DAFTAR LAMPIRAN
CARA KERJA Isolasi kapang endofit
Isolasi kapang dilakukan dengan metode sterilasi permukaan mengikuti metode yang dilakukan oleh Tomita (2003). Seluruh bagian sampel tanaman dicuci dengan air mengalir selama 10 menit, kemudian masing-masing bagian dipotong sepanjang 1-2 cm. Masing-masing bagian tanaman ini direndam di dalam cairan ethanol 75 % selama 1 menit, kemudian ke dalam cairan sodium hipoklorit 5,3 % selama 5 menit dan terakhir kembali ke dalam cairan ethanol 75
% selama 0,5 menit. Sampel yang sudah disterilisasi permukaan dipotong dengan ukuran ± 1 cm kemudian dibelah. Permukaan dalam sampel diletakkan di atas media agar CMM dalam cawan petri. Cawan petri diinkubasi selama ± 3 minggu pada suhu kamar. Setiap hari dilakukan pengamatan, apabila sudah ada kapang yang tumbuh dari sisi sampel segera dipindahkan ke dalam media PDA dalam cawan petri. Cawan petri diinkubasi pada suhu 28oC sampai kapang
tumbuh.
Kultivasi kultur vegetatif
Kultur vegetatif dilakukan pada 100 mL media PDY di dalam Erlenmeyer 250 mL. Media diinokulasi dengan 2 loop isolate fungi endofit yang tumbuh pada media PDA. Kultur vegetatif diinkubasi dalam orbital shaker incubator pada suhu 28oC selama 2 hari dengan pengocokan 150 rpm.
Kultivasi kultur produksi
Kultur produksi dilakukan dengan menggunakan media PDY atau media sesuai dengan rancangan percobaan yang akan dilakukan pada Erlenmeyer 250 mL yang berisi 100 mL media, Erlenmeyer 500 mL yang berisi 200 ml media atau Erlenmeyer 2000 mL yang berisi 1000 mL media. Kultur produksi diinokulasi dengan kultur vegetatif sebanyak 5-10 % volume media produksi. Kultur vegetative diinkubasi dalam orbital shaker incubator pada suhu 28oC
selama 10 hari dengan pengocokan 150 rpm. Ekstraksi senyawa aktif
Kaldu kultivasi dimasukkan ke dalam tabung sentrifus kemudian ditambah dengan pelarut organik dengan perbandingan volume 1:1. Tabung sentrifuse dikocok selama 1 jam menggunakan pengocok dengan kecepatan 200 stroke/menit, kemudian disentrifuse selama 10 menit pada 3000 rpm. Pada ekstraksi dengan volume 2L, kaldu kultivasi dimasukkan kedalam bejana dengan volume 5 L dan ditambahkan pelarut organik 1:1. Campuran kaldu hasil kultivasi dan pelarut organik diaduk dengan kecepatan 200 rpm selama 1 jam, kemudian disentrifuse untuk memisahkan pelarut organik. Fasa organik dipisahkan dari fasa air, dipekatkan dengan menggunakan centrifugal concentrator sampai diperoleh ekstrak tanpa pelarut.
Uji aktivitas biologis dengan metode brine shrimp lethality test (BSLT) a. Penetasan telurArtemia salina
Air garam dimasukkan ke dalam corong pisah 250 ml, kemudian ditambahkan telur A. Salina sebanyak 20 mg. Telur dibiarkan selama 24 jam dengan disinari lampu TL 18 W, telur yang tidak menetas dipisahkan sedangkan telur yang menetas dibiarkan lagi selama 24 jam dan siap untuk uji BSLT. b. Uji BSLT
Uji BSLT dilakukan sesuai dengan mengikuti metode yang dilakukan oleh Costa-Latufo et al., 2005). Ekstrak/fraksi yang sudah dipekatkan ditimbang, kemudian diencerkan dengan methanol sampai konsentrasi 10.000 mg/L. Larutan dihomogenkan, diencerkan menjadi konsentrasi 100 mg/L, 50 mg/L dan 25 mg/L sesuai kebutuhan pengukuran. Lima puluh µL ekstrak yang telah diencerkan dipipet ke dalam vial dengan 3 ulangan dan dibiarkan hingga methanol menguap. Setelah methanol habis menguap, kedalam vial ditambahkan 20 µl pelarut dimetilsulfoksida (DMSO) sampai ekstrak larut kembali, 2 ml larutan garam dan 10 ekor larva A. salina. Air garam kembali ditambahkan sampai volume total mencapai 5 ml. Larutan uji ini diletakkan di dekat lampu TL 18 W selama 24 jam, kemudian dihitung jumlah larva A. salina yang hidup dan mati. Blanko dilkerjakan dengan cara yang sama, tanpa penambahan ekstrak.
Larva mati karena perlakuan – Larva mati pada blanko % kematian larva : --- x 100 %
Jumlah larva awal Uji sitotoksisitas terhadap sel kanker payudara MCF-7
Sitotoksisitas senyawa aktif diuji terhadap sel kanker payudara MCF-7 dengan metode MTT kolorimetri yang dilakukan dalam plat yang terdiri dari 96 sumur. Sebanyak 2 x 103 sel dalam 100 µl medium dinokulasikan ke dalam
masing-masing sumur. Setelah diinkubasi selama 24 jam, 100 µl senyawa aktif ditambahkan ke dalam sumur dan diinkubasi selama 48 jam. Setelah inkubasi, 100 µl medium diambil dari masing-masing sumur dan ditambah 20 µl larutan stok MTT. Media diuapkan dengan cara aspirasi dan ditambah 200 µl dimetilsulfoksida (DMSO). Plat dikocok secara mekanik selama 10 menit, dibaca serapannya pada panjang gelombang 540 nm dan referensi panjang gelombang 630 nm dengan ELISAmicroplate reader.
(rata-rata absorbansi pada sumur percobaan) % penghambatan = --- x 100
(rata-rata absorbansi dalam sumur kontrol) Identifikasi morfologi kapang
Isolat kapang endofit yang memiliki aktivitas tertinggi diidentifikasi secara morfologi. Identifikasi morfologi dilakukan baik secara makroskopik maupun mikroskopik. Pada pengamatan makroskopik isolat kapang diamati berdasarkan warna, permukaan koloni, garis-garis radial atau lingkaran konsentrasinya. Pada pengamatan secara mikroskopik, terlebih dahulu isolat kapang dibuat slide culture. Media PDA berukuran ± 0,5 cm disiapkan dan diletakkan di atas kaca obyek. Kapang diambil dan ditanam di empat sisi PDA. Di atas agar ditutup dengan cover glass, kemudian diinkubasi di dalam cawan petri pada temperatur 25oC sampai terjadi pertumbuhan kapang. Setelah tumbuh, kapang dapat
diamati langsung dengan mikroskrop. Pengamatan juga dapat dilakukan dengan cara mengangkatcover glassdan meletakkannya di atas kaca obyek.
Pemurnian senyawa aktif
Pemurnian senyawa aktif dilakukan dengan metode kromatografi. Pemurnian diawali dengan kromatografi kolom menggunakan silika gel 60 dan dielusi dengan sistem gradien bertahap yang terdiri dari campuran heksana, etil asetat dan methanol dengan perbandingan (1:0:0, 1:1:0, 0:1:0, 0:1:1 dan 0:0:1). Masing-masing fraksi yang terelusi dipekatkan, ditimbang dan diuji sitotoksisitasnya dengan metode brine shrimp lethality test (BSLT) dengan penentuan LC50. Pemurnian lanjutan dilakukan dengan menggunakan KCKT.
Adapun sistem KCKT yang digunakan adalah Water 2695, dengan detektor Photodiode Detector Array (PDA), kolom C18 Puresil (5; 4,6x150mm) volume injeksi 100 uL/injeksi dengan kecepatan alir 1 mL/menit, tekanan kolom 1267 psi. Sampel dielusi secara gradien menggunakan asetonitril dan air dengan perbandingan dari 15 % sampai 100 % selama 33 menit. Puncak yang diduga sebagai senyawa aktif ditampung, dan dipekatkan.
Identifikasi struktur kimia senyawa aktif
Bobot molekul dan rumus molekul senyawa aktif ditentukan dengan Spectrum ESI-MS (LCT Premier-XE Waters). Gugus fungsional senyawa ditentukan dengan FTIR (Shimadzu 8300) dan struktur molekul senyawa
ditentukan dengan, 1HNMR dan 13CNMR (Bruker AV-500 (500 MHz) serta QTOF-MS-MS (XEVO Waters)
Analisis 8-HODE
Semua kaldu fermentasi diekstrak dengan etil asetat dengan perbandingan volume 1:1. Fase organik dipisahkan dari fasa air, diukur volumenya, dan dipekatkan menggunakan centrifugal concentrator disertai pengurangan tekanan. Ekstrak tanpa pelarut dilarutkan kembali menggunakan metanol dengan grade high pressure liquid chromatography (HPLC) dengan volume 1/100 volume awal. Ekstrak dianalisis dengan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) Waters menggunakan kolom C18 (Puresil, 150 x 4,6 mm) dan dielusi secara gradien dengan asetonitril: air dari 15% sampai 100% selama 33 menit. Puncak HODE mempunyai waktu retensi 14,6-14,8 menit dan serapan UV 233- 234 nm. Luas area kromatogram masing-masing perlakuan dibandingkan dengan kurva standar untuk mengitung konsentrasi 8-HODE.
Pembuatan kurva standar 8-HODE
Kurva standar 8-HODE dibuat dengan membuat grafik antara luas area kromatogram dan konsentrasi 8-HODE. 8-HODE satandar diperoleh dari pemurnian hasil kultivasi. Deret standar 8-HODE dibuat pada konsentrasi 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, dan 700 mg/L. Masing-masing larutan standar dianalisis dengan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) Waters menggunakan kolom C18 (Puresil, 150 x 4,6 mm) dan dielusi secara gradien dengan asetonitril: air dari 15% sampai 100% selama 33 menit. Puncak HODE mempunyai waktu retensi 14,6-14,8 menit dan serapan UV 233-234 nm.