C. Pemeriksaan Konfirmas
5) Pembacaan Hasil
Bandingkan nilai Rf ekstrak dengan Rf standar. Rf x 100 (Values)
Noda yang timbul dengan penampak noda
Senyawa UV Iodoplatinat Dragendorf
Morfin Fluoresensi Biru-Purple Orange dengan latar belakang kuning
b. Metode Kromatografi Gas (KG) 1) Prinsip
Residu hasil ekstraksi yang dilanjutkan dengan derivatisasi dilarutkan dengan pelarut kloroform methanol disuntikkan ke dalam kromatografi gas dengan kondisi tertentu sehingga diketahui waktu retensi (R), luas area dan puncak kromatogram yang dihasilkan. 2) Peralatan
a) Derivatisasi
(1) Tapered tube (tabung runcing berskala) 10 mL (2) Labu ukur 10 mL
b) Kromatografi Gas 3) Reagen
a) Larutan standar kalibrasi
Buat larutan induk morfin, Nalorfin dengan kadar 1 mg/mL dalam methanol.
Dari larutan induk tersebut buat larutan standar kalibrasi dalam akuades dengan konsentrasi antara 0-10 mg/mL morfin dan 5 mg/mL Nalorfin.
Nalorfin digunakan sebagai standar internal. b) Derivatisasi
(1) BSA (N, O-bistrimetil silil asetamin)
(2) MSTFA (N, metil N-trimetilsilil trifluro asetamid) (3) HMDS (Heksan metil disilasan)
(4) TMCS (Trimetil Klorosilan) (5) Piridin
(6) PFTA (Penta Fluoro Propionat Anhidrat) (7) Etil asetat
c) Kromatografi Gas (1) Gas nitrogen (2) Kolom
4) Cara Kerja
a) Ekstraksi (Lihat Ekstraksi pada Metoda KLT)
Hasil ekstraksi kemudian diderivatisasi dengan cara sebagai berikut :
Derivatisasi spesimen ada 2 pilihan (1) Sililasi
(a) Ekstrak urin diuapkan sampai kering dengan uap nitrogen.
(b) Residu yang terbentuk diderivatisasi dengan 20 mL N,O- bistrimetil sililasetamid (BSA) dalam vial tertutup dengan pemanasan 85° C selama 15 menit (BSA dapat diganti dengan campuran reagen silisasi dan piridin = 1:1 v/v 0. Campuran tersebut disuntikkan ke dalam kromatografi gas. Jika dipakai detector NPD, reagen sililasi seperti N-metil-N-trimetilsilil trifluoroasetamid (MSTFA) atau campuran heksa metildisilasan (HMDS), trimetil klorosilan (TMCS) dan piridin. Hasil derivatisasi diuapkan sampai kering dan dilarutkan kembali ke dalam 50 µL toluen
(c) Derivatisasi harus dipersiapkan segera sebelum dianalisa, karena reagen derivatisasi silil tidak stabil, 1-2 µL larutan standar kalibrasi dan hasil derivatisasi diinjeksi ke dalam injector.
(2) Asilasi
(a) Tambahkan 50 mL Penta Fluoropropionik Anhidrat (PFPA) ke dalam hasil ekstraksi urin, panaskan campuran tersebut selama 30 menit pada 65°C didalam tabung tertutup.
(b) Uapkan kelebihan reagen PFPA dengan uang nitrogen. (c) Larutkan residu dengan 50 µL Etil Asetat.
(d) Derivatisasi stabil dalam reagen selama beberapa bulan dan setelah penguapan reagen, stabil dalam waktu 24 jam, 1-2 µL larutan standar kalibrasi dan hasil derivatisasi diinjeksikan ke dalam injector.
b) Pemeriksaan Kromatografi Gas Kondisinya sebagai berikut : - Detektor : FID atau NPD
- Kolom : Packed column *) 2 m x 2-4 mm ID - Dimetil silikon (SE 30, OV-1)
- Fenil metil silikon, 50 % Fenil (OV-17) - Suhu : Oven 230° C
Injektor 275° C Detektor 275° C
- Gas : Nitrogen dengan kecepatan alir 70 mL/mnt *) Capillary Column yang sesuai (Lihat lampiran 5)
5) Pembacaan Hasil
c. Kromatografi Gas-Spektrometri Massa (KG-SM) 1). Prinsip :
Metabolit senyawa opiat dalam bentuk glukoronida di pecah/ hidrolisis dengan enzim β-glukuronida (H. Pomatia) dengan cara inkubasi 55ºC selama 2 jam menjadi senyawa opiat bebas yang kemudian dilanjutkan ditarik dengan cara ekstrkasi padat-cair dengan teknik SPE (solid
phase extraction) dan mengubahnya menjadi senyawa yang mudah
menguap (diderivatisasi) agar segera menjadi fasa gas pada waktu diinjeksikan ke GC-MS dan untuk menaikkan sesitivitas atau memperbaiki resolusi (KNNAP, 1979).
2). Alat :
a) Tabung Reaksi dengan tutup ulir 15 ml
b) Transferpet 1 – 10 ul, 20 –200 ul dan 0,5 – 5,0 ml c) Inkubator/penangas air
d) Vortex/minishaker e) Kolom SPE C18 f) Pipet pasteur g) Pipet pasteur
h) Tabung tutup asah i) Turbo Vap LV j) Gas Nitrogen k) Sentifuse l) Bath incubator m) pH meter n) Vial GC m) GC/MSD 3). Reagen
Semua bahan kimia harus pro-analisa
a). Larutan stok Morfin, Kodein, 6-Monoasetilmorfin (6-MAM) masing-masing 1000 ppm dari Cerilliant, larutan Morfin, Kodein, 6-MAM masing-masing 100 ppm dan 10 ppm
b). Larutan standar internal (ISTD) Nalorfin 1000 ppm,100 ppm dan 10 ppm
c). Larutan bufer asetat 2 M pH 5
d). Enzim β-glukoronidase (H. Pomatia) e). Larutan KOH 1 M
f). Resin C-18 (Sep-Pak) dari Waters g). Larutan bufer asetat 0.1 M
h). Metanol
i). Aquabides
k). Larutan penderivat BSTFA-TMCS [bis(trimetilsilil)trifluoro asetamida-trimetilklorosilan (99 :1)]
4). Cara Kerja
a) Siapkan tabung reaksi berlabel masing-masing berisi 2 ml blanko akuades, 2 ml blanko urin, 2 ml larutan standar campuran dalam urine, dan 2 ml sampel urin
b) Ke dalam masing-masing tabung reaksi tambahkan berturut- turut 100 µl larutan ISTD Nalorfin 10 ppm, 100 µl bufer asetat 2 M pH 5, 25 µl enzimβ-glukoronidase (H. Pomatia)
c) Vortex sebentar, lalu inkubasi selama 2 jam pada suhu 55ºC. d). Dinginkan sebentar lalu tambahkan 80 µl KOH 1 M.
e) Siapkan kolom resin C18 , cuci dengan 2 ml Metanol dan 2 ml
aquabides
f) Lewatkan sampel ke dalam kolom dengan menggunakan pipet pasteur.
g) Cuci kolom dengan 2 ml aquabides dan 1 ml bufer asetat 0.1 M.
h) Elusi kolom dengan etil asetat (4 x 1 ml) dan tampung cairan dalam tabung reaksi tutup asah.
i) Uapkan sampai kering cairan etil asetat dengan aliran gas nitrogen dalam alat turbo vap pada suhu 35º C.
j) Tambahkan 50 µl larutan BSTFA-TMCS (99:1)
h) Inkubasi kering dengan alat thermoline pada suhu 60ºC selama 20 menit.
i) Masukkan hasil ke dalam vial lalu tutup j) Siap diinjeksikan ke GC-MS
5). Kondisi Alat Kromatografi Gas Spektrometri Massa
Metode : Scan
Kolom :
Kolom kapiler, panjang 17 meter diameter 0,25 mm; film thickness 0,11 µm
Suhu injektor : 280º C Suhu Detektor : 300º C
Suhu Oven :
T0 : 140º C, dengan kenaikan 15º C /menit
T1 : 260º C, dengan kenaikan 20º C /menit
T2 : 310º C, hold time 1 menit
Gas Pembawa : Helium
Laju Gas : 1.0 mL/menit, laju konstan Volume Injeksi : 2 µl Waktu Retensi : 6-MAM: 9.30 menit Morfin: 8.98 menit Kodein: 8.67 menit
Tabel IV.12
Ion Base Peak Dan Ion Lainnya Untuk 6MAM, Morphine, Codeine Dan
ISTD Setelah Diderivatisasi BSTFA-TMCS
Senyawa Ion base peak Ion 2 Ion 3
6-MAM-TMS 399 340 287
Morfin-TMS 429 236 178
Kodein-TMS 371 234 196
Nalorfin-TMS 455 414 -
Penafsiran hasil
Kadar opiat dalam tubuh seseorang dan dalam urin ditentukan oleh metabolisme obat, kondisi fisik subyek, asupan cairan dan cara masuknya obat ke dalam tubuh. Biasanya opiat dapat dideteksi dalam urin sampai 3 hari.
Karena jalur metabolik yang sama, heroin, opium, kodein dan morfin sendiri dapat merupakan sumber adanya morfin dan M-3-G dalam urin. Sumber lain dapat berasal dari Etil morfin, folkodin, dan nikomorfin. Sehingga keberadaan morfin dalam urin tidak bisa mengindikasikan jenis opiate yang dikonsumsi. Dalam hal analisis tidak dapat mengidentikasi sumber morfin, maka perlu dilakukan analisis komponen induk (parent compound) atau pola metabolit utama yang diekskresikan dalam urin misal MAM dapat mengarahkan pada heroin. Dalam hal kodein, telah disepakati bahwa jika rasio kadar total kodein dibandingkan dengan total morfin kurang dari 0,5 dan kadar total morfin dalam urin lebih besar dari 200 ng/mL, kodein dapat disingkirkan sebagai sumber morfin yang ada dalam urin.
9. Kokain dalam spesimen manusia