OPTIMIZATION OF OF 8-HYDROXY 9,12-OCTADECADIENOIC ACID MEDIUM PRODUCTION FROM ENDOPHYTIC FUNG
Analisis 8-HODE hasil kultivas
Analisis 8-HODE hasil kultivasi dilakukan sesuai dengan cara kerja pada bab METODE PENELITIAN sub bab CARA KERJA bagian analisis 8-HODE.
Komposisi medium kultivasi
a. Pemilihan jenis sumber karbon, nitrogen dan lemak untuk produksi 8-HODE Medium fermentasi untuk pemilihan jenis sumber karbon terdiri dari 20% ekstrak kentang, 3 g/L ekstrak khamir dan 4 g/L C dari 5 jenis sumber karbon yaitu : glukosa, laktosa, maltosa, xilosa dan sukrosa. Untuk pemilihan
jenis sumber nitrogen medium fermentasi terdiri dari 20 % ekstrak 10 g/L glukosa, 0,33 g/L N dari 4 jenis sumber nitrogen yaitu : ekstrak khamir, monosodium glutamate, urea dan NH4Cl. Medium untuk pemilihan inducer
terdiri dari 20% ekstrak kentang, 10 g/L glukosa, 3 g/L esktrak khamir dan 5 ml/L 5 jenis minyak yaitu : minyak jagung, minyak kedelai, minyak biji bunga matahari dan minyak wijen. Konsentrasi 8-HODE untuk setiap perlakuan digunakan sebagai input data statistik untuk mengetahui sumber karbon, nitrogen dan asam lemak paling bagus untuk produksi 8-HODE.
b. Pemilihan level konsentrasi glukosa, monosodium glutamat dan minyak jagung
Medium kultvasi untuk orientasi konsentrasi glukosa terdiri dari 10, 20, 30, 40 dan 50 g/L glukosa, 4 g/L ekstrak khamir , dan 20% ekstrak kentang. Medium kultivasi untuk orientasi konsentrasi sumber nitrogen terdiri dari 4, 8, 12, 16 dan 20 g/L monosodium glutamat, 10 g/L glukosa dan 20% ekstrak kentang. Medium kultivasi untuk orientasi penambahan minyak jagung terdiri dari 5, 10, 15, 20, 25 ml/L minyak jagung, 10 g/L glukosa, 4 g/L ekstrak khamir dan 20% ekstrak kentang. Konsentrasi 8-HODE untuk masing-masing perlakuan digunakan sebagai input data statistik untuk mengetahui pada konsentrasi glukosa, monosodium glutamat dan minyak jagung terbaik untuk produksi 8-HODE.
c. Optimasi komposisi media kultivasi untuk produksi 8-HODE
Medium kultivasi untuk optimasi komposisi media kultivasi menggunakan rancangan CCD. Percobaan ini akan terdiri dari 8 satuan percobaan untuk rancangan faktorial dan diperbesar dengan 6 starting point (titik awal) dan 1 center point(titik tengah).
Rancangan percobaan dengan tiga level faktor yang dikodekan dari selang konsentrasi untuk tiap faktor yang disajikan pada Tabel 8, sedangkan level konsentrasi tiap faktor sebelum dikodekan disajikan pada Tabel 9. Pengujian ini dilakukan untuk mengetahui respon dari setiap komposisi faktor yang dicobakan. Konsentrasi 8-HODE adalah respon yang diukur dari berbagai komposisi media fermentasi dan digunakan sebagai input untuk pengolahan data statistik.
Tabel 8 Rancangan percobaan CCD No.
Percobaan RancanganPercobaan Level faktor yang dikodekanX1 X2 X3 Respon
1 Faktorial 5 8 1 Y1 2 5 8 16 Y2 3 5 16 9 Y3 4 5 16 9 Y4 5 15 8 1 Y5 6 15 8 9 Y6 7 15 16 1 Y7 8 15 16 0 Y8 9 Titik awal 10 5,27 5 Y9 10 10 18,73 5 Y10 11 10 12 0 Y11 12 10 12 11,73 Y12 13 1,59 12 5 Y13 14 18,41 12 5 Y14 15 Titik tengah 10 12 5 Y15
Tabel 9 Level Konsentrasi setiap faktor padacentral composite design a. Level konsentrasi optimasi pertama
Faktor Level
Kode -1,682 -1 0 1 1,682
Glukosa (g/l) X1 1,59 5 10 15 18,41
Sodium glutamat (g/l) X2 1,272 4 8 12 14,73
Minyak jagung (ml/l) X3 0 1 5 9 11,73
b. Level konsentrasi optimasi kedua
Faktor Level Kode -1,682 -1 0 1 1,682 Glukosa (g/l) X1 0 2 5 8 10,05 Sodium glutamat (g/l) X2 5,27 8 12 16 18,73 Minyak jagung (ml/l) X3 0.,6 0,5 1 1,5 1,84 Analisis data
Untuk pemilihan jenis sumber karbon, nitrogen dan sumber asam lemak, konsentrasi 8-HODE dianalisa dengan analisis sidik ragam untuk melihat
perbedaan respon antar peubah. Untuk optimasi media data konsentrasi 8- HODE yang diperoleh diolah dengan menggunakan perangkat lunak Design Expert versi 7 untuk mendapatkan model yang menghubungkan konsentrasi 8- HODE sebagai respon dengan komposisi media sebagai peubah. Model yang dihasilkan dari pengolahan data percobaan akan dioptimasi dengan menggunakan metode permukaan respon dengan perangkat lunak Design Expertversi 7.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pemilihan jenis sumber karbon pada kultivasi C. lunata untuk produksi 8- HODE a b cd cd e - 0.040 0.080 0.120 0.160 0.200
Glukosa Laktosa Sukrosa Silosa Maltosa
[8 -H O D E ] (m g /L )
Jenis sumber karbon
Catatan: huruf yang berbeda menunjukkan beda nyata perlakuan pada taraf uji 5%
Gambar 18 Pengaruh jenis sumber karbon terhadap produksi 8-HODE oleh kapangC. lunata
Glukosa, laktosa, sukrosa, silosa dan maltosa secara sendiri-sendiri digunakan sebagai sumber karbon dengan konsentrasi karbon yang sama dalam medium kultivasi C. lunata untuk produksi 8-HODE. Hasil analisa luas area 8-HODE menunjukkan bahwa glukosa sebagai sumber karbon 8-HODE tertinggi 0,179 0,016 mg/L diikuti oleh laktosa 0,076 ± 0,015 mg/L; sukrosa 0,056 ± 0,016 mg/L; silosa 0,046 ± 0,005 mg/L dan maltosa 0,015 ± 0,016 mg/L. Hasil analisis ragam (Lampiran 7) menunjukkan bahwa perlakuan jenis sumber
karbon memberikan pengaruh nyata terhadap luas area 8-HODE yang dihasilkan oleh kapang endofitC. Lunata. Selanjutnya dari uji beda nyata dapat diketahui bahwa glukosa sebagai sumber karbon menghasilkan 8-HODE dengan luas area terbesar dan berbeda nyata dengan pemakaian sumber karbon yang lain (Gambar 18).
Sebagai kelompok senyawa turunan asam lemak, 8-HODE dihasilkan oleh kapang mengikuti jalur menyerupai jalur pembentukan poliketida. Triosa yang dihasilkan dari sumber karbon dikonversi menjadi asetil Ko-A melalu jalur piruvat. Penambahan CO2 ke dalam gugus asetat akan menghasilkan malonat.
Reaksi malonat dengan asetat secara berlanjut akan menghasilkan asam lemak atau poliketida (Jenni et al, 2006). Jalur pembentukan asam lemak dan poliketida ini berada diluar siklus asam sitrat, sehingga terhubung langsung dengan metabolisme sumber karbon. Dugaan jalur biosintesa 8-HODE di dalam kapang ini yang menjadi dasar pemilihan jenis sumber karbon medium kultivasi produksi 8-HODE. Beberapa gula monosakarida dipilih sebagai sumber karbon dengan tujuan agar lebih mudah terpecah menjadi asetil Ko-A, sedangkan disakarida dipilih dengan pertimbangan 8-HODE diduga adalah metabolit sekunder yang secara umum akan diproduksi lebih tinggi apabila digunakan gula yang lebih komplek.
Hasil pemilihan sumber karbon menunjukkan pemakaian glukosa sebagai sumber karbon menghasilkan 8-HODE tertinggi (Gambar 17). Hasil ini ini mendukung asumsi awal bahwa sumber karbon paling sederhana dan membutuhkan energi terkecil untuk menjadi asetil Ko-A akan menjadi sumber karbon yang paling mudah mendorong sintesis asam lemak di dalam fungi. Produksi hidroksi asam lemak dilaporkan berkaitan secara dengan sporulasi pada kapang Aspergillus (Wadman et al, 2005), sedangkan Calvo et al (2002) melaporkan bahwa gula-gula sederhana sebagai sumber karbon tunggal telah meningkatkan sporulasi pad Aspergillus dibandingkan sumber gula yang lebih komplek. Kedua hal tersebut diduga menjadi penyebab mengapa glukosa, sebagai sumber karbon paling sederhana, dapat menghasilkan HODE tertinggi dibandingkan sumber karbon yang lain. Sampai saat ini belum diperoleh rujukan publikasi yang melaporkan pengaruh jenis sumber karbon terhadap produksi HODE baik oleh kapang maupun mikroba lainnya. Meskipun beberapa publikasi melaporkan bahwa glukosa merupakan sumber karbon terbaik untuk produksi asam lemak oleh kapang Mucor (Lin et al., 2008; Tauk-Tornisielo et al., 2007),
akan tetapi mereka juga belum melaporkan bagaimana mekanisme glukosa dapat menstimulasi produksi asam lemak dibandingkan dengan sumber karbon yang lain.
Pemilihan jenis sumber nitrogen pada kultivasi C. lunatauntuk produksi 8- HODE a b c d - 0.100 0.200 0.300 0.400 Monosodium glutamat
Ekstrak khamir Urea NH4Cl
[8 -H O D E ] (m g /L )
Jenis sumber nitrogen
Catatan: huruf yang berbeda menunjukkan beda nyata perlakuan pada taraf uji 5%
Gambar 19 Pengaruh jenis sumber nitrogen terhadap produksi 8-HODE oleh kapangC. lunata
Monosodium glutamat, ekstrak khamir, urea dan ammonium khlorida berturut-turut digunakan sebagai sumber nitrogen dalam medium kultivasi C. lunata untuk produksi 8-HODE. Hasil analisa luas area 8-HODE menunjukkan bahwa monosodium glutamat adalah sumber nitrogen yang menghasilkan 8- HODE dengan konsentrasi tertinggi 0,287 ± 0,041 mg/L, dan berturut-turut diikuti ekstrak khamir 0,121 ± 0,013 mg/L, urea 0,055 ± 0,051 mg/L dan ammonium khlorida 8-HODE yang dihasilkan tidak terdeteksi. Hasil analisis ragam (Lampiran 8) menunjukkan bahwa perlakuan jenis sumber nitrogen memberikan pengaruh nyata terhadap luas area 8-HODE yang dihasilkan oleh kapang endofit C. Lunata. Selanjutnya dari uji beda nyata dapat diketahui bahwa monosodium glutamat sebagai sumber nitrogen yang menghasilkan 8-HODE dengan luas
area terbesar dan berbeda nyata dengan pemakaian sumber karbon yang lain (Gambar 19).
Produksi metabolit sekunder pada fungi dengan jalur poliketida dilaporkan dipengaruhi jenis sumber nitrogen. Hajjaj et al (2001) melaporkan bahwa asam glutamat dan histidin di dalam media kultivasi kapang akan menstimulasi akumulasi α-ketoglutarate di dalam sel kapang. Akumulasi ini akan mendorong asetil Ko-A untuk masuk ke dalam jalur poliketida dibandingkan untuk masuk ke dalam siklus asam sitrat. Jalur biosintesis asam lemak pada fungi mengikuti jalur yang serupa dengan poliketida dimana asetil Ko-A tanpa masuk siklus asam sitrat langsung berpolimerisasi membentuk asam lemak (Gambar 20). Stimulasi monosodium glutamat pada produksi HODE diduga mengikuti mekanisme yang sama dengan mekanisme stimulasi produksi metabolit sekunder yang diproduksi dengan jalur poliketida. Sumber nitrogen organik juga dilaporkan mampu meningkatkan produksi asam lemak dibandingkan sumber nitrogen anorganik (Hwang et al. 2005). Hal yang sama diperoleh dari hasil penelitian ini, bahkan ketika NH4Cl digunakan sebagai
sumber nitrogen, HODE sama sekali tidak terdeteksi dari kaldu fermentasi.
Gambar 20 Siklus asam sitrat dan jalur biosintesis asam lemak pada kapang (Jenieet al., 2006)
Pemilihan jenis sumber inducer pada kultivasi C. lunatauntuk produksi 8- HODE
Minyak jagung, minyak mijen, minyak kedelai dan minyak biji bunga matahari digunakan sebagai inducer untuk produksi 8-HODE oleh kapang C. lunata. Hasil analisa luas area 8-HODE menunjukkan bahwa minyak jagung adalah inducer yang menghasilkan 8-HODE dengan konsentrasi tertinggi 0,071 ± 0,02
mg/L, dan berturut-turut diikuti minyak wijen 0,048 ± 0,003 mg/L, minyak kedelai 0,040 ± 0,012 mg/L dan minyak biji bunga matahari 0,039 ± 0,012 mg/L. Hasil analisis ragam (Lampiran 9) menunjukkan bahwa perlakuan jenis sumber inducer memberikan pengaruh nyata terhadap luas area 8-HODE yang dihasilkan oleh kapang endofit C. lunata. Selanjutnya dari uji beda nyata dapat diketahui bahwa minyak jagung adalah inducer yang menghasilkan 8-HODE dengan luas area terbesar dan berbeda nyata dengan pemakaian sumber karbon yang lain (Gambar 21).
HODE adalah senyawa kelompok asam lemak yang merupakan turunan dari asam linoleat. Secara semisintetis HODE diproduksi dengan oksidasi minyak yang mengandung asam linoleat atau asam linolenat. Beberapa publikasi melaporkan minyak nabati yang mengandung asam oleat, linoleat maupun asam linolenat digunakan sebagai substrat untuk produksi oksilipin (Wadmanet al.,2005; Arjolet al.,2010; Heoet al.,2009).
a bcde bcde bcde bcde - 0.020 0.040 0.060 0.080
Minyak jagung Minyak wijen Tanpa minyak Minyak kedelai Minyak bunga
matahari [8 -H O D E ] (m g /L )
Jenis minyak sebagaiinducer
Catatan: huruf yang berbeda menunjukkan beda nyata perlakuan pada taraf uji 5%
Gambar 21 Pengaruh jenis minyak sebagaiinducerterhadap produksi HODE oleh kapangC. lunata
Hou et al. (2005) melaporkan bahwa aktivitas pembentukan HODE oleh FlavobakteriumDS5 meningkat dari substrat γ-linolenat, linoleat dan α-linolenat, akan tetapi Heo et al (2010) melaporkan bahwa konversi linoleat justru lebih kecil dibandingkan dengan α- dan γ-linolenat. Akan tetapi jalur biosintesis 8-
HODE pada Aspergillus yang dilaporkan oleh Tsitsigiannis dan Keller (2007) sangat jelas menunjukkan bahwa 8-HODE disintesis dari asam linoleat dan melibatkan gen PsiBα (Gambar 22). Laporan ini mendukung dugaan bahwa minyak yang mengandung asam linoleat akan meningkatkan produksi 8-HODE pada C. lunata. Akan tetapi dari komposisi minyak nabati yang digunakan sebagai substrat dalam penelitian ini (Erasmus, 2009) minyak jagung mempunyai kandungan linoleat dibawah minyak biji matahari (65 %) dan diatas minyak kedelai (50 %) dan minyak wijen (45 %). Diduga gen PsiBα pada kapang C. lunata justru menjadi tertekan apabila konsentrasi asam linoleat di dalam media terlalu tinggi karena mekanismefeedback repression.
Gambar 22 Jalur biosintesis oksilipin pada tanaman dan kapang Aspergillus (Tsitsigiannis dan Keller, 2007)
Pemilihan level konsentrasi glukosa sebagai sumber karbon
Pemilihan level konsentrasi glukosa sebagai sumber karbon dilakukan dengan variasi konsentrasi glukosa dalam media kultivasi produksi 8-HODE. Konsentrasi 10 mg/L diambil sebagai konsentrasi terkecil sesuai dengan konsentrasi glukosa dalam media PDY. Berdasarkan jalur biosintesisnya diprediksi produksi 8-HODE akan meningkat apabila konsentrasi sumber karbon semakin tinggi, oleh sebab itu 10 mg/L diambil sebagai konsentrasi terkecil dalam pemilihan level konsentrasi.
Fatty acid synthase
FasA, fas B Asam palmitat C16:0
Asam sterat C18:0 ppoA ppoB ppoC Asam oleat C18:1 sdeA, sdeB 8-HOE (PsiBβ)
Asam linoleat C18:2 8-HODE (PsiBα)
odeA 13S-,9S-HPODE
Asam linolenat C18:3
13S-,9S-HPOTE 8-HOTE (PsiBγ)
lox
Asam arakidonat C20:4 Prostaglandin
leukotriena
a bcd bcd bcd e - 0.1000 0.2000 0.3000 0.4000 0.5000 10 g/L 20 g/L 40 g/L 30 g/L 50 g/L [8 -H O D E ] (m g /L ) Konsentrasi Glukosa
Catatan: huruf yang berbeda menunjukkan beda nyata perlakuan pada taraf uji 5%
Gambar 23 Pengaruh konsentrasi glukosa terhadap produksi 8-HODE
Hasil percobaan menunjukkan konsentrasi glukosa berpengaruh nyata terhadap konsentrasi 8-HODE. Tidak sepeti asumsi awal bahwa peningkatan konsentrasi glukosa di dalam medium kultivasi akan meningkatkan produksi 8- HODE, ternyata peningkatan konsentrasi glukosa justru menurunkan konsentrasi 8-HODE (Gambar 23). Hasil ini menunjukkan bahwa peningkatan konsentrasi glukosa diatas 10 g.L di dalam medium kultivasi justru menekan jalur biosintesis 8-HODE di dalam kapang. Rawaling (1998) melaporkan bahwa konversi piruvat menjadi asetil Ko-A dikontrol langsung oleh enzim piruvat dihidrogenase pada produksi asam lemak oleh Saccharomyces cerevisae hanya dapat berlangsung pada kondisi glukosa terbatas. Hal ini diduga terjadi juga pada produksi 8-HODE oleh kapang C. lunata, dimana produksi 8-HODE justru menurun ketika konsentrasi glukosa dinaikkan lebih dari 10 g/L. Konsentrasi glukosa 10 g/L diambil sebagai titik tengah level glukosa pada optimasi komposisi medium produksi 8-HODE.
Pengaruh konsentrasi monosodium glutamat sebagai sumber nitrogen Pemilihan level konsentrasi monosodium glutamat sebagai sumber nitrogen dilakukan dengan melihat pengaruh konsentrasi monosodium glutamat di dalam medium kultivasi terhadap produksi 8-HODE. Konsentrasi terkecil
monosodium glutamat ditetapkan 4 g/L, setara dengan konsentrasi 3 g/L ekstrak khamir pada komposisi media PDY yang merupakan media basal produksi 8- HODE. a bcd bcde bcd de 0.000 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 4 g/L 8 g/L 12 g/L 16 g/L 20 g/L [8 -H O D E ] (m g /L )
Konsentrasi monosodium glutamat
Catatan: huruf yang berbeda menunjukkan beda nyata perlakuan pada taraf uji 5%
Gambar 24 Pengaruh konsentrasi monosodium glutamat dalam medium konsentrasi terhadap produksi 8-HODE
Hasil percobaan menunjukkan bahwa konsentrasi monosodium glutamat berpengaruh secara nyata terhadap produksi 8-HODE (Gambar 24). Konsentrasi 8-HODE meningkat tajam pada konsentrasi dibawah 8 g/L, dan kenaikan konsentrasi 8-HODE tidak lagi meningkat secara nyata ketika konsentrasi monosodium glutamat ditingkatkan diatas 8 g/L. Monosodium glutamat di dalam media kultivasi kapang akan menstimulasi akumulasi α-ketoglutarat (Hajjajet al., 2001), yang akan mendorong asetil Ko-A masuk ke jalur pembentukan asam lemak. Akumulasi α-ketoglutarat di dalam siklus asam sitrat diduga sudah mencapai kesetimbangan pada konsentrasi monosodium glutamat diatas 8 g/L sehingga penambahan konsentrasinya tidak dapat meningkatkan lagi konsentrasi 8-HODE. Dari hasil percobaan ini, konsentrasi 8 g/L ditetapkan sebagai titik tengah level monosodium glutamat pada optimasi komposisi medium produksi 8-HODE.
Pengaruh penambahan minyak jagung sebagaiinducer
Penelusuran level penambahan minyak jagung sebagai sumber lemak dilakukan dengan melihat pengaruh penambahan minyak jagung terhadap produksi 8-HODE. Konsentrasi minyak jagung terkecil ditetapkan 5 ml/L medium
dengan selang 5 ml. Penambahan 5 ml/L medium ditetapkan sebagai penambahan terkecil karena pada percobaan awal penambahan 5 ml/L mampu meningkatkan produksi 8-HODE dibandingkan medium tanpa penambahan minyak jagung. Asam linoleat yang terkandung pada minyak jagung adalah substrat bagi pembentukan 8-HODE pada kapang (Tsitsigiannis dan Keller, 2007), peningkatan penambahan minyak jagung diharapkan mampu meningkatkan produksi 8-HODE.
a b c de de 0.000 0.040 0.080 0.120 0.160 0.200 5 ml/L 10 ml/L 20 ml/L 15 ml/L 25 ml/L [8 -H O D E ] (m g /L )
Penambahan minyak jagung
Catatan: huruf yang berbeda menunjukkan beda nyata perlakuan pada taraf uji 5%
Gambar 25 Pengaruh penmbahan minyak jagung di dalam medium kultivasi terhadap produksi 8-HODE
Hasil percobaan menunjukkan bahwa volume penambahan minyak jagung di dalam media produksi 8-HODE berpengaruh nyata terhadap konsentrasi 8- HODE (Gambar 25). Gambar 25 juga menunjukkan apabila penambahan minyak jagung ditingkatkan lebih dari 5 ml/L, konsentrasi 8-HODE yang dihasilkan justru menurun. Omar et al. (2003) melaporkan bahwa produksi 13- HODE dari asam linoleat dengan menggunakan enzim lipoksigenase mencapai 75,8 % apabila asam linoleat yang digunakan 800 mg/L. Akan tetapi tingkat konversi menurun ketika konsentrasi asam linoleat dinaikkan, meskipun konsentrasi enzim dinaikkan dari 70 mg/L menjadi 100 mg/L. Kerja enzim lipoksigenase ternyata terhambat apabila konsentrasi asam linoleat terus ditingkatkan. Hal yang sama diduga menjadi penyebab menurunkannya produksi 8-HODE oleh kapang C. lunata, karena sintesa oksilipin pada kapang juga melibatkan enzim lipoksigenase, meskipun jenis enzim lipoksigenase yang
terlibat bisa berbeda-beda untuk masing-masing kapang. Dari hasil percobaan tersebut penambahan minyak jagung 5 ml/L ditetapkan sebagai titik tengah level untuk optimasi komposisi medium produksi 8-HODE.
Optimasi komposisi media produksi 8-HODE olehC. lunata
Metode respon permukaan adalah suatu cara empiris yang dapat digunakan untuk mengevaluasi hubungan antara suatu kelompok peubah dari suatu percobaan dan respon yang terukur berdasarkan suatu kriteria tertentu (Adinayarana dan Ellaiah, 2002). Pengetahuan terhadap pengaruh peubah yang akan diuji terhadap proses perlu diketahui terlebih dahulu untuk mendapatkan model yang lebih mendekati kenyataan. Berdasarkan penelitian pendahuluan yang sudah dilakukan sebelumnya glukosa sebagai sumber karbon, monosodium glutamat sebagai sumber nitrogen dan minyak jagung sebagai sumber asam lemak adalah peubah yang berpengaruh terhadap produksi 8- HODE oleh kapang endofit C lunata. Ketiga variabel tersebut dipilih untuk optimasi komposisi media produksi 8-HODE. Level konsentrasi masing-masing peubah juga ditetapkan berdasarkan percobaan pendahuluan. Hasil percobaan pendahuluan menghasilkan perkiraan titik tengah dari masing-masing peubah, dan berdasarkan hal tersebut disusun level konsentrasi untuk masing-masing peubah (Tabel 9a). Rancangan percobaan yang digunakan adalah central composite design, sedangkan optimasi model yang diperoleh dilakukan dengan metode respon permukaan.
Sebanyak 15 unit percobaan, yang terdiri dari 23(8) unit percobaan faktorial,
6 titik awal (starting point), dan 1 titik tengah (center point) telah dicoba. Hasil pengolahan data dengan perangkat lunak Design expert menunjukkan bahwa model kuadratik dan kubik secara nyata dapat menjelaskan data yang diperoleh (nilai p < 0,01) pada tingkat kepercayaan 99% (Lampiran 13). Karena model kubik teralisasi, yaitu ada kemungkinan lebih dari satu model persamaan, maka model kuadratik yang dipilih sebagai model untuk menjelaskan hubungan komposisi media dengan produksi HODE oleh kapangC. lunata.
Analisa ANOVA terhadap model menunjukkan model mampu menjelaskan hubungan antara peubah dan respon, akan tetapi hanya monosodium glutamate yang mempunyai pengaruh nyata terhadap produksi 8-HODE. Presentasi grafis dari hasil optimasi yang merupakan representasi hubungan antara respon dan peubah menunjukkan tidak ada nilai maksimum 8-HODE dengan adanya
perubahan masing-masing peubah (Gambar 26). Bas dan Boyaci (2007) melaporkan bahwa plot tersebut memberikan informasi yang sangat berharga tentang model yang menghubungkan peubah dengan respon. Plot yang tidak mempunyai nilai optimum menunjukkan bahwa model cocok tetapi tidak merepresentasikan keadaan sistem yang sesungguhnya.
Gambar 26. Plot kontur permukaan interaksi antar peubah terhadap produksi 8- HODE
Hasil optimasi model menghasilkan konsentrasi 8-HODE tertinggi 1.274 mg/L pada komposisi media glukosa 5 g/L, monosodium glutamat 8 mg/L dan minyak jagung 1 ml/L. Hasil optimasi menunjukkan bahwa konsentrasi 8-HODE tertinggi tidak tercapai pada titik tengah level dari masing-masing peubah. Hal ini mendukung hasil plot kontur yang menunjukkan bahwa model tidak terlalu dapat menggambarkan sistem yang sebenarnya dari hubungan komposisi media dan konsentrasi 8-HODE. Atas alasan tersebut dilakukan optimasi ulang dengan menggeser titik tengah level dari masing-masing peubah.
Optimasi kedua masih menggunakan rancangan percobaan central composite design, tetapi level peubah digeser kebawah sesuai dengan hasil optimasi pertama (Tabel 9b). Hasil pengolahan data dengan perangkat lunak Design expert menunjukkan bahwa model kuadratik dan kubik secara nyata dapat menjelaskan data yang diperoleh (nilai p < 0,01) pada tingkat kepercayaan 99% (Tabel 10). Karena model kubik teralisasi, yaitu ada kemungkinan lebih dari satu model persamaan, maka model kuadratik yang dipilih sebagai model untuk menjelaskan hubungan komposisi media dengan produksi HODE oleh kapangC. lunata.
Tabel 10 Hasil uji anova terhadap model
Sumber Jumlah
kuadrat db Rata-Ratakuadrat Nilai F Nilai P
Rata-rata 538,57 1 538,57 Linier 102,91 3 34,36 2,51 0,0708 Kuadratik 470,34 3 156,78 78,56 < 0,0001 Disarankan Kubik 33,09 3 8,27 8,27 0,0005 Teraliasi Sisa 42,75 34 1,26 Total 1242,25 48 25,88
Tabel 11 Hasil uji anova terhadap model respon permukaan kuadratik
Sumber Jumlah
kuadrat db Rata-ratakuadrat Nilai F mungkin>FNilai p
Model 627,85 9 69,76 34,96 < 0,0001 A-Glukosa 59,97 1 59,97 30,05 < 0.0001 B-Glutamat 42,86 1 42,86 21,48 < 0,0001 C-Minyak jagung 0,078 1 0,078 0,039 0,8445 AB 52,06 1 52,06 26,09 < 0,0001 AC 0,57 1 0,57 0,28 0,5967 BC 1,97 1 1,97 0,99 0,3271 A2 194,76 1 194,76 97,60 < 0,0001 B2 341,08 1 341,08 170,91 < 0,0001 C2 305,93 1 305,93 153,30 < 0,0001 Sisaan 75,83 38 1.99 Ketidakatepatan 53,95 5 10,79 16,27 < 0,0001 Galat 21,88 33 0,66 Total 703,68 47
Hasil uji anova terhadap model kuadratik kembali menunjukkan bahwa model kuadratik secara nyata (nilai p<0,01) dapat menjelaskan data yang ada (Tabel 11). Meskipun lack of fit dari residual tidak nyata, akan tetapi menurut Sathyanaryanan et al (2011), hal tersebut hanya mempunyai pengaruh 0,01% terhadap model. Dari model yang ada ternyata glukosa, monosodium glutamat, interaksi glukosa dan monosodium glutamat menunjukkan pengaruh nyata
terhadap produksi HODE oleh kapang C. lunata (nilai p<0,01), sedangkan minyak jagung hanya mempunyai pengaruh terhadap model pada tingkat kuadratnya
Tabel 12. Perkiraan koefisien peubah pada model
Peubah Perkiraan koefisien
Intersep 11,43 A-Glukosa 1,21 B-Glutamat 1,02 C-Minyak jagung 0,04 AB 0.79 1,47 AC -0,15 BC 0,29 A2 -2,65 B2 -3,50 C2 -3,32
Dari hasil analisa anova dan perkiraan pengaruh peubah (Tabel 12) maka model yang dapat menjelaskan hubungan antara pengaruh komposisi media terhadap produksi adalah sebagai berikut :
Y = 11,43 + 1,21A + 1,02B + 1,47AB – 2,650A2– 3,50B2– 3,32C2
dimana Y = konsentrasi 8-HODE, A = konsentrasi glukosa,
B = konsentrasi monosodium glutamat dan C = volume minyak jagung.
Dari persamaan di atas dapat dilihat bahwa semua peubah baik glukosa, monosodium glutamat dan minyak jagung mempunyai pengaruh nyata terhadap kadar 8-HODE di dalam cairan fermentasi. Dari model terlihat bahwa glukosa dan monosodium glutamat berpengaruh secara langsung terhadap 8-HODE yang dihasilkan kapang C. lunata, demikian juga dengan interaksinya. Minyak jagung, tidak seperti glukosa dan monosodium glutamat, hanya memberikan pengaruh pada tingkat kuadratnya.
Pengaruh masing-masing peubah komponen media tanpa interaksi ditunjukkan oleh Gambar 27. Gambar tersebut menunjukkan bahwa konsentrasi 8-HODE maksimum masing-masing tercapai pada level sekitar titik tengah dari masing-masing peubah. Hal ini menunjukkan bahwa pemilihan level peubah sudah tepat.
Gambar 27 Pengaruh masing-masing komponen media fermentasi terhadap produksi 8-HODE olehC lunata
Gambar 28 Plot kontur dan respon permukaan interaksi antara glukosa dan monosodium glutamat
Plot kontur adalah gambaran visual dari bentuk permukaan dari konsentrasi 8-HODE sebagai respon dari perubahan peubah independen, yang dalam hal ini adalah glukosa, monosodium glutamat dan minyak jagung. Bas dan Boyaci (2007) melaporkan apabila plot kontur interaksi dari dua peubah terhadap respon berbentuk lingkaran atau ellip dan titik maksimum berada ditengahnya menunjukkan bahwa model hasil optimasi dapat menggambarkan secara benar hubungan antara peubah dan repon.