkatan bakteri spesifik pada rumen ternak. Berdasarkan penelitian ini, belum dapat dijelaskan mekanisme peningkatan bakteri spesifik rumen akibat penggunaan ekstrak lerak 1 mg/ml.
Karakteristik Fermentasi
Produksi Gas Total, Hidrogen (H2) dan Metan (CH4)
Pemberian ekstrak lerak sebesar 1 mg/ml meningkatkan (P<0.05) produksi gas total pada inkubasi 12 dan 24 jam, tetapi pada inkubasi 48 jam tidak terjadi perbedaan antar perlakuan (Gambar 6). Sementara, konsentrasi metan/ml gas pada inkubasi 48 jam menurun (P<0.05) dengan penggunaan ekstrak lerak 1 mg/ml dibandingkan perlakuan kontrol (Gambar 7). Namun, total produksi metan dan H2 pada inkubasi 48 jam sama antar perlakuan (Tabel 6).
Peningkatan produksi gas total yang terdiri dari CO2, O2, CH4 dan gas lainnya sebagai respon terhadap penggunaan ekstrak lerak mengindikasikan terjadinya peningkatan aktivitas fermentasi rumen. Selain itu, terjadinya penurunan konsentrasi metan/ml gas sebesar 11% dibanding perlakuan kontrol menunjukkan terjadinya pemanfaatan H2 untuk pembentukan propionat. Hal ini juga didukung oleh meningkatnya produksi propionat yang diperkirakan dilakukan oleh beberapa bakteri rumen.
32
Gambar 6. Pola produksi gas total in vitro pada berbagai level ekstrak lerak
Gambar 7. Konsentrasi metan/ml gas in vitro pada 48 jam inkubasi sebagai respon pengaruh berbagai level ekstrak lerak
Peningkatan produksi propionat akibat penambahan ekstrak lerak juga dapat menekan produksi metan. Hal ini dikarenakan baik produksi metan maupun propionat merupakan dua jalur metabolisme yang sama-sama memerlukan H2 dalam sistem rumen. Disamping itu, penurunan jumlah protozoa dalam rumen juga dapat
secara parsial menghambat aktivitas bakteri metanogen karena protozoa merupakan inang bagi beberapa bakteri metanogen (Finlay et al. 1994). Penekanan populasi protozoa melalui defaunasi dapat mengakibatkan pertumbuhan beberapa bakteri metanogen terhambat, serta mempengaruhi komposisi bakteri rumen, profil VFA berubah dengan meningkatnya produksi propionat dan menurunnya produksi asetat dan butirat, serta produksi metan berkurang. Lila et al. (2005) juga melaporkan bahwa suplementasi sarsaponin dapat menurunkan produksi gas metan dan secara parsial dapat menghambat aktivitas bakteri metanogen dalam rumen in vivo. Sementara, Hess et al. (2003) menunjukkan bahwa saponin dari S. saponaria 100 mg/g dapat menurunkan produksi metan sebesar 20% pada substrat berbasis hijauan, namun penurunan tersebut tidak terkait langsung dengan penurunan populasi protozoa.
Namun sebaliknya, Goel et al. (2008) melaporkan bahwa secara in vitro
saponin dari daun Sesbania (21.2 mg), Fenugreek (11.54 mg), dan Kanutia (7.76 mg) dalam 380 mg substrat campuran hay dan konsentrat (1:1) dapat menurunkan populasi protozoa 10%-39% dan menghambat metanogen berturut-turut sebesar 78%, 22% dan 21% namun tidak berpengaruh pada produksi gas metan. Di dalam rumen, produksi metan yang diakibatkan simbiosis antara protozoa dan metanogen tergantung pada laju asosiasi antara protozoa dan metanogen serta laju produksi metan per sel metanogen. Pengaruh saponin dari ekstrak Y. schidigera (YSE) terhadap produksi metan secara in vivo pada domba juga telah dilaporkan Wang et al. (2009) yang menunjukkan bahwa pemberian 170 mg/hari YSE pada domba dapat menurunkan produksi metan sekitar 15% dan nampaknya hal ini berkorelasi dengan peningkatan proporsi propionat.
Pengaruh saponin terhadap produksi metan tidak dipengaruhi oleh rasio antara hijauan dan konsentrat. Xu et al. (2010) melaporkan bahwa penggunaan saponin dari YSE 110 mg/kg dapat menurunkan produksi metan pada berbagai rasio hijauan dan konsentrat (50:50 dan 10:90) pada 24 jam inkubasi serta pada berbagai sumber hijauan (alfalfa (Medicago sativa), fescue (Festuca arundinacea), rumput orchard (Dactylis glomerata), Bermuda (Cynodon dactylon) dan rumput switch (Panicum virgatum). Tidak terdapat interaksi antara YSE, sumber hijauan dan rasio hijauan dan konsentrat yang digunakan yang menunjukkan bahwa saponin YSE
34
dapat menurunkan metan pada berbagai jenis hijauan dan rasio hijauan dan konsentrat yang berbeda.
Profil VFA dan pH Rumen
Penambahan ekstrak lerak sebesar 1 mg/ml menurunkan (P<0.01) nilai pH sampai 6.25 pada inkubasi 48 jam. Meskipun penggunaan ekstrak lerak tidak mempengaruhi konsentrasi VFA total, namun produksi propionat meningkat (P<0.01) sementara produksi asetat, butirat, isovalerat dan valerat menurun (P<0.01). Kondisi tersebut menurunkan rasio asetat : propionat dari 2.98 menjadi 2.36 (Tabel 6). Penurunan proporsi asetat dan butirat dengan pemberian ekstrak lerak 1 mg/ml diduga disebabkan oleh terjadinya perubahan pola fermentasi yang mengarah pada pembentukan propionat.
Pada sistem metabolisme rumen, karbohidrat pakan (termasuk serat pakan) akan diubah menjadi asam piruvat yang selanjutnya terbagi menjadi 2 jalur yaitu diubah menjadi laktat untuk pembentukan propionat dan jalur lain dirubah menjadi asetil koenzim A untuk pembentukan asetat dan butirat. Nampaknya, perubahan komposisi bakteri rumen akibat pemberian ekstrak lerak dapat mengarahkan pembentukan laktat dari piruvat yang selanjutnya dirubah menjadi propionat. Sehingga, proporsi terbentuknya asetil koenzim A diduga menurun yang mengakibatkan penurunan butirat dan asetat.
Tabel 6. Rataan nilai karakteristik fermentasi in vitro selama 48 jam inkubasi pada berbagai level ekstrak lerak
Parameter Level ekstrak lerak (mg/ml)
0 0.001 0.01 0.1 1 SEM
pH 6.37a 6.35 ab 6.33ab 6.32b 6.25 c 0.0096
Total VFA (mM) 96.89 99.32 99.74 99.29 98.42 0.55
VFA(% total VFA)
Asetat 64.17a 63.97a 63.72a 63.84a 61.74b 0.21 Propionat 21.54b 21.56b 21.74b 21.77b 26.12a 0.41 Butirat 11.69a 11.84a 11.91a 11.80a 9.90b 0.18 Iso-valerat 1.17 a 1.18 a 1.18a 1.14a 0.86b 0.02 Valerat 1.42 a 1.44 a 1.45a 1.44a 1.39b 0.006 A:P 2.98 a 2.97 a 2.93a 2.93a 2.36b 0.05 H2 48 j (µM) 7.70 7.16 8.47 7.25 8.06 1.081
Rataan dengan superskrip berbeda pada baris yang sama menunjukkan perbedaan (P<0.01) A:P=asetat:propionat
Penambahan saponin dan senyawa mirip saponin telah diketahui dapat meningkatkan konsentrasi propionat dan rasio relatifnya terhadap total VFA dalam rumen khususnya ketika saponin dengan konsentrasi tinggi diberikan (Goel et al. 2008; Wina et al. 2005b). Saponin yang diekstraksi dari keseluruhan buah dan biji lerak yang dievaluasi pada percobaan ini juga dapat meningkatkan produksi propionat tanpa menurunkan produksi total VFA. Propionat merupakan sumber energi utama bagi ternak pedaging melalui proses glukoneogesis (Yost et al. 1977; Murray et al. 2006), sehingga peningkatan konsentrasi propionat akan memperbaiki efisiensi penggunaan pakan oleh ternak. Peningkatan produksi propionat terjadi hanya pada penggunaan ekstrak lerak 1 mg/ml. Pada level yang sama, juga terjadi penurunan yang nyata terhadap populasi protozoa, konsentrasi metan, dan perubahan komposisi bakteri rumen (Tabel 4, Gambar 4 dan 7). Peningkatan konsentrasi propionat diduga distimulasi oleh berkembangnya bakteri P.ruminicola
dan T. Bryantii pada penggunaan ekstrak lerak 1 mg/ml. Bakteri .ruminicola dan T. Bryantii diketahui merupakan produsen propionat dan suksinat pada sistem rumen (Hobson & Stewart, 1997).
SIMPULAN
Buah dan biji lerak yang diekstraksi dengan metanol mengandung saponin tinggi (81.5% BK) dan dapat digunakan sebagai agen defaunasi untuk menekan pertumbuhan populasi protozoa. Penggunaan ekstrak lerak sebesar 1 mg/ml mempunyai pengaruh yang menguntungkan pada fermentasi rumen dengan meningkatkan produksi propionat dan menekan produksi metan. Ekstrak lerak dapat mempengaruhi keragaman komposisi bakteri rumen dengan berkembangnya beberapa bakteri antara lain P. ruminicola dan T. bryantii.