OF BIOACTIVE PRODUCED BY
Curvularia lunata
BioMCC-FE00283
ENDOPHYTIC FUNGI ISOLATED FROMCibotium barometz
ABSTRAK
Penelitian ini bertujuan untuk memurnikan, menguji efek sitotoksisitas dan analisis struktur dari senyawa aktif yang dihasilkan oleh kapang endofit Curvularia lunata BioMCC-FE00283 yang diisolasi dari tanaman Cibotium barometz. Kaldu kultivasi dari C. lunata yang dikultivasi di dalam medium PDY selama 10 hari diekstrak dengan pelarut etil asetat. Uji permulaan terhadap ekstrak dan fraksi dilakukan dengan metode BSLT terhadap Artemia salina, sementara sitotoksisitas senyawa aktif dilakukan dengan metode MTT terhadap sel kanker payudara MCF-7. Pemurnian senyawa aktif dilakukan dengan kromatografi kolom menggunakan silica gel 60 sebagai fasa diam dan dielusi secara gradien bertahap menggunakan heksana, etil asetat dan metanol. Fraksi aktif dari kromatografi kolom dimurnikan lebih lanjut dengan KCKT menggunakan kolom C18 dan dielusi secara gradien menggunakan campuran asetonitril air dari 15% sampai 100% selama 33 menit. Hasil pengujian awal menunjukkan fraksi etil asetat adalah fraksi paling aktif dengan LC50 = 4,69 mg/L, sementara senyawa murni dari pemurnian KCKT pada
konsentrasi 5 mg/L mampu menghambat 28 % proliferasi sel MCF-7. Elusidasi rumus dan struktur molekul menggunakan spektroskopi infra merah, LC-MS, 1H NMR, 13C NMR dan MS-MS menunjukkan senyawa aktif dari kapang endofit C. lunata BioMCC FE-00283 adalah 8-hydroxy 9,12-octa decadionoic acid dengan rumus molekul C18H32O3
Kata kunci : antikanker, kapang endofit, uji BSLT, uji MTT, sel kanker payudara MCF-7, Curvularia lunata, Cibotium barometz, 8-hydroxy octa deca dienoic acid
ABSTRACT
The purpose of this work was to purify, examine the cytotoxicity effect and structure analysis of active substance produced by endophytic fungi Curvularia lunata BioMCC-FE00283 isolated from the stem of Cibotium barometz. The fermentation broth of C lunatacultivated in PDY medium for 10 days was extracted with ethyl acetate. Preliminary bioassay of the extract and fractions was conducted by BSLT against Artemia salina, while citotoxicity of the pure active compound was conducted by MTT assay against cell line human carcinoma breast MCF-7. Purification of active compound was conducted by column chromatography using silica gel 60 as stationary phase and eluted by gradient method using hexane, ethyl acetate, and methanol stepwisely. The active fraction from column chromatography was further purified by HPLC using C18 column and eluted by gradient system of acetonitril water from 15% up to 100% for 33 minutes. The result of preliminary assay showed that ethyl acetate fraction was the most active (LC50 = 4.69 mg/L),
while the pure compound from HPLC on concentration 5 mg/L could inhibit 28 % cell proliferation of MCF-7. Elucidation of formula and structure using spectroscopy IR, LC-MS, 1H NMR, 13C NMR and MS-MS resulted that active compound of endophytic fungi C. lunata BioMCC FE-00283 is 8-hydroxy 9,12-octa decadienoic acid which molecule formula is C18H32O3
Key words : anticancer, endophytic fungi, BSLT, MTT assay, human carcinoma breast MCF-7, Curvularia lunata, Cibotium barometz,8-hydroxy 9,12- octa decadienoic acid
PENDAHULUAN
Identifikasi dan elusidasi struktur senyawa aktif adalah salah tahu tahap menentukan dalam pengembangan bahan baku obat dari bahan alam. Agar struktur senyawa aktif dapat ditentukan, diperlukan proses pemurnian senyawa tersebut. Proses pemurnian suatu senyawa aktif meliputi pemisahan ekstrak kasar menjadi sejumlah fraksi yang terpisah. Proses tersebut secara umum disebut dengan fraksinasi. Menurut Sapinhour (2005), pemisahan fraksi-fraksi biasanya dilakukan berdasarkan perbedaan sifat fisika dari senyawa aktif dengan komponen lainnya. Metode pemisahan yang paling sering digunakan adalah ekstraksi cair-cair dan elusi
dalam kolom kromatografi (Ding et al., 2009; Sakpakdeejaroen dan Itharat, 2009; Husseinet al.,2003).
Pemilihan metode fraksinasi tergantung kepada jenis ekstrak dan senyawa aktif yang dimurnikan. Untuk meningkatkan kemungkinan mendapatkan senyawa aktif tunggal dalam 1 fraksi maka pendekatan menampung fraksi dengan volume kecil dalam jumlah yang banyak akan lebih baik. Akan tetapi pendekatan ini akan memerlukan banyak pekerjaan untuk menganalisis masing-masing fraksi dan ada kemungkinan senyawa yang diinginkan justru tersebar dalam banyak fraksi dan tidak dapat terdeteksi. Pendekatan lain yang dapat dilakukan adalah menampung fraksi secara kasar dalam volume besar dengan jumlah fraksi lebih sedikit. Analisis yang paling sering digunakan dalam pemurnian suatu senyawa aktif adalah uji bioaktivitas. Claeson dan Bohlin (1997) menyebutkan bahwa uji bioaktivitas dapat digunakan untuk mendeteksi adanya senyawa aktif dari suatu ekstrak bahan alam. Karena sifatnya tersebut uji bioaktivitas dapat digunakan sebagai pemandu untuk prosedur fraksinasi kimia yang dapat menuntun pada pemurnian suatu senyawa aktif. Kombinasi dari beberapa jenis uji bioaktivitas dapat digunakan sebagai panduan pemurnian senyawa aktif guna mendapatkan senyawa penuntun dari senyawa bahan alam.
Berbagai jenis bioaktivitas dapat digunakan sebagai panduan untuk pemurnian suatu senyawa aktif. Beberapa publikasi telah melaporkan uji bioaktivitas seperti anti mikroba (Meot-Duros et al., 2010; Ding et al. 2009; Pal dan Ramana, 2009; Slack et al, 2009), sitotoksisitas (Meot-Duros et al., 2010; Ding et al. 2009; Sakpakdeejaroen dan Itharat, 2009; Uhlig et al., 2005;), maupun anti nyamuk (Wedge et al., 2009) sebagai panduan pemurnian senyawa aktif. Uji bioaktivitas dilakukan mengikuti proses pemisahan campuran senyawa dalam ekstrak menjadi fraksi-fraksi yang terpisah.
Dalam pengembangan bahan baku obat dari bahan alam, senyawa aktif yang telah berhasil dimurnikan pada umumnya belum diketahui struktur senyawanya. Perlu beberapa langkah analisa kimia untuk dapat menentukan rumus molekul dan struktur senyawa aktif. Metode analisis kimia yang paling banyak digunakan untuk menentukan rumus dan struktur molekul dapat meliputi spektroskopi infra merah untuk mengetahui gugus fungsi dari senyawa aktif, spektroskopi massa untuk menentukan berat molekul senyawa dan melalui pola
fragmentasi dari senyawa, serta spektroskopi serapan magnetik inti atom proton dan karbon untuk menentukan struktur senyawa (Akdemir et al., 2010; Meot-Duros et al., 2010; Slack et al,. 2009; Wedge et al, 2009). Dalam bagian penelitian ini dilaporkan hasil pemurnian senyawa aktif dari kapang endofit C. lunata yang dipandu dengan uji sitotoksisitas. Sedangkan identifikasi struktur senyawa aktif dilakukan dengan menggunakan spektroskopi infra merah, spektroskopi massa dan serapan magnetik inti atom.
CARA KERJA Produksi senyawa aktif
Produksi senyawa aktif yang dihasilkan oleh kapang Curvularia lunata
BioMCC FE-00283 dilakukan sesuai dengan cara kerja pada bab METODE PENELITIAN sub bab CARA KERJA bagian kultivasi kultur vegetatif dan kultivasi kultur produksi. Kultivasi produksi dilakukan pada Erlenmeyer 2000 mL yang berisi 1000 mL medium.
Ekstraksi senyawa aktif
Ektraksi senyawa aktif untuk pemurnian senyawa dilakukan sesuai dengan cara kerja pada bab METODE PENELITIAN sub bab CARA KERJA bagian Ekstraksi senyawa aktif. Ekstraksi dilakukan pada bejana dengan volume 5 L.
Pemurnian senyawa aktif dengan panduan bioaktivitas
Pemurnian senyawa aktif dilakukan sesuai dengan cara kerja pada bab METODE PENELITIAN sub bab CARA KERJA bagian Pemurnian senyawa aktif. Fraksi aktif dari hasil pemurnian pertama diuji aktivitasnya dengan metode BSLT sesuai dengan cara kerja pada pada bab METODE PENELITIAN sub bab CARA KERJA bagian Uji aktivitas biologis dengan metode brine shrimp lethality test. Senyawa aktif hasil pemurnian tahap kedua diuji aktivitasnya dengan metode uji MTT sesuai dengan cara kerja pada bab METODE PENELITIAN sub bab CARA KERJA bagian Uji sitotoksisitas terhadap sel kanker payudara MCF-7.
Identifikasi struktur kimia senyawa aktif
Bobot molekul dan rumus molekul senyawa aktif ditentukan dengan Spectrum ESI-MS (LCT Premier-XE Waters). Gugus fungsional senyawa ditentukan dengan FTIR (Shimadzu 8300) dan struktur molekul senyawa ditentukan dengan, 1HNMR dan 13CNMR (Bruker AV-500 (500 MHz) serta QTOF-MS-MS (XEVO Waters)
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pemurnian senyawa aktif yang dihasilkan oleh kapang endofit BioMCC FE- 00283 dilakukan dengan cara kromatografi. Pemurnian awal dilakukan dengan menggunakan kolom kromatografi dengan elusi secara gradien menggunakan pelarut dari non polar ke polar. Untuk mengetahui bioaktivitasnya, masing-masing fraksi diuji terhadap larva A. salina. Hasil uji bioaktivitas masing-masing fraksi disajikan dalam Tabel 5.
Tabel 5 Hasil uji ekstrak etil asetat dan fraksi metabolit sekunder kapang endofit BioMCC FE-00283 terhadap larvaA. salina
Sample LC50(mg/L)
Ekstrak etil asetat 30.21
Fraksi heksana 20,52
Fraksi heksana:etil asetat 18,62
Fraksi etil asetat 4,69
Fraksi etil asetat:metanol 33,29
Fraksi metanol 91,61
Hasil uji bioaktivitas menunjukkan bahwa fraksi etil asetat hasil kromatografi kolom mempunyai aktivitas yang lebih besar dibandingkan dengan ekstrak awalnya. Hal ini menunjukkan bahwa pemisahan senyawa aktif berhasil dilakukan. Hasil uji terhadap fraksi dan ekstrak tersebut diperkuat dengan kromatogram dari ekstrak etil asetat dan fraksi etil asetat (Gambar 11a dan 11b). Hasil uji terhadapA. salinajuga menunjukkan bahwa fraksi etil asetat adalah fraksi yang paling aktif dibandingkan fraksi-fraksi yang lain yang menunjukkan bahwa senyawa aktif dari kapang endofit BioMCC FE-00283 bersifat semi polar.
Gambar 12 Kromatogram ekstrak etil asetat (a), dan fraksi etil asetat (b)
Fraksi etil asetat hasil pemurnian awal dimurnikan lebih lanjut dengan menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi. Dari hasil analisis awal dengan kromatografi cair kinerja tinggi terhadap fraksi etil asetat, diperoleh dua puncak dominan pada waktu retensi 5-6 menit dan 15-16 menit (Gambar 11 b). Puncak pada waktu retensi 15-16 menit dipilih untuk dimurnikan karena sifat senyawa aktif yang diduga semipolar. Puncak dengan waktu retensi 5-6 menit terelusi oleh fasa gerak yang masih bersifat polar karena komposisi air masih lebih besar dibandingkan dengan asetonitril, sedangkan puncak dengan waktu retensi 15-16
A U 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 M inutes 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00