DAFTAR LAMPIRAN
METABOLIT SEKUNDER KAPANG ENDOFIT SEBAGAI ANTIKANKER Kapang endofit, seperti mahkluk hidup lainnya juga menghasilkan
metabolit primer maupun metabolit sekunder. Tidak seperti mikroba endofit yang lain, kapang endofit jarang dilaporkan menghasilkan metabolit primer seperti karbohidrat, enzim, atau protein. Sejauh ini baru beberapa jenis enzim yang dilaporkan dihasilkan oleh kapang endofit. Laporan pertama adalah enzim lipase yang terikat dalam miselia Rhizopus oryzae, kapang endofit yang diisolasi dari tanaman daerah Mediterania Foeniculum vulgare (Torres et al., 2003). Enzim lain adalah kitinase yang terdeteksi disekresikan didalam kultur Neothyphodium sp yang diisolasi dari rumput Poa ampla Merr. Enzim ini dilaporkan berperan sebagai nutrisi, faktor pertumbuhan dan mekanisme pertahanan terhadap penyakit dari kapang endofit tersebut (Li et al.,2004). Laporan terbaru adalah enzim laccaseyang dihasilkan oleh kapang endofit Monotosporasp. endofit dari tanamanCynodon dactylon(Wanget al.,2006).
Berbanding terbalik dengan metabolit primernya, publikasi tentang metabolit sekunder yang dihasilkan oleh kapang endofit jauh lebih banyak. Metabolit sekunder kapang endofit yang sudah pernah diisolasi mempunyai aktivitas biologis yang sangat bervariasi dari bidang pertanian, industri sampai farmasi. Dalam bidang pertanian mikroba endofit digunakan sebagai insektisida (Azevedo et al., 2000; Daysi et al., 2002; dos Santos et al., 2003), sedangkan dalam bidang industri diaplikasikan untuk biotransformasi dari satu senyawa menjadi senyawa lain (Mundova et al., 2002; Shibuya et al., 2003). Dalam bidang farmasi, metabolit sekunder kapang endofit dapat dimanfaatkan sebagai antibiotik (Radu dan Kqueen, 2001; Strobel et al., 2001; Castillo et al., 2002; Ezra et al., 2004; Seephonkai et al., 2004; Wiyakrutta et al., 2004; Li et al., 2005), antifungal (Strobelet al., 1999a ; Strobelet al., 1999b; Radu dan Kqueen, 2001; Wiyakrutta et al., 2004; Silva et al., 2005; Li et al., 2005), anti kanker (Carusoet al.,2000; Radu dan Kqueen, 2001; Filipet al.,2003; Wiyakruttaet al., 2004; Liet al.,2005; Silvaet al.,2005; Guoet al.,2006), antiinflamasi (Weberet al., 2004) maupun antimalaria (Wiyakruttaet al.,2004)
Berdasarkan kelompok kimianya metabolit dapat dikelompokkan menjadi kelompok alkaloid, steroid, terpenoid, isokumarin, kuinon, flavonoid,
fenilpropanoid dan lignan, fenol dan asam fenolat, peptida, senyawa alifatik, dan lakton (Tan dan Zou, 2004; Zhanget al., 2006).
NH O O OH O CH3 CH3 O C H3 O O CH3OH O O O CH3 H O O H O
Gambar 2 Struktur kimia taxol, senyawa antikanker pertama yang dihasilkan oleh kapang endofit (Sumber : Strobelet al., 2004)
Meskipun belum ada laporan tentang senyawa metabolit sekunder kapang endofit yang sudah beredar di pasaran, akan tetapi laporan tentang penemuan senyawa antikanker dari kapang endofit telah banyak dilaporkan. Taxol (Gambar 2) dan turunannya adalah kelompok senyawa pertama yang dilaporkan berhasil diisolasi dari kultur kapang endofit dan mempunyai khasiat antikanker (Strobelet al., 2004). Taxol adalah senyawa diterpenoid yang pada awalnya diisolasi dari tanaman Taxus brevifolia (Wani et al.,1971). Pada awal penemuannya kanker rahim dan payudara adalah target utama taxol, akan tetapi sekarang pemakaiannya untuk kemoterapi sudah meluas untuk hampir semua proliferasi sel jaringan tubuh yang tidak terkendali. Kapang endofit Taxomyces andreanae adalah kapang endofit pertama yang dilaporkan mampu menghasilkan senyawa taxol. Kapang tersebut diisolasi dari tanaman Taxus brevifolia. (Stierle et. al., 1993).
Disamping Taxomyces berbagai genus kapang lainnya baik yang diisolasi dari tanaman spesies Taxus sp maupun jenis tanaman lainnya dilaporkan mampu menghasilkan taxol. Guo et al. (2006) melaporkan kapang BT2, yang belum teridentifikasi dan diisolasi dari Taxus chinensis var. Mairei mampu menghasilkan taxol. Taxol dihasilkan pada kultur cair stasioner dengan
media PDA yang dikultivasi pada suhu 25oC selama 3 minggu dalam keadaan
gelap. Taxol yang dihasilkan dianalisis dengan KCKT menggunakan kolom AlltechEconosil C18 dan dielusi secara gradien menggunakan campuran air dan metanol. Peneliti lain melaporkan bahwa kapangFusarium solaniyang diisolasi dari tanamanTaxus celebicajuga mampu menghasilkan senyawa taxol. Kapang ditumbuhkan dengan kultur cair stasioner pada medium PDA pada suhu 25oC
selama 21 hari. Analisis taxol dilakukan dengan KCKT menggunakan kolom Kromasil C18. Sampel dielusi secara isokratik dengan campuran metanol air (70:30, v/v) dengan kecepatan 1 ml/min (Chakravarthi et al., 2008). Taxol juga dilaporkan dapat dihasilkan oleh kapang Colletotrichum gloesporioides yang diisolasi dari tanaman obat Justicia gendarusa. Produksi taxol dilakukan pada media cair dengan medium MID yang ditambah dengan pepton soya. Kultivasi stasioner dilakukan pada suhu 26oC selama 21 hari (Gangadevi & Muthumary,
2008). Kapang Pestalotiopsis pauciseta yang diisolasi dari tanaman Cardiospermum helicacabumjuga dilaporkan mampu menghasilkan taxol ketika dikultivasi pada medium MID yang ditambah dengan pepton soya. Kultivasi dilakukan dengan kultur stasioner pada suhu 26oC selama 21 hari. (Gangadevi, et al., 2008). O H O H OH O C H3 O H OH O O C H3 O CH3 CH3 O O C H3 C H3 O O O CH3 CH3 C H3 C H3 OH O
Gambar 3 Struktur kimia dari hormonemat metabolit sekuder kapang Hormonema dematioides(Sumber : Filipet al.,2003)
Selain taxol beberapa senyawa berkhasiat antikanker yang lain juga dilaporkan dihasilkan oleh kapang endofit. Hormonemat (Gambar 3), dilaporkan dihasilkan oleh kapang Hormonema dematioides. Hormonemat diproduksi menggunakan media YMG pada suhu 22oC dengan aerasi 3 l/min dan
pertumbuhan sel kanker usus besar COLO-320, DLD-1 dan HT-29. (Filip et al., 2003).
Kapang endofit yang berhasil diisolasi dari tanaman Castaniopsis fissa yang belum teridentifikasi juga dilaporkan mampu menghasilkan senyawa antikanker. Senyawa ergosta-8(9),22-diene-3,5,6,7-tetraol(3β,5α,22E) yang masuk dalam kelompok senyawa sterol tersebut (Gambar 4) bersifat sitotoksis terhadap sel kanker Bel-7402, NCI4460 dan L-02 dengan IC50 masing-masing
8,445; 5,03; dan 13,621 µg/ml. Senyawa tersebut dihasilkan dari kultivasi kapang dalam media cair yang diinkubasi pada suhu 25oC dengan pengocokan
120 rpm selama 5-7 hari (Liet. al.,2004).
O H C H3 CH3 OH OH CH3 C H3 CH3 CH3 CH3
Gambar 4 Struktur senyawa antikanker yang dihasilkan kapang endofit dari tanamanCastaniopsis fissa(Sumber : Liet al.,2004)
Kapang Phomopsis cassiae yang diisolasi dari tanaman Cassia spectabilis dilaporkan dapat menghasilkan dua senyawa baru, phomopsilakton dan etil 2,4-hihidroksi-5,6-dimetilbenzoat (Gambar 5a dan 5b) pada kultivasi dalam media PDB pada suhu 25oC dan pengocokan 150 rpm selama 28 hari.
Kedua senyawa tersebut dalam ujiin vitroterbukti bersifat sitotoksis terhadap sel kanker servik. (Silvaet al.,2005).
O O H OH O CH3 CH2 O C H3 C H3 CH3 O H OH O O CH3
Gambar 5 Metabolit sekunder kapang Phomopsis cassiae (Sumber : Silva et al.,2005)
b. etil 2,4-hihidroksi-5,6-dimetilbenzoat a. phomopsilakton
Camptothecin (Gambar 6), adalah senyawa golongan alkaloid yang juga sudah terbukti sebagai senyawa antikanker. Senyawa yang merupakan penghambat topoisomerasi I ini pada awalnya diperoleh dari tanaman Nothapodytes foetida, yang kemudian menarik peneliti untuk mempelajari kapang endofitnya. Amnaet. al., (2006) melaporkan bahwa kapangEntrospora infrequens yang diisolasi dari tanaman N. foetida mampu menghasilkan senyawa camptothecin. Ekstrak kloroform:metanol (9:1, v/v) dari kultur padat maupun cair dari kapang yang kemudian diinjeksikan ke dalam unit LC/MS menunjukkan bahwa kapangE. infrequensmampu menghasilkan camptothecin.
N N O O OH C H3 O
Gambar 6 Struktur kimia senyawa camptothecin yang dihasilkan oleh kapang Entrospora infrequens(Sumber : Amnaet al.,2006)
Kelompok peneliti ini melaporkan bahwa camptothecin dapat dihasilkan oleh kapang Entrospora infrequens baik pada kultur padat maupun kultur cair. Hasil tertinggi pada kultur padat adalah 4,28 mg/100 g miselia kering dari kultur berumur 14 hari. Sedangkan pada kultur cair diperoleh hasil 250 µg/L kaldu fermentasi.
Disamping mampu menghasilkan senyawa aktif serupa yang dihasilkan tanaman inangnya, kapang endofit juga menjadi sumber pencarian senyawa baru yang berkhasiat antikanker. Senyawa baru yang mampu menghambat proliferasi sel kanker, asperpiron D (Gambar 7), dilaporkan dihasilkan oleh kapang Aspergillus tubingensis yang diisolasi dari tanaman Fallugia paradoxa. Senyawa tersebut dilaporkan mampu menghambat proliferasi sel kanker paru (NCI-H460), kanker payudara (MCF-7), glioma (SF-268) dan kanker pankreas (MIA PaCa2). Asperpiron D dihasilkan dari kultur padat kapang A. tubingensis dalam media PDA. (Zhanet al.,2007).
O O CH3 OCH3 H3CO O OH O H OCH3 O CH3
Gambar 7 Struktur asperpiron D, metabolit sekunder kapang Aspergillus tubingensis mikroba endofit dari tanaman Fallugia paradoxa (Sumber Zhanet al.,2007)
CH3 CH3 O CH3 O N H R1 O O N H CH3O O CH2 NH R2 R3 A NH2 O A OH O
Gambar 8 Struktur kimia Fusaristatin A (a) dan B (b) metabolit sekunder kapang Fusariumsp endofit tanamanMaackia chinensis(Sumber : Shionoet al.,2007)
Senyawa baru lain yang dilaporkan merupakan antikanker adalah fusaristatin A dan B (Gambar 8). Fusaristatin A dan B adalah golongan
a. R1= R
3=CH3
R2= H
lipopeptida siklik yang dihasilkan oleh kapang Fusarium sp yang diisolasi dari tanaman Maackia chinensis. Kedua senyawa tersebut dihasilkan dari kultur padat menggunakan media beras pada suhu 25oC selama 3 minggu.
Fusaristatin A dan B dilaporkan mampu menghambat proliferasi sel kanker paru- paru LU 65 dengan IC50masing-masing 23 dan 7 µM (Shionoet al.,2007)
Selain senyawa antikanker, kapang endofit dari tanaman obat juga dapat menghasilkan senyawa yang berfungsi sebagai prekursor senyawa antikanker. Podophilotoksin, suatu senyawa golongan ariltetralin lignan (Gambar. 9) merupakan prekursor dari obat antikanker etoposida, teniposida, dan etoposida phosphat. Sumber utama senyawa tersebut adalah tanaman Podophylum sp. Semakin langkanya tanaman sebagai sumber utama senyawa mendorong para peneliti untuk mengisolasi kapang endofit dari berbagai spesiesPodophylumsp. Kapang endofit Trametes hirsutayang diisolasi dari P. hexandrum dari daerah Himalaya dilaporkan dapat menghasilkan podophilotoksin. Kultur cair dalam media Sabouraud brothyang dikultivasi pada suhu 28oC dan pengocokan 220
rpm selama 7 hari digunakan untuk memproduksi podophilotoksin. Senyawa aktif tersebut diekstrak dari biomassa yang dihasilkan dari kultur cair menggunakan campuran kloroform:metanol (4:1, v/v). Untuk mengidentifikasi senyawa ekstrak dimurnikan dengan KCKT dan kemudian dianalisis dengan ESI MS/MS dan NMR (Puriet. al.,2006).
O O O OH O OCH3 OCH3 H3CO
Gambar 9 Struktur kimia senyawa podophilotoksin yang dihasilkan oleh kapang endofit tanamanPodophylumsp (Sumber : Puriet. al.,2006).
Kapang lain yang dilaporkan mampu menghasilkan podophilotoksin adalah Phialocephala fortinii yang diisolasi dari tanaman P. peltatum. Produksi
podophilotoksin dilakukan dalam medium cair MB atau YMB pada suhu 20-23oC
dalam gelap. Biomassa yang dihasilkan dipisahkan dari mediumnya, dikeringkan pada suhu 70-80oC selama 24 jam, kemudian diekstrak dengan etanol 95%
menggunakan pengekstrak Soxhlet. Untuk mengetahui komposisi senyawa didalamnya, ekstrak tersebut kemudian dianalisis menggunakan KCKT dengan kolom Hypersil BDS. Fasa gerak digunakan campuran asetonitril/air secara gradien 5 - 95% selama 40 menit dengan laju alir 1 ml/min. Puncak yang muncul dari sampel kemudian dibandingkan dengan puncak standar podophilotoksin (Eybergeret al.,2006)
PENAPISAN METABOLIT SEKUNDER SEBAGAI ANTIKANKER