C. Pemeriksaan Konfirmas
4) Cara Kerja a) Ekstraks
Prinsip
Amfetamin dan metamfetamin yang terdapat dalam urin diekstraksi dengan pelarut organik sehingga terbentuk residu, yang dapat dianalisis secara kualitatif dengan alat KLT atau kuantitatif dengan alat KG.
Cara Ekstraksi
- Masukkan 2 mL urin spesimen ke dalam tabung sentrifus 50 mL dan 0,25 mL larutan standar (larutan 2 metil feniletilamin : 8 µg/mL).
- Tambahkan 2 mL NaOH 1 M, air suling 5 mL dan diklorometan 20 mL dan kocok. Tabung ditutup, kocok sentrifus dengan kecepatan rendah selama 5 menit, lapisan atas dibuang.
- Tambahkan 2 mL asam sulfat 0,15 M, tabung ditutup, kocok dan sentrifus.
Lapisan sir sebelah atas dipindahkan ke dalam tabung sentrifus 15 mL tambahkan 1 mL natrium hidroksida 1 M dan 2,5 mL 1-klorobutan atau diklorometan.
Tutup tabung vortex dengan berat dan disentrifus lapisan organik pindah ke dalam tabung yang bersih, tambahkan 50 µL larutan metanolic asam klorida (9 : 1 v/v).
- Residu siap diperiksa dengan alat KLT atau alat KG. Ekstrak diuapkan dengan vakum sampai kering.
b) Pemeriksaan Kromatografi Lapisan Tipis
- Hasil ekstraksi yang telah dikeringkan dilarutkan kembali dengan metanol.
- Totolkan 5-10 µL larutan standard an hasil ekstraksi pada plat dengan jarak 2 cm, kemudian elusi dalam tabung elusi dengan salah satu larutan eluen.
- Keluarkan plat dari tabung elusi, kemudian sebelum disemprot dengan larutan penampak noda.
- Pengeringan pada suhu kamar atau di dalam oven pada suhu 120°C selama 10 menit atau dengan menggunakan udara panas dari blower.
- Plat yang telah kering disemprot dengan larutan penampak noda, kemudian diamati dengan lampu UV.
- Penampak noda : (1) Fast Black K Salt
- Semprot plat dengan larutan A dan amati warna noda, untuk amin sekunder misalnya metamfetamin akan
segera menghasilkan noda. Semprot dengan larutan B sedikit berlebih, akan menghasilkan warna noda untuk amin primer misanya amfetamin.
- Keringkan plat pada udarang kering dan semprot sekali lagi dengan larutan A, supaya menghasilkan noda yang lebih intensif
- Warna bervariasi dari ungu untuk amfetamin sampai merah muda untuk metamfetamin.
- Batas deteksi untuk amfetamin dan metamfetamin adalah 0,05-0,1 µg.
(2) Reagen Ninhidrin
- Semprot dengan reagen ninhidrin
- Plat keringkan dalam oven pada suhu 120º C sekurang- kurangnya 15 menit.
- Noda warna ungu atau merah muda akan dihasilkan oleh amfetamin dan noda dengan warna lebih kuat oleh metamfetamin.
(3) Reagan Fluoreskamin
- Samprot dengan reagen fluoreskamin.
- Plat keringkan dengan udara panas dari blower.
- Amati plat di bawah sinar UV pada panjang gelombang 365 nm.
- Amfetamin memberikan noda warna kuning berfluoresensi.
- Batas deteksi amfetamin dan amin primer lainnya adalah 10 µg.
- Metamfetamin tidak terdeteksi. (4) Reagen Simons
- Semprot plat dengan larutan A, kemudian semprot lagi dengan larutan B.
- Masukkan plat dalam tabung elusi yang kosong dan beker gelas kecil yang berisi asetaldehid ke dalam tabung elusi yang kosong, tutup tabung elusi.
- Uap asetildehid menyebabkan metamfetamin memberikan noda yang berwarna biru.
- Deteksi minimum untuk metamfetamin dalam urin ± 0,1 µg/mL.
- Amfetamin dan amin primer lainnya memberikan noda warna merah muda sampai merah dan reaksi kurang sensitif.
Pembacaan Hasil
Bandingkan nilai Rf ekstrak dengan Rf Standar. Rf x 100
b. Kromatografi Gas (KG) 1) Prinsip
Derivatisasi hasil ekstraksi dilarutkan dengan etil asetat dan pelarut tertentu sesuai dengan metodanya, diinjeksikan ke dalam injektor dengan kondisi tertentu, sehingga dapat ditentukan waktu retensi (Rt), luas area dan puncak kromatogram yang dihasilkan.
2) Peralatan
a) Derivatisasi
- Tabung sentrifus berskala - Labu ukur 10 mL
b) Kromatografi Gas
3) Reagen
a) Larutan standar kalibrasi
Dibuat dari larutan induk amfetamin, metamfetamin dan larutan standar internal dengan kadar 1 mg/mL dalam etanol. Larutan standar kalibrasi dibuat dari larutan induk dalam urin dengan konsentrasi antara 0-5 µg/mL dan standar internal konsentrasi 5 µg/mL.
b) Derivatisasi ada tiga pilihan, dipilih salah satu : (1) Larutan HFBA :
- 50 µL HFBA ditambahkan ke dalam residu kering.
- Tabung ditutup, kocok dengan vortex mixer dan diinkubasi pada suhu 75º C selama 20 menit.
- Buka tutup tabung dan keringkan dengan udara atau nitrogen pada suhu 30º C, kemudian larutkan dalam 50 µL etil asetat.
- Volume zat yang diinjeksikan dalam injektor 1-2 µL. (2) Larutan TFAA :
- Tambahkan 50 µL TFAA dan 100 µL etil asetat ke dalam ekstrak urin kering dalam tabung.
- Tabung dikocok dan diinkubasi pada suhu 60º C selama 20 menit.
- Campuran ini diuapkan hati-hati dengan mengalirkan gas nitrogen sampai volume akhir 50 µL pada suhu kamar. - Injeksikan 1-2 µL ke dalam injektor.
(3) MTBSTFA :
- Tambahkan 150 µL MTBSTFA dan 100 µL asetonitril ke dalam ekstrak urin kering dalam tabung.
- Tutup tabung dan panaskan pada suhu 90º C selama 10 menit dan biarkan pada suhu kamar selama 2 jam atau lebih.
Tambahkan 500 µL asetonitril pada tabung tersebut di atas.
Injeksikan 1-2 µL kedalam injektor.
4) Cara Kerja
a) Ekstraksi (Lihat Ekstraksi pada Metoda KLT) b) Pemeriksaan Kromatografi Gas
(1) Kondisi Kromatografi Gas tanpa derivatisasi - Detektor : FID, NPD, ECD
- Kolom : Packed column *) (2 m x 3-4 mm I.D) - dimetil silikon (OV-1, SE-30) - metal fenil silikon (OV-17) - Suhu : Injektor : 250 - 280º C
Oven : 90 - 280º C Detektor : 280 - 300º C
- Gas : Nitrogen dengan kecepatan alir 30 mL/mnt *) Capillary Column yang sesuai (Lihat lampiran 5)
(2) Kondisi Kromatografi Gas dengan derivatisasi :
- Detektor : FIO, NPO, ECO atau MS dengan ionisasi El- Kolom dan suhu seperti pada metoda tanpa derivatisasi.
Pembacaan Hasil
Bandingkan rekaman hasil pemeriksaan dengan standar.
c. Metoda Kromatografi Gas-Spektrometri Massa (KG-SM) 1). Prinsip
Ekstraksi sederhana terhadap senyawa-senyawa yang bersifat basa ke dalam pelarut organik, dari urin yang dibasakan pada pH 13 dan dijenuhkan dengan natrium sulfat anhidrat. Hasil ekstraksi kemudian dianalisis dengan GC-NPD. Identifikasi dilanjutkan dengan menggunakan GC-MSD yang sebelumnya di derivatisasi dengan MBTFA.
2). Alat
a) Tabung Reaksi dengan tutup ulir 12.5 ml
b) Transferpet 1 – 10 µl, 20 –200 ul dan 0,5 – 5,0 ml, c) Rotary Shaker
d) Vortex/minishaker e) Pipet pasteur f) Turbo Vap LV g) Gas Nitrogen h) Sentifus
i) Dry bath incubator j) Vial GC
k) GC/MSD/NPD
3). Reagen
Semua bahan kimia harus pro-analisa
a) Larutan stok amfetamin, metamfetamin, MDMA (metilendioksi- metamfetamin), MDA (metilendioksi-amfetamin) masing-masing 100 ppm dari Cerilliant dalam metanol
b) Larutan ISTD Difenilamin (DPA) 1000 ppm dalam metanol. c) Larutan KOH 6 M
d) TBME (tert butil metil eter), e) Natrium sulfat anhidrat f) Asetonitril
g) TMCS ( trimetilklorosilan)
h) MBTFA (N-metil-bis trifluoroasetamida)
4). Cara Kerja
a) Siapkan tabung reaksi berlabel masing-masing berisi 5 ml blanko akuades, 5 ml blanko urin, 5 ml larutan standar campuran dalam urin dengan kadar akhir 1 ppm , dan 5 ml sampel urin
b) Tambahkan setiap tabung reaksi
(1) 10 µL larutan ISTD diphenilamin (DPA) 1000 ppm (2) 0.5 ml KOH 6 M
(3) 2.5 ml TBME (tert butil metil eter),
(4) 2 g natrium sulfat anhidrat sambil di vortex (5) Tutup tabung reaksi dengan rapat
(6) Kocok di rotary mixer selama 20 menit (7) Sentifus selama 10 menit
(8) Pindahkan fasa organik 200 µL ke dalam vial berinsert dan tutup
(9) Siap di injekkan ke GC-NPD
(10) Jika suspek gol amphetamine lanjutkan, sisa fasa organik dengan penambahan 5 µL TMCS uapkan ad kering dengan aliran gas Nitrogen kemudian tambahkan 50 µL Acetonitril, vortex 1 menit secara perlahan kemudian tambahkan 25 µL MBTFA, vortex perlahan 1 menit, incubasi 70° C selama 10 menit, pindahkan ke vial berinsert, tutup siap injek ke GC- MSD.
5). Kondisi Alat Kromatografi Gas Spektrometri Massa
a). Alat Kromatografi Gas Nitrogen Phospourus Detector
Metode : StimNPD
Kolom : Kolom HP 5 , panjang 15 meter diameter 0,25 mm; film thickness 0,11 µm
Suhu injektor : 280°C Suhu Detektor 300°
C
Suhu Oven : T0 : 100°C, hold time 1 menit dengan
kenaikan 15°C/menit
T1 : 195°C, dengan kenaikan 30°C/menit T2 : 300°C, hold time 4 menit
Gas Pembawa ; Helium, N2, Compressed air Laju Gas : 1.2 mL/mnt, laju konstan Volume Injeksi : 5 µl
Waktu Retensi : Amfetamin, 2.35 menit Metamfetamin, 3.2 menit MDA, 5.6 menit
MDMA, 5.9 menit ISTD DPA, 6.5 menit Run Time 14.8 menit
b).Alat Kromatografi Gas Spektrometri Massa (HP 6890-5973)
Metode : Scan
Kolom : Kolom Ultra1, panjang 17 meter diameter 0,25 mm; film thickness 0,11 µm
Suhu injektor : 280o C Suhu Detektor 300°C
Suhu Oven : T0 : 80°C, hold time 1 menit dengan
kenaikan 15°C/menit
T1 : 250°C, hold time 2 menit dengan
kenaikan 30°C/menit T2 : 280°C, hold time 1 menit Gas Pembawa ; Helium, Split, Pressure : 18.74 psi Laju Gas : 1.4 mL/mnt, laju konstan
Volume Injeksi : 4 µl
Waktu Retensi : Amfetamin, 4.98 menit Metamftamin, 5.90 menit MDA, 7.79 menit
MDMA, 8.65 menit ISTD DPA, 7.63 menit Run Time 16.33 menit
Tabel IV.13
Ion Base Peak Dan Ion Lainnya Amphetamine, Methamphetamine, MDA, MDMA dan ISTD Setelah
Diderivatisasi
Senyawa Ion base peak Ion 2 Ion 3
Amphetamine-TFA 140 118 91 Methamphetamine-TFA 154 118 110 MDA-TFA 162 135 275 MDMA-TFA 154 162 135 ISTD DPA 169 Penafsiran hasil
Setelah konsumsi MDA, kadar dalam plasma dan urin dari bentuk asli zat dilaporkan kurang dari 0,4 dan 10 µg/mL secara berturutan. Untuk PMA kadar plasma dan urin kurang dari 0,2 dan 5 µg/mL, berturutan.
Pada kasus kecanduan kadar MDA dalam plasma adalah 5-25 µg/mL, sedangkan dalam urin adalah 50-150 µg/mL. Untuk PMA kadarnya adalah 0,3-2 µg/mL dalam plasma dan 5-200 µg/mL dalam urin.
Pada suatu penelitian menggunakan 1,5 mg/kg berat badan MDMA, kadar plasma maksimum yaitu 0,33 µg/mL, kadar dalam urin 1,4, 14 dan 23 µg/mL ditemukan setelah 1,5,10 dan 22 jam secara berturutan. Kematian terjadi pada kadar MDA sejumlah 2,3- 26 µg/mL dalam darah dan 46-175 µg/mL dalam urin, sedangkan untuk MDMA kadar yang menyebabkan kematian ditemukan 0,9-2 µg/mL dalam darah, untuk PMA kadar yang ditemukan 0,3-1,9 µg/mL dalam darah dan 6,0-175 µg/mL dalam urin.
Bentuk asli amfetamin telah terdeteksi dalam urin sampai 29 jam setelah satu kali konsumsi 5 mg afhetamin. Metamfetamin dalam bentuk asli juga terdeteksi sampai 23 jam setelah satu kali konsumsi. Analisis amfetamine yang positif biasanya berarti penggunaan amfetamin atau Metamfetamin dalam waktu 24-48 jam.
Beberapa hal yang harus diperhatikan. (1) beberapa zat dekongestan dan zat anorektik/pengurang nafsu makan yang mengandung efedrin dan fenilpropanolamin dapat mengakibatkan hasil positif amfetamin menggunakan tes EMIT dan RIA. (2) beberapa obat resep dokter seperti benzphetamine, fenfluramine, mephertamine, phenmetrazine dan phentermine dapat mengakibatkan hasil positif dengan tes immunoassay, (3) beberapa obat mempunyai metabolit berupa metamfetamin atau amfetamin.
Sehingga kadang perlu dilakukan pemeriksaan zat induk bila ada keraguan apakah subyek mengkonsumsi amfetamin/metamfetamin. 12. Derivat Amfetamindalam sisa bahan makanan, minuman, obat
a. Spektrofotometri
Metoda ini digunakan untuk pemeriksaan derivat amfetamin dalam sediaan tunggal dan dosis tinggi yang terdapat dalam sisa bahan makanan, minuman, obat yang diduga menyebabkan keracunan.
1) Prinsip
3,4 methylene dioxyamphetamin (MDA) diekstraksi dari sampel dengan pelarut kloroform dan kemudian dilarutkan dalam asam sulfuric 0,1 M diukur pada spektrofotometer pada 340-220 nm secara kuantitatif.
2) Peralatan
a) Corong pisah 250 mL
b) Tabung sentrifus & sentrifus c) Spektrofotometer & pencatat d) Kertas saring
3) Reagen
a) NaOH 20 % (20 g/dl)
Larutan 20 g NaOH dalam air. Larutkan dalam 100 mL air. b) NaOH 2 % (2 g/dl)
Larutan 2 % NaOH dalam air. Larutkan dalam 100 mL air. c) Kloroform
d) Asam Sulfat 0,1 M
- 2,8 mL asam sulfat pekat masukkan ke dalam 100 mL secara perlahan-lahan.
- Dinginkan dan larutkan ke dalam air sampai 1 L.
4) Cara Kerja
- Ke dalam corong pisah 250 mL, masukkan 10 mL spesimen (darah, urin, cairan lambung dan larutan standar darah MDA) dengan larutan NaOH 20 %.
- Ekstrak 2 kali dengan 100 mL klorofom (CHCl3) selama 5 menit.
- Cuci lapisan campuran HCCl3 dengan 10 mL NaOH 2 %,
kemudian dengan 20 mL air. Pisahkan lapisan air.
- Saring dengan kertas saring lapisan CHCl3. Ke dalam corong
pisah 250 mL yang lain tambahkan 5 mL 0,1 N Asam Sulfat dan ekstraksi selama 5 menit.
- Tempatkan 3 mL ekstrak Asam Sulfat dalam kuvet dan 0,1 N Asam Sulfat dalam cell standart.
- Catat absorban pada panjang gelombang 340 – 220 nm. Absorsikan pada 285 nm dan 234 nm.
- Ukur absorban pada panjang gelombang 285 nm.
b. Kromatografi Lapisan Tipis (KLT) 1) Prinsip
Residu hasil ekstraksi dielusi dengan eluen tertentu, kemudian ditetapkan secara KLT sehingga terbentuk noda yang berwarna khas. 2) Peralatan a) Alat KLT - Plat KLT (20 x 20 cm, 10 X 10 cm, 10 x 5 cm) - Tabung elusi - Pipet kapiler - Botol semprot b) Oven c) Lampu UV 3) Reagen :
a) Lapisan tipis Silica Gel. G (Lihat Lampiran 4) b) Eluen, pilih salah satu
A : - Metanol 100 mL - Amonia pekat 1,5 mL B : - Etil Asetat 85 mL
- Metanol 10 mL
- Amonia pekat 5 mL c) Larutan penampak noda, pilih salah satu :
(1) Fast Back K Salt :
Larutan A : Fast Back K Salt 1 % dalam air. Larutan B : Natrium hidroksida 1 M.
(2) Ninhidrin
Siapkan larutan ninhidrin 10 % dalam etanol (3) Fluoreskamin (fluram)
Siapkan larutan 10 mg fluoreskamin dalam 50 ml aseton d) Larutan Standar
Larutan standar derivat Amfetamin (MDMA, MDA, PMA dan lain-lain).
Siapkan larutan standar dalam metanol mengandung masing- masing 1 mg/mL.
4) Cara kerja :