C. Pemeriksaan Konfirmas
13. Barbiturat dalam sisa bahan makanan, minuman dan obat a Spektrofotometr
Metoda ini digunakan untuk pemeriksaan Barbiturat dalam sediaan tunggal dan mempunyai dosis tinggi yang terdapat pada sisa bahan makanan, minuman, obat yang diduga menimbulkan keracunan.
1) Prinsip
Golongan obat barbiturat diekstraksi dari spesimen dengan pelarut organik, residu yang didapat dilarutkan dengan akuades dalam suasana basa diukur dengan spektrofotometer pada 240 nm secara kualitatif dan tambahkan asam bila diukur dengan spektrofotometer pada λ 200-400 nm secara kuantitatif.
2) Alat
a) Spektrofotometer & pencatat b) Cairan pemisan
c) Kertas saring d) Labu ukur 10 mL
3) Reagen
a) Larutan bufer borat pH = 8,4 :
Campurkan 22,4 g dinatrium tetraborat dengan 70 mL larutan asam hidroklorida dalam akuades (1 mol/L), kemudian encerkan hingga 2 L dengan akuades.
b) Larutan asam hidroklorida dalam akuades (2 mol/L). Larutan asam sulfat pekat (kerapatan relatif 1,83).
c) Larutan amonium hidroksida pekat (kerapatan relatif 0,88). d) Campuran natrium sulfat/karbon aktif :
Tambahkan 100 mg karbon aktif kepada 100 g natrium sulfat anhidrat, kemudian campurkan hingga homogen dan panaskan dalam cawan evaporasi pada 100º C selama 8 jam. Biarkan dingin dan simpan dalam botol yang tertutup rapat.
Standar :
Satu seri larutan yang masing-masing mengandung 5, 10, 25 dan 50 mg/L Barbital dalam plasma blanko yang dibuat dengan mengencerkan larutan standar natrium barbital dalam air (1,12 g/L), yang setara dengan asam dietilbarbiturat dengan konsentrasi 1,00 g/L
4) Cara Kerja
b) Tambahkan 5 mL spesimen , 2 mL larutan asam hidroklorida dalam akuades (2 mol/L) dan 60 mL dietileter (dengan hati-hati) ke dalam corong pisah kapasitas 250 mL.
c) Basahi tutup corong pisah dengan akuades, tutup corong pisah dan goyang perlahan-lahan selama 2 menit.
d) Biarkan larutan dalam corong pisah selama 5 menit dan kemudian fasa bawah (fasa air) dibuang dengan membuka kran corong pisah.
e) Tambahkan ekstrak dietileter ke dalam 10 mL larutan buffer borat dalam corong pisah kedua dan kocok selama 1 menit. f) Biarkan larutan dalam corong pisah selama 5 menit dan
kemudian fasa bawah (fasa air) dibuang lagi dengan membuka kran corong pisah.
g) Cuci dinding dalam corong pisah dengan 5 mL akuades, biarkan larutan dalam corong pisah selama 5 menit dan kemudian fasa air dibuang lagi dengan membuka kran corong pisah.
h) Tambahkan 4 g campuran natrium sulfat karbon ke dalam ekstrak dietileter dalam corong pisah. Kocok isi corong pisah agar terdispersi dan saring. Setelah disaring, tampung ekstrak dietileter dalam erlenmeyer kapasitas 150 mL.
i) Tambahkan lebihn lanjut 20 mL dietileter ke dalam corong pisah, kocok dan tambahkan ke dalam ekstrak dietileter dalam Erlenmeyer dengan bantuan corong fitrasi.
j) Uapkan ekstrak dietileter hingga kering dalam penangas air pada 40°C dibawah atmosfer udara tekan atau gas nitrogen. k) Tambahkan 5,0 mL akuades ke dalam ekstrak kering dalam
Erlenmeyer, goyang perlahan-lahan dan biarkan selama 5 menit.
l) Saring dengan kertas saring larutan dalam erlenmeyer dan tampung filtrat dalam tabung reaksi ukuran 12,5 cm.
m) Periksa titik nol spektrofotometer pada 240 nm menggunakan akuades baik pada posisi spesimen maupun pada posisi referensi. Gunakan sel/kuvet kuarsa ukuran 1 x 1 x 4 em
n) Tambahkan 4 mL filtrat dari tabung reaksi ke dalam set yang bersih dan tambahkan 50 µL larutan amonium hidroksida pekat dan aduk dengan pengaduk plastik. Pastikan bahwa pH larutan kira-kira 10.
o) Ukur segera absobansi pada 240 nm dengan akuades sebagai blanko.
p) Apabila perlu, encerkan secara akurat larutan ekstrak dengan akuades sehingga absorbansi terbaca pada kisaran yang baik dan catat faktor pengenceran yang digunakan. Apabila pengukuran dilakukan dengan spektrofotometer yang dilengkapai fasilitas skanning, skan pada 200-450 nm
q) Ulangi pengukuran atau skanning setelah 5 menit.
r) Tambahkan 0,1 mL asam sulfat pekat ke dalam sel, aduk menggunakan pengaduk plastik dan pastikan bahwa pH larutan di sekitar 2 ( menggunakan kertas indikator universal).
s) Ulangi pembacaan (249 nm) atau skan (200-450nm)
Pembacaan Hasil
Sejumlah senyawa dapat mengganggu analisis ini. Glutetimida akan terhidrolisis engan cepat pada keadaan alkalis, sehingga absorbansi pada 240 nm akan turun secara signifikan setelah 5 menit pada pH = 11 (langkah 15 di atas) apabila senyawa ini ada. Adanya senyawa lain, seperti metaqualon (misalnya dikloralfenazon) dapat diatasi dengan memperhatikan spectra pada daerah 200-450 nm. Penambahan 0,1 mL larutan natrium hidroksida ke dalam ekstrak amoniakal (langkah 14 di atas) menghasilkan pergeseran spectra lanjut yang karakteristik yang dapat dimanfaatkan dalam analisis kualitatif.
Sensitivitas :
Barbiturat 2 mg/L
b. Kromatografi Lapisan Tipis (KLT) 1) Prinsip
Barbiturat diekstraksi dari spesimen biologis dengan pelarut organik, kemudian diuapkan hingga diperoleh residu. Selanjutnya residu dianalisa dengan KLT.
2) Peralatan
a) Alat KLT
- Lempeng KLT silika gel GF 254 ( 20 x 20 cm, 10 x 10 cm, 10 x 5 cm) - Tabung elusi - Pipa kapiler - Botol semprot b) Oven c) Lampu UV 3) Reagen
Semua bahan kimia harus reagen pro-analisa. a) Asam klorida (HCl) 6 N
Larutkan 50,0 mL asam klorida pekat dalam 100 mL akuades. b) Diisopropil eter
c) Kalium permanganat (KMnO4) 100 mg/100mL. Larutkan 0,1g
kalium permanganat dalam air dan encerkan hingga 100 mL. d) Merkuri sulfat (HgSO4) 2 g/100 mL, campurkan 10,0 mL asam
sulfat pekat sambil digoyang.
Biarkan larutan dingin kemudian encerkan hingga 250 mL dengan akuades.
e) Difenil karbason (OPC) 10 mg/100 mL.
Larutkan 10 mg OPC dalam 100 mL kloroform. Simpan dalam botol gelap.
f) Penampak noda
(1) Kalium permanganat (KMnO4)
(2) Merkuri sulfat (HgSO4)
(3) Difenil karbason (DPC)
4) Cara Kerja a) Ekstraksi
Prinsip
Golongan obat barbiturat diekstraksi dengan pelarut organik dan ditambah dengan basa kuat sehingga terbentuk lapisan alkali, yang dapat dianalisa secara kualitatif dengan alat KLT dan secara kuantitatif dengan alat KG.
Cara Ekstraksi :
(1) Pipet 3,0 mL spesimen (darah, serum, plasma, urin dan isi
lambung ke dalam tabung gelas 60 mL atau corong pisah 100 mL. Untuk blanko campur 3,0 mL larutan standar
barbiturat dan 3,0 mL akuades.
(2) Atur pH untuk semua spesimen sampai 6,5
(3) Tambahkan 50,0 mL kloroform pada setiap spesimen dan kocok selama 3 menit.
(4) Buang lapisan air dari semua spesimen kecuali whole blood dan saring. Jika menggunakan whole blood, lapisan kloroform sebaiknya dipisahkan dengan hati-hati. Saring setiap ekstrak kloroform yang terdapat pada butir (3) menggunakan kertas saring E&D # 615.
(5) Kocok lapisan kloroform dari semua spesimen kecuali whole blood dengan 5 mL buffer fosfat pH 7. Biarkan lapisan memisah dan buang lapisan air.
(6) Masukkan 40,0 mL lapisan kloroform (yang telah dicuci) ke dalam botol gelas ukuran 60 mL.
(7) Tambahkan 5,0 mL NaOH 0,45 N dan kocok campuran selama 1 menit. Tambahkan 10,0 mL NaOH 0,45 N ke dalam ekstrak larutan standar.
(8) Pipet lapisan alkali ke dalam tabung dan sentrifus (lapisan kloroform dapat disaring atau dapat juga disimpan untuk menentukan adanya kemungkinan terdapatnya obat netral).
b) Kromatografi Lapisan Tipis
(1) Kumpulkan lapisan alkali yang bening dari sentrifus pada metoda ekstraksi, masukkan ke dalam botol gelas yang bertutup 60 mL dan asamkan larutan ini dengan asam klorida 6 N, tambahkan 10,0 mL kloroform dan kocok selama 3 menit.
(2) Pisahkan lapisan air kemudian saring lapisan organik ke dalam cawan penguap dan uapkan sampai menjadi residu (kerjakan di dalam lemari asam).
(3) Larutkan residu dalam 0,2 mL kloroform dan totolkan pada lempeng kaca KLT. Setiap lempeng harus ditotolkan larutan standar barbiturat yang sesuai (atau diphenilhydantoin). (4) Lempeng kaca KLT dielusi dengan diisopropil eter.
(5) Keringkan lempeng kaca KLT tersebut pada suhu kamar. (6) Semprot lempeng dengan kalium permanganat, merkuri
sulfat dan difenil karbason.
Catat hasil setelah penyemprotan.
Pembacaan Hasil
Bandingkan nilai Rf ekstrak dan warna yang timbul dengan standar. Reaksi warna setelah penyemprotan
Jenis Barbiaturat Nilai Rf KMnO4 HgSO4 DPC
Amobarbital 0.78 - Abu-abu Violet
Butabarbital 0.72 - Abu-abu Violet
Heksobarbital 0.62 Kuning Abu-abu Violet
Pentobarbital 0.80 - Abu-abu Violet
Fenobarbital 0,62 - Abu-abu Violet
Sekobarbital 0,87 Kuning Abu-abu Violet
c. Kromatografi Gas (KG) 1) Prinsip
Barbiturat diekstraksi dari spesimen biologis dengan pelarut organik kemudian diuapkan sehingga diperoleh residu,selanjutnya dianalisa dengan kromatografi gas.
2) Peralatan
Alat kromatografi gas. Kondisi Kromatografi Gas : a) Detektor : FID
b) Kolom : Apiezon *) L 10% c) Suhu : 210º C
d) Gas : Nitrogen dengan kecepatan alir 50 mL/menit *) Cappilary Column yang sesuai
3) Reagen
a) Larutan standar golongan barbiturat b) Gas Nitrogen
4) Cara Kerja
a) Ekstraksi (lihat ekstraksi metoda KLT) b) Pemeriksaan Kromatografi Gas
- Bahan untuk kromatografi gas berasal dari ekstraksi spesimen - Larutkan residu hasil ekstraksi tersebut dalam 50 µL metanol
dan injeksikan ke dalam alat kromatografi gas.
- Buat larutan standar barbiturat dalam 1 µL larutan tersebut ke dalam alat kromatografi gas.
Pembacaan Hasil
Bandingkan rekaman hasil pemeriksaan dengan standar. Waktu retensi relatif
Jenis Barbiaturat Kolom Apiezon L 10% Suhu 210º C
Barbital 1,0 Allobarbital 1,47 Butabarbital 1,84 Amylobarbital 2,14
14. Benzodiazepin dalam Spesimen Manusia