FUNGI ISOLATED FROM MEDICINAL PLANT ORIGINATED FROM EAST LOMBOK.
HASIL DAN PEMBAHASAN Isolasi kapang endofit dari tanaman obat
Kapang endofit diisolasi dari bagian batang dan daun tanaman obat sumber isolat. Batang dan daun disterilisasi permukaan untuk menghilangkan mikroba yang ada pada permukaan tanaman, sehingga diharapkan mikroba yang tumbuh pada media adalah kapang yang berada dalam jaringan tanaman. Kapang yang di[ilih untuk dimurnikan ke dalam media PDA adalah kapang yang tumbuh minimal setelah 2 hari inkubasi pada media CMM. Hal ini dilakukan untuk meminimalkan kemungkinan mengisolasi kapang yang tumbuh dari permukaan bagian tanaman.
Hasil isolasi kapang endofit dari 34 sampel tanaman obat disajikan dalam Tabel 1. Isolasi menghasilkan total 75 kapang endofit yang terdiri dari 57 (76%) berasal dari sampel daun dan 18 (24 %) berasal dari batang. Kolonisasi kapang endofit berdasarkan perhitungan menurut Tomita et al., (2003) dan Khan et al., (2007) menunjukkan pada daun kolonisasi mencapai 70,58 %, sedangkan kolonisasi kapang pada batang hanya 32,35 % (Lampiran 1). Radu dan Kqueen (2002) juga melaporkan hasil bahwa kolonisasi kapang endofit di daun tanaman obat yang disambil sampelnya dari Malaysia mencapai 90,9 %, jauh lebih besar dibandingkan dengan tingkat kolonisasi di batangnya. Akan tetapi hasil yang berbeda diperoleh oleh Tomita (2003) dan Sunet al (2008). Tomita melaporkan frekuensi kolonisasi kapang endofit pada dahan tanaman obat yang diambil dari Hokaido mencapai 73 % pada dahan dengan umur kurang dari 1 tahun, dan mencapai 93.7-100 % pada dahan/batang yang berumur lebih dari 1 tahun.
Khan et al., (2007) melaporkan dari sampel daun yang diambil dari sekitar Universitas Karachi frekuensi kolonisasinya 0%, sedangkan dari sampel batang frekuensi kolonisasinya 2,5 %. Sun et al., (2008) melaporkan hasil isolasi kapang endofit tanaman obat dari Kebun Raya Beijing, frekuensi kolonisasi kapang pada daun berkisar 2-17,5 % sedangkan batang yang berumur 1 tahun frekuensi kolonisasi berkisar 12-75%, batang berumur 3 tahun frekuensi kolonisasinya mencapai 86-100%.
Tabel 1 Kapang endofit yang berhasil diisolasi dari bagian tanaman obat
Nama Tanaman Isolasi Kapang
Daun Batang
Nona Makan Sirih (ClerodendromthomsonaeBalf F) 1 - Belimbing Star (Averrhoa carambolaL) - - Dadap (Erythirna subumbrans(Hask.) Merr) 1 1 Jambu Biji (Psidium guajava, Linn.) 2 2 Kemangi (Ocimum santumL) - - Kembang Sepatu (Hibiscus rosa-sinensisL) 1 1 Tapak Dara (Catharantus roseus(L.) G. Don) - 1 Patikan Kerbau (Euphorbia hirta, Linn) - 1 Lengkuas (Alpinia galanga, Linn., Willd) - 2 Jengger ayam (Celosia cristata) 4 - Mengkudu (Morinda citrifolia, Linn.) 1 1 Pare (Momordica charantiaL) 1 1 Pegagan (Centella asiatica, (Linn), Urb) 5 - Rumput Mutiara (Hedyotis corymbosa(L.] Lamk) 2 - Bayam Duri (Amaranthus Spinousus, Linn.) 1 - Jarak Pagar (Jatropha curcas) 1 1 Bangle (Zingiber purpureumRoxb) - 1 Krokot (Portulaca leavis,Wall) - 1 Bandotan (Ageratum conyzoidesL.) 4 - Pakis (Cibotium barometz) 3 - Jamplung (Calophylum inophylum) - 4 Kunyit (Curcuma longaLinn.) 1 - Serai (Cymbopogon nardus(L.) Rendle) 1 1 Bunga Pukul Empat (MirabilisjalapaLinn.) 4 2 Pecut Kuda (Stachytarpheta jamaicensis(L) Vahl) 3 2 Katu (Sauropus androgynus(L,) Merr.) 5 - Lemboke/Awar-awar (Ficus septicaBurm.L) 2 - Jeruk Nipis (Citrus aurantifolia) 2 - Meniran (Phylanthus urinaria, Linn.) - 1 Tembelekan (Lantana camaraLinn.) - - Beluntas (Pluchea indica(L.) Less.) 4 2 Alpukat (Persea gratissimaGaertn) 3 - Daruju (Acanthus Ilicifolius) 2 1 Sangitan (Sambucus javanicaReinw) 1 -
Dari laporan beberapa peneliti yang menghitung frekuensi kolonisasi kapang endofit pada tanaman obat, terlihat bahwa apabila sampel tanaman berbatang keras (Tomitaet al., 2003 dan Sunet al., 2008) maka frekuensi koloni akan lebih besar pada batang dibandingkan dengan daun. Frekuensi koloni akan meningkat dengan meningkatnya umur batang yang digunakan sebagai sampel. Dalam penelitian ini kebanyakan tanaman obat yang digunakan sebagai sampel adalah tanaman perdu, dan apabila tanaman keras diambil batang yang masih muda. Hal ini yang dapat menjelaskan mengapa frekuensi koloni pada daun lebih tinggi dibandingkan koloni pada batang, seperti yang dilaporkan oleh Radu dan Kqueen (2001).
Penapisan sitotoksisitas awal dengan metode BSLT
Metabolit sekunder mikroba adalah salah satu bahan alam penting sebagai sumber bahan baku obat. Untuk dapat mengidentifikasi senyawa bioaktif yang dihasilkan oleh mikroba perlu dilakukan penapisan. Menurut Vlietinck dan Apers (2004) penapisan terdiri dari beberapa tahap yang terdiri dari: pra penapisan, penapisan, pengawasan dan penapisan sekunder. Pra penapisan dilakukan untuk mendapatkan kandidat senyawa bioaktif dengan cara cepat. Suatu methode dapat digunakan untuk prapenapisan apabila metode tersebut dapat dilakukan secara cepat, mudah, terpercaya, murah, sensitif dan hanya memerlukan bahan dalam jumlah sedikit (Ghisalberti, 2008).
McLaughin et al., (1998) melaporkan bahwa metode pengujian ekstrak terhadap larva udang yang disebut dengan brine shrimp lethality test (BSLT) adalah metode pra penapisan untuk aktivitas antikanker. Larva Artemia salina dianggap mewakili organism zoologis untuk uji lethalitas secarain vivo.Hasil uji yang mereka lakukan untuk membandingkan uji letalitas terhadapA. salinadan uji hambatan proliferasi terhadap karsinoma nasofaring menunjukkan adanya korelasi positif dari sifat toksisitas senyawa uji terhadap kedua jenis uji.
Cash (1994) di dalam Kanwar (2007) melaporkan hasil uji komparasi aktivitas enzim yang terdapat di dalam A. salina dan jaringan hati tikus yang secara spesifik memecah dinukleosida tetrafosfat. Semua substrat enzim yang berasal dari purin maupun pirimidin dinukleosida tetrafosfat ternyata menunjukkan Vmaksdan Km yang sama, baik untuk enzim yang berasal dari A. salina maupun hati tikus. Inhibisi oleh nukleotida terhadap enzim yang berasal
dari keduanya juga menunjukkan hasil yang sama. Hasil uji tersebut mendukung hasil uji yang dilakukan oleh McLaughlin et al., (1998) untuk dapat menggunakanA. salinasebagai ujipra screeninguntuk senyawa antikanker. Tabel 2 Orientasi konsentrasi penapisan sitotoksisitas dengan metode BSLT
Kode isolat Pelarut
Organik Uji BSLT (% kematianA. salina) 1000 mg/L 100 mg/L 10 mg/L ENLT 35. 3d. 2 Butanol 93.33 93.33 6.67 Etil asetat 93.33 93.33 3.33 Diklorometan 93.33 13.33 13.33 ENLT 41. 5d Butanol 86.67 73.33 20.00 Etil asetat 86.67 90.00 13.33 Diklorometan 90.00 46.67 13.33 ENLT 35. 3d. 1 Butanol 100.00 100.00 3.33 Etil asetat 100.00 100.00 20.00 Diklorometan - 3.33 -
Meyer et al. (1982) melaporkan bahwa suatu ekstrak tanaman dianggap sebagai bioaktif apabila ekstrak tersebut memiliki nilai LC50lebih kecil atau sama
dengan 1000 mg/L, pendekatan yang sama juga dilakukan oleh Amara et al. (2008) untuk penapisan ektrak kasar dari tanaman obat. Berdasarkan hasil yang dilaporkan oleh Meyer et al. (1982) dan Amara et al. (2008) maka dilakukan orientasi konsentrasi pengujian untuk ekstrak bahan aktif dari kapang endofit dengan melihat angka mortalitas larva udang yang dikenai perlakuan ekstrak bahan aktif kapang endofit.
Hasil orientasi konsentrasi pada Tabel 2 menunjukkan hasil yang berbeda dengan laporan Meyer et al. (1982) dan Amara et al. (2008). Hasil uji pada konsentrasi 1000 mg/L ternyata semua ekstrak menunjukkan tingkat kematian larva diatas 90 %. Hasil pengujian menunjukkan bahwa pemakaian konsentrasi ekstrak kasar pada konsentrasi 1000 mg/L tidak selektif digunakan untuk menapis ekstrak bahan aktif dari kapang endofit. Dari hasil ini dapat ditarik asumsi bahwa bahan aktif dari ekstrak kasar tanaman konsentrasinya lebih kecil dibandingkan bahan aktif dalam ekstrak kasar fungi. Berdasarkan hasil tersebut penapisan awal bioaktifitas ekstrak kapang dengan metode BSLT dilakukan pada konsentrasi 100 mg/L.
Tabel 3 Hasil penapisan toksisitas metabolit sekunder kapang endofit pada konsentrasi 100 mg/L
Kode isolat Uji BSLT
(% kematian )
Butanol Etil asetat Diklorometan
ENLT 1.3d 53.33 100.00 10.00 ENLT 6.6d.1 70.00 100.00 13.33 ENLT 8. 2d 13.33 100.00 43.33 ENLT 6.6d.2 - 80.00 90.00 ENLT 11. 4d 86.67 90.00 - ENLT 11. 5d 76.67 90.00 86.67 ENLT 12. 2d. 1 3.33 26.67 33.33 ENLT 12. 3d. 1 13.33 93.33 16.67 ENLT 7.2d.1 13.33 100.00 13.33 ENLT 12. 3d. 2 26.67 80.00 3.33 ENLT 18.4d. 1 23.33 66.67 36.67 ENLT 18. 4d. 2 43.34 73.34 6.67 ENLT 18. 5d. 2 - 6.67 - 3.33 6.67 ENLT 18. 5d. 1 73.33 66.67 63.33 ENLT 23. 5d 66.67 86.67 3.33 ENLT 24. 3d 76.67 86.67 13.33 ENLT 35. 3d. 2 93.33 93.33 13.33 ENLT 41. 5d 73.33 90.00 46.67 ENLT 20.2d 53.33 73.33 16.67 ENLT 35. 3d. 1 100.00 100.00 3.33 ENLT 39.3d.2 90.00 20.00 3.33 ENLT 40.5d 33.33 26.67 6.67 ENLT 42.8d 23.33 36.67 23.33 ENLT 26. 4d 66.67 96.66 6.67 ENLT 47. 3d 60.00 96.67 16.67 ENLT 47 5d. 1 46.67 93.33 6.67 ENLT 47. 5d. 2 86.67 63.33 13.33 ENLT 49. 3d. 1 30.00 80.00 0.00 ENLT 74. 3d.2 10.00 100.00 13.33 ENLT 101.3d 40.00 100.00 10.00 ENLT 90.4d.2 40.00 26.67 6.67 ENLT 62.4d 60.00 36.67 66.67 ENLT 108.4d.2 60.00 100.00 0.00 ENLT 107.4d -3.33 36.67 76.67 ENLT 79.2d.1 -3.33 53.33 66.67 ENLT 67.4d.2 10.00 50.00 73.33
Tabel 3 menunjukkan hasil penapisan bioaktivitas awal kapang endofit pada konsentrasi 100 mg/L. Hasil penapisan menunjukkan 9 ekstrak mampu
menyebabkan kematian larva lebih besar dari 90% pada konsentrasi 100 mg/L. Sembilan ekstrak yang menunjukkan bioaktivitas terdiri dari 8 ekstrak yang disari dengan etil asetat dan 1 ekstrak yang disari dengan butanol. Hasil penapisan ini menunjukkan bahwa sebagian besar ekstrak bioaktif adalah ekstrak yang disari dengan etil asetat. Beberapa penelitian sebelumnya melaporkan ekstrak butanol (Kumala, et al., 2006) dan ekstrak etil asetat (Teles, et al., 2005; Guimaraes et al., 2010; Qin et al., 2009) dari kapang endofit bersifat bioaktif antikanker. Dari laporan yang sudah dipublikasikan sebelumnya lebih banyak ekstrak etil asetat yang bersifat bioaktif dibandingkan dengan ekstrak butanol.
Aktivitas biologis suatu senyawa terjadi karena adanya interaksi molekul senyawa aktif dengan gugus fungsional dari reseptor. Interaksi antara kedua molekul tersebut dapat berlangsung karena adanya ikatan kimia tertentu didalam molekul senyawa aktif (Purwanto dan Susilowati, 2000). Senyawa aktif yang tersari oleh pelarut butanol adalah senyawa-senyawa yang bersifat polar. Senyawa polar pada umumnya mengandung ikatan ionik atau kovalen. Albert (1985) melaporkan bahwa senyawa dengan tingkat ionisasi yang tinggi pada umumnya mempunyai sifat bakteriostatik sehingga bersifat antibiotik. Sedangkan Raguse et al (2002) dan Powers dan Hancock (2003) juga melaporkan aktivitas antibakteri dari peptida-peptida yang bersifat kationik. Penapisan sitotoksisitas ekstrak dengan penetapan LC50 menggunakan
metode BSLT
Analisis median konsentrasi letal (LC50) adalah parameter yang lebih teliti
untuk penapisan bahan alam dengan metode BSLT. Dalam analisis tersebut akan ditetapkan konsentrasi dari masing-masing ekstrak yang mampu menyebabkan kematian 50% larva udang yang diuji. Sembilan ekstrak yang diperoleh dari penapisan awal, dilakukan penapisan lanjutan dengan menetapkan LC50dari masing-masing ekstrak.
Tabel 4 menunjukkan hasil penapisan berdasarkan LC50 dari 9 ekstrak
hasil penapisan awal. Hasil penapisan lanjutan tersebut menunjukkan bahwa ekstrak menggunakan etil asetat dari kapang ENLT 74.3d.2 merupakan ekstrak yang mempunyai nilai LC50 terkecil. Hasil tersebut menunjukkan bahwa ekstrak
dari hasil penyarian menggunakan etil asetat dari kapang ENLT 74.3d.2 merupakan ekstrak yang paling aktif dan prospektif untuk dilakukan pemurnian
dan penapisan lebih lanjut. Isolat aktif ENLT 74.3d.2 didepositkan di koleksi kultur Balai Pengkajian Bioteknologi BPPT dan diberi kode BioMCC-FE00283. Tabel 4 Hasil penapisan berdasarkan penetapan LC50
Kode isolat Pelarut LC50 (mg/L)
ENLT 6.6d.1 Etil asetat 58,74
ENLT 7.26.1 Etil asetat 66,07
ENLT 8.2d Etil asetat 110,59
ENLT 9.3d.1 Etil asetat 57,54
ENLT 35.3d.1 Butanol 77,62
ENLT 35.3d.1 Etil asetat 79,57
ENLT 74.3d.2 Etil Asetat 30,21
ENLT 101.3d Etil asetat 44,60
ENLT 108.4d.2 Etil asetat 46,47
Isolat aktif BioMCC-FE00283 adalah isolat yang diisolasi dari tanaman pakis-pakisan (Cibotium barometz). Sampai saat ini belum ditemukan publikasi tentang aktivitas kapang endofit yang diisolasi dari tanaman pakis. Tanaman pakis secara tradisional digunakan untuk pengobatan reumatik dan paralisis. Yang et al., (2007) melaporkan bahwa fraksi etil asetat dari ekstrak umbi pakis dengan etanol mengandung sterol, sedangkan Yuan et al., (2004) melaporkan berhasil mengindetifikasi 12 jenis senyawa dari tanaman pakis. Kedua belas jenis senyawa tersebut adalah asam palmitat, metil ester palmitat, asam linoleat, asam oleat, metil ester stearat, etil ester stearat, 4′-Hidroksiasetanilid, Sukrose,C asam lemak jenuh dengan jumlah C 27, protosatekhualdehid, β-sitosterol, Vanillin, dan 3,4′,5,7-tetrahidroksflavon. Meskipun berhasil menidentifikasi senyawa yang terdapat dalam C. barometz, akan tetapi mereka belum melaporkan bioaktivitas dari masing-masing senyawa tersebut.
Identifikasi kapang aktif
Pengamatan dibawah mikroskop terhadap kapang BioMCC FE-00283 menunjukkan bahwa kapang tersebut mempunyai konidiofor yang tegak, berwarna coklat, tidak bercabang dan lurus dengan panjang lebih dari 30 µm. Sedangkan konidia berbentuk subelipsoidal yang terdiri dari 4 sekat, dimana
sekat kedua merupakan sekat yang paling lebar dengan dimensi 4-5 µm x 10-12 µm. Ciri-ciri morfologi kapang BioMCC FE-00283, terutama bentuk konidia yang bersekat 4 adalah ciri spesifik dari genusCurvularia.
a b
c d
e f
g h
Gambar 11 Morfologi kapang BioMCC FE-00283 dibawah mikroskop dengan perbesaran 1000 kali (a, b) dan morfologiCurvularia affininis(c),C. brachyspora (d), C. clavata (e), C. lunata(f), C pallescen (g) dan C. prasadji(g) (Watanabe, 2002)
Perbandingan bentuk dan ukuran konidiofor dan konidia dengan spesies- spesies genus Curvularia dan kapang BioMCC FE-00283 disajikan pada Gambar 10. Apbila dibandingkan bentuk dan ukuran konidiofor maupun konidia, morfologi kapang BioMCC FE-00283 paling mendekati dengan spesiesC. lunata dan C palescense, dilihat dari bentuk konidiofor yang berbeda dengan spesies lain. Pembeda spesifik antar kedua spesies adalah panjang konidiofor, dimanaC lunata mempunyai panjang konidiofor adalah 160-300 µm sedangkan panjang konidiofor dari C. palescense adalah berkisar 46 µm (Watanabe, 2002). Dari hasil pengamatan dimensi morfologi, panjang konidiofor dari kapang BioMCC FE-00283 yang terukur pada pengamatan mikroskop rata-rata lebih dari 60 µm. Hasil ini menunjukkan bahwa morofologi kapang BioMCC FE-00283 paling mendekati dengan deskripsi dari kapangCurvularia lunata.
Kapang endofit C. lunata pernah dilaporkan berhasil diisolasi oleh beberapa peneliti lain. Kharwar et al., (2008), melaporkan berhasil mengisolasi C. lunata dari tanaman Catharanthus roseus (L) G.Don sedangkan Verma dan Kharwar (2006) mengisolasinya dari daun nimba.
Dalam kaldu kultivasi senyawa aktif yang dihasilkan oleh kapang biasanya berada dalam konsentrasi yang kecil dalam suatu cairan yang mengandung sel kapang, medium maupun produk metabolit lainnya. Untuk meningkatkan konsentrasi dari senyawa aktif, maka perlu dilakukan pemisahan senyawa tersebut dari pengotornya. Pemisahan yang dimaksudkan untuk pemurnian senyawa aktif pada dasarnya dilakukan untuk mengetahui senyawa mana sebenarnya yang menunjukkan aktivitas dan untuk mengetahui karakter biologis maupun kimia dari senyawa tersebut (Spainhour, 2005). Ekstrak yang disari menggunakan etil esetat dari kapang endofit C. lunataBioMCC FE 00283 menunjukkan aktivitas terbesar terhadap larva A. salina (Tabel 4), akan tetapi belum diketahui senyawa apa yang berperan dalam aktivitas tersebut. Untuk dapat menentukan senyawa yang berperan dalam aktivitas tersebut perlu dilakukan pemurnian lebih lanjut terhadap ekstrak etil asetat dari kapang C. lunata BioMCC FE 00283. Pemurnian dilakukan dengan panduan uji sitotoksisitas agar dapat diperoleh fraksi maupun senyawa murni yang mempunyai aktivitas sitotoksik. Pada bagian kedua dari penelitian ini akan dilakukan pemurnian senyawa aktif dari kapang endofit C. lunata BioMCC FE 00283 dengan panduan uji BSLT dan uji sitotoksitas terhadap sel MCF-7 untuk
senyawa murninya. Disamping itu akan dilakukan identifikasi struktur senyawa aktif yang dihasilkan oleh kapang endofit C. lunata BioMCC FE 00283 yang bersifat sitotoksik terhadap sel kanker MCF-7.
SIMPULAN
Isolasi kapang endofit tanaman obat dari Lombok Timur, Nusa Tenggara Barat dilakukan dengan metode strerilisasi permukaan. Dari 34 jenis sampel tanaman diperoleh 75 kapang endofit yang terdiri dari 57 dari sampel daun dan 18 dari sampel batang. Tingkat kolonisasi kapang pada daun mencapai 70% dari total sampel, sedangkan tingkat kolonisasi pada batang hanya 32% dari total sampel.
Metabolit sekunder dari 36 kapang endofit yang berhasil diisolasi diuji bioaktivitasnya terhadap larva Artemia salina. Konsentrasi selektif untuk penapisan ekstrak metabolit sekunder kapang endofit tanaman obat adalah 1000 mg/L. Penapisan awal terhadap 108 ekstrak metabolit sekunder kapang menghasilkan 9 ekstrak yang dapat menyebabkan mortalitas 100 % terhadap larvaA. salina .
Penapisan lanjutan terhadap ekstrak aktif pada penapisan awal dilakukan dengan menghitung LC50 ekstrak pada pengujian terhadap A. salina.
Penapisan lanjutan menghasilkan ekstrak hasil penyarian menggunakan etil asetat dari kapang endofit ENLT 74.3d.2 dengan LC50sebesar 30,21 g/L.
Kapang endofit ENLT 74.3d.2 diidentifikasi secara morfologi dibawah mikroskop. Ciri-ciri morfologi kapang ENLT 74.3d.2 paling sesuai dengan deskripsi morfologi kapang Curvularia lunata. Kapang aktif C. lunata disimpan dalam koleksi kultur dan mendapatkan kode BioMCC FE-00283.