U
n
it
ab
so
rb
a
n
s
i
Waktu retensi (menit)
A U 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 nm 250.00 300.00 350.00 233.0 368.6 a A U 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 Minutes 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00
15
.8
59
b
Waktu retensi (menit)
Waktu retensi (menit)U n it ab so rb an si AU 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 nm 250.00 300.00 350.00 233.0 368.6 b
menit polaritas senyawa lebih kecil karena fasa gerak lebih didominasi asetoniril dibandingkan air.
Hasil analisis menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi terhadap senyawa hasil pemurnian menunjukkan bahwa senyawa mempunyai puncak tunggal dengan tingkat kemurnian diatas 95 %, dan serapan ultra violet tunggal (Gambar 12). Hasil ini menunjukkan tingkat kemurnian senyawa aktif cukup tinggi untuk dilakukan penentuan struktur.
Gambar 13 Kromatogram dan spektra serapan uv dari senyawa aktif
Senyawa hasil pemurnian pada konsentrasi 5 mg/L kemudian diuji terhadap sel kanker (human carcinoma breast MCF-7) (Tabel. 6). Hasil uji penghambatan proliferasi sel menunjukkan bahwa pada konsentrasi yang sama terjadi peningkatan aktifitas penghambatan dari senyawa aktif dibandingkan fraksi aktif. Hasil ini menunjukkan bahwa senyawa aktif dari kapang endofit BioMCC FE-00283 berhasil dimurnikan dan mempunyai kemampuan menghambat proliferasi sel kanker payudara MCF-7.
Hasil uji penghambatan proliferasi sel kanker terhadap fraksi etil asetat juga menunjukkan bahwa metode BSLT dapat digunakan sebagai uji awal penapisan sitotoksisitas seperti yang dilaporkan oleh McLaughlin et al (1998). Tabel 6 juga menunjukkan aktifitas senyawa aktif dari kapang endofit BioMCC FE-00283 dibandingkan dengan obat antikanker yang sudah beredar dipasaran (Cisplatin). Hasil tersebut menunjukkan bahwa senyawa aktif kapang endofitC. lunata BioMCC
A U 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 Minutes 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00
U
n
it
ab
so
rb
a
n
si
Waktu retensi (menit)
A U 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 nm 250.00 300.00 350.00 233.0 368.6
FE-00283 pada konsentrasi yang sama (5 mg/L) mampu menghambat proliferasi sel MCF-7 lebih banyak, bahkan saat konsentrasi cisplatin ditingkatkan sampai 16 mg/L daya hambat cisplatin terhadap proliferasi sel MCF-7 masih sedikit dibawah daya hambat senyawa aktif pada konsentrasi 5 mg/L. Beberapa peneliti lain juga melaporkan hasil uji terhadap sel MCF-7 dari senyawa aktif kapang endofit yang sudah dimurnikan. Wijeratneet al.,(2008) berhasil memurnikan seskuiterpen quinon dari kapang Phyllosticta spinarum kapang endofit tanaman Platycladus orientalis
yang mempunyai IC50 1.5 mg/L. Sedangkan Zhan et al, (2004) melaporkan bahwa
senyawa curvularin yang diisolasi dari Penicilium sp, kapang endofit tanaman
Fagllugia paradoxa mempunyai IC50 sebesar 2.2-3.6 mg/L. Membandingkan hasil-
hasil tersebut, senyawa aktif yang dihasilkan oleh kapang endofit BioMCC FE-283 mempunyai prospek bagus untuk dikembangkan sebagai anti kanker.
Tabel 6 Hasil uji penghambatan proliferasi terhadap sel MCF-7
Sampel Penghambatan proliferasi sel MCF-7 (%)
Fraksi aktif (5 mg/L) 8.82
Senyawa aktif (5 mg/L) 28.77
Cisplatin (5 mg/L) 15.95
Cisplatin (10 mg/L) 16.91
Cisplatin (15 mg/L) 26.32
Senyawa aktif murni yang diperoleh selanjutnya ditentukan bobot molekul dan struktur molekulnya menggunakan ESI-MS, FTIR, 1HNMR, 13C NMR, dan QTOF
MS-MS. Hasil analisis gugus fungsional menggunakan FTIR (Gambar 13) menunjukkan senyawa aktif mempunyai gugus fungsional OH (serapan lebar pada daerah panjang gelombang diatas 3000 nm), C dengan ikatan rangkap yang berikatan dengan H (serapan pada 3005.9 nm), C ikatan tunggal yang berikatan dengan H (serapan tajam pada 2854,4 nm; 2926,8 nm dan 2952,8 nm), gugus karbonil (serapan tajam pada panjang gelombang 1709,8 nm) dan ikatan atom C dengan O (serapan pada 1408,6 nm) (Silverstein et al., 1991). Hasil tersebut menunjukkan bahwa senyawa merupakan senyawa asam karboksilat alifatik yang mempunyai ikatan antar C tunggal dan rangkap, mempunyai gugus hidroksi.
Gambar 14 Spektra FTIR senyawa aktif kapang endofit BioMCC FE-283
Dari hasil analisis menggunakan ESI-MS diketahui bahwa senyawa aktif yang dihasilkan oleh kapang endofit BioMCC FE-00283 memiliki bobot molekul 296 (Gambar 14). Spektra MS positif menunjukkan serapan tertinggi pada bobot 279 yang mengacu pada berat molekul senyawa ditambah OH- . Sedangkan spektra MS
negatif menunjukkan serapan tertinggi pada bobot 341dan 295 yang mengacu pada bobot molekul senyawa dikurangi HCOO- (341) dan bobot molekul ditambah H+
(295). Pusat data dari program LCT Premier-XE menunjukkan bahwa senyawa dengan berat molekul tersebut memiliki 18 atom C, 32 atom H dan 3 atom O, sehingga rumus molekul senyawa diperkirakan adalah C18H32O3
Gambar 15 Spektra spektroskopi massa senyawa aktif kapang endofit BioMCC FE-283
Hasil analisis senyawa aktif dengan 13C-NMR menunjukkan bahwa senyawa tersebut mempunyai 18 C (Lampiran 5). Sedangkan analisis dengan 1H-NMR
a
(Lampiran 6), berdasarkan perbandingan geseran kimia senyawa aktif dari C. LunataBioMCC FE-00283 beberapa laporan yang sudah ada sebelumnya, geseran kimia senyawa aktifC lunata BioMCC FE-00283 paling mendekati dengan senyawa
8-hidroxy 9-12 octadecadieonoic acid(Tabel 7).
Tabel 7 Geseran kimia spektra H-NMR dari senyawa aktif kapang C. Lunata
BioMCC FE-00283 Geseran kimia
(ppm) BioMCC FE-00283Senyawa aktif octadecadienoic acid8 hydroxy 9-12 a)
6,5 (1H, triplet) Ada Tidak ada
5,9 (1H, triplet) Ada Tidak ada
5,6 (1H, triplet) Ada Tidak ada
5,47(1H, doublet) Ada Ada
5,41 (1H, doublet triplet triplet) Ada Ada
5,38 (1H, doublet triplet triplet) Ada Ada
5,31 (1H, doublet triplet triplet) Ada Ada
4,45 (1H, doublet) Ada Ada
3,67 (3H, singlet) Tidak ada Ada
2,87 (1H, doublet) Ada Ada
2,80 (1H, doublet) Ada Ada
2,30 (2H, triplet) Ada Ada
2,05 (2H, quartet) Ada Ada
1,2-1,7 (17 H) Ada Ada
0,89 (3H, triplet) Ada Ada
a) Wadmanet al(2005)
Untuk dapat memastikan struktur senyawa aktif dan menentukan letak gugus hidroksi dan ikatan rangkap, maka senyawa aktif dianalisa dengan menggunakan QTOF MS-MS yang dapat melakukan fragmentasi senyawa pada ikatan-ikatan yang reaktif (Gambar 15). Hasil analisis ini menunjukkan bahwa fragmentasi utama terdiri dari bobot molekul 157 (C8H13O3), dan 137 yang merujuk pada terpotongnya ikatan
antara C yang mengikat OH dan C ikatan rangkap. Sedangkan fragmen dengan bobot molekul 277 mengacu pada terlepasnya gugus OH berupa H2O dari struktur
Gambar 16 Spektra MS-MS untuk menentukan fragmentasi senyawa aktif kapangC. lunataBioMCC FE-00283
senyawa aktif. Fragmen dengan bobot molekul 171 (C9H15O3) merujuk pada
pecahnya ikatan rangkap pertama dari struktur senyawa aktif, dan fragmen dengan bobot molekul 195 (C12H19O2) merupakan pecahan struktur dimana
ikatan rangkap kedua terpecah. Dari hasil fragmentasi ini dapat terlihat bahwa gugus OH terikat oleh C ke-8, sedangkan ikatan rangkap berada pada C ke-9 dan ke-12 yang disebut asam 8 hidroksi, 9-12 okta dekadienoat. Struktur senyawa aktif selengkapnya seperti terlihat pada gambar 16.
Gambar 17 Struktur senyawa aktif dari kapang endofit C. lunata BioMCC FE- 00283
Senyawa asam 8 hidroksi 9,12 oktadeka dienoat (8-HODE), termasuk dalam kelompok senyawa hidroksi asam lemak yang secara luas dikenal sebagai oksilipin. 8-HODE dilaporkan merupakan senyawa yang dibutuhkan dalam siklus hidup kapang khususnya dalam pembentukan spora (Wadman et al., 2009). Senyawa 8-HODE pertama kali dilaporkan dihasilkan oleh fungi basidiomisetes Laetisiria arvalis yang biasa digunakan sebagai pengendali hayati terhadap pathogen tanaman Rhizoctonia solani dan Phoma betae (Bowerset al, 1986). Disamping itu senyawa tersebut juga dilaporkan dihasilkan oleh kapangGaeumannomyces graminiskapang parasit pada tanaman gandum (Su & Oliw, 1996). Wadman et al. (2008) juga melaporkan bahwa 8-HODE dapat dihasilkan oleh fungi Agaricus bisporus dengan mengkonversi asam linoleat yang ditambahkan dalam media tumbuhnya. Disamping itu Wadman et al, (2009) juga melaporkan bahwa 8-HODE dapat dihasilkan oleh kapang Aspergillus niger dan berpengaruh terhadap produksi spora untuk reproduksi seksualnya. Akan tetapi sampai sejauh ini belum ada laporan tentang 8-HODE yang diproduksi oleh kapang C. lunata dan bersifat bioaktif terhadap proliferasi sel kanker, meskipun beberapa oksilipin jenis lain yang dilaporkan bersifat bioaktif terhadap sel kanker. Asam tetrahidroksifuranil (THFA) pada dosis tinggi mampu menghambat proliferasi kanker payudara dan prostat (Markaverich et al., 2002). 13-HODE dan asam 12 hidroksieikosatetranoat (12-HETE) hasil konversi enzimatis dari asam linoleat dan asam arakidonat juga dilaporkan mampu menghambat adesi sel tumor pada endothelium (Liu et al. 1991). Senyawa 9-HODE dan 13-HODE yang diekstrak dari air rendaman beras
C H 3
O O H O H
dilaporkan mampu menghambat pertumbuhan sel leukemia tikus P388 masing- masing dengan IC501,7 µg/mL dan 11,3 µg/mL 9 (Hayashiet al.,1998).
15-hydroxy eicosatetraenoic acid (15-HETE) dilaporkan ditemukan meningkat pada penderita kanker kolon yang diberikan pengobatan dengan siglitison, suatu PPARγ antagonist dibandingkan dengan penderita yang tanpa perlakuan pengobatan (Chen et al., 2003). Sel kanker kolon yang diberi perlakuan siglitisone dan 15-HETE bersamaan secara in vitro dilaporkan meningkat jumlah kematiannya. Pemberian 15-HETE mendorong sel ke arah apoptosis. Hal yang sama dilaporkan oleh Wu et al., (2003) pada sel kanker lambung yang diberi perlakuan anti siklooksigenase 2 dan 13-HODE.
Oksilipin juga dihasilkan oleh tanaman sebagai metabolit sekunder yang merupakan bagian dari mekanisme pertahanan diri (Graner et al, 2003; Prost et al., 2005). Kelompok senyawa tersebut didalam tanaman dilaporkan berfungsi sebagai signal komunikasi antara mikroba yang tumbuh didalam jaringan, terutama yang bersifat pathogen. Pathogen tanaman menghasilkan senyawa tersebut sebagai mekanisme untuk mengelabui sistem pertahanan tanaman dengan menghasilkan struktur senyawa yang menyerupai mekanisme pertahanannya (Brodhun dan Feussner, 2010; Tsitgiannis dan Keller, 2007). Laporan ini mengkonfirmasi hipotesis bahwa C. lunataBioMCC FE-283 adalah kapang endofit.
C. barometz adalah tanaman inang dari kapangC. lunata yang mampu menghasilkan 8-HODE. Senyawa aktif yang dilaporkan berhasil dimurnikan dari tanaman tersebut adalah asam palmitat, metil ester palmitat, asam linoleat, asam oleat, metil ester stearat, etil ester stearat, 4′-Hidroksiasetanilid, Sukrose,C asam lemak jenuh dengan jumlah C 27, protosatekhualdehid, β-sitosterol, Vanillin, dan 3,4′,5,7-tetrahidroksflavon (Yuan,et al., 2004) dan kelompok sterol (Yang et al.,2007). Belum ada laporan tentang 8-HODE yang dapat dimurnikan dari tanaman C. barometz, akan tetapi 8-HODE adalah bentuk teroksidasi dari asam linoleat. 8-HODE di dalam kapang dilaporkan dapat terbentuk melalui jalur pembentukan asam linoleat sebelum teroksidasi menjadi 8-HODE (Tsitgiannis dan Keller, 2007). Hal ini mendukung dugaan bahwa kapang endofit C. lunata dapat menghasilkan senyawa aktif yang mempunyai struktur menyerupai senyawa tanaman inangnya.
8-HODE adalah senyawa aktif yang merupakan produk metabolit sekunder kapang endofit C. lunata. Metabolit sekunder yang dihasilkan oleh kapang wild
type biasanya hanya dalam jumlah kecil. Untuk meningkatkan produktivitas produksi metabolit sekunder mikroba dapat dilakukan dengan rekayasa gen maupun rekayasa proses produksinya.
Komposisi media fermentasi merupakan salah satu faktor proses produksi yang mempunyai pengaruh nyata terhadap konsentrasi produk fermentasi. Mandenius dan Brundin (2008) melaporkan bahwa penentuan komposisi media fermentasi untuk produksi metabolit sekunder mikroba bukan pekerjaan yang sederhana karena perubahan komposisi media akan mempengaruhi metabolisme mikroba, yang pada akhirnya akan mempengaruhi produktivitas mikroba dalam menghasilkan metabolit tertentu.
8-HODE yang dihasilkan oleh kapang endofit C. lunataBioMCC FE 00283 masih dalam konsentrasi sangat kecil. Untuk dapat meningkatkan produksi 8- HODE, maka perlu dilakukan rekayasa proses produksinya, yaitu dengan melakukan optimasi unsur penyusun media dan komposisinya.
SIMPULAN
Pemurnian dengan dipandu uji bioaktifitas terhadap metabolit sekunder kapang endofit Curvularia lunata BioMCC FE-00283 menghasilkan senyawa aktif yang mampu menghambat proliferasi sel kanker payudara MCF-7 secarain vitro. Uji hambatan proliferasi menunjukkan pada konsentrasi 5 mg/L senyawa aktif mampu menghambat 28 % proliferasi sel MCF-7.
Hasil analisis secara kimia dengan spektrofotometer, MS, dan FTIR menunjukkan senyawa aktif dari kapang C. lunata BioMCC FE-00283 mempunyai serapan maksimum pada panjang gelombang 233 nm, mempunyai bobot molekul 296 g/mol dan mempunyai gugus fungsi OH, HC, HC=, dan CO. Hasil elusidasi struktur menggunakan 1HNMR, 13CNMR dan MS-MS menunjukkan bahwa senyawa aktif tersebut adalah asam 8-hidroksi 9-12- oktadekadienoat dengan rumus molekul C18H32O3