Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian DNA untuk genotiping mikrosatelit dilakukan mulai tanggal 24 April sampai dengan 14 Juni 2007 di Laboratorium Molekuler dan Genetik Husdjursgenetik SLU, Uppsala, Swedia.
Pengambilan sampel darah sapi bersamaan dengan pengambilan sampel darah untuk analisis D-loop mtDNA. Empatpuluh sampel darah sapi Aceh dikoleksi dari masing-masing lokasi yaitu Kabupaten Aceh Besar (10 jantan, 30 betina); Kota Banda Aceh (11 jantan, 26 betina); Kabupaten Pidie (15 jantan, 25 betina); dan Kabupaten Aceh Utara (25 jantan, 15 betina), sehingga keseluruhan sebanyak 160 sampel (Gambar 5 dan Lampiran 3).
Sampel pembanding dikoleksi 10 sampel darah sapi Bali dari P3Bali (Pulau Bali); dua sampel darah sapi Madura dari Desa Kambingan Timur, Kecamatan Saronggi, Kabupaten Sumenep, Pulau Madura; dua sampel darah sapi PO dari Laboratorium Ternak Potong dan Kerja, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor; dan dua sampel darah sapi Pesisir dari Desa Sungai Liku, Kecamatan Ranah Pasir, Kabupaten Pesisir Selatan, Sumatera Barat (Gambar 5 dan Lampiran 4).
Gambar 5 Lokasi pengambilan sampel darah sapi Aceh dan sapioutgroup untuk analisis DNA mikrosatelit
Sumatera Barat Jawa Barat Bali Madura Aceh Utara Pidie Banda Aceh Aceh Besar
Isolasi, ekstraksi dan purifikasi DNA total dilakukan bersamaan pada saat isolasi DNA total untuk analisis daerah D-loop DNA mitokondria di Laboratorium Biologi Molekuler Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB), Institut Pertanian Bogor.
Pelaksanaan Pengambilan Sampel Darah
Pengambilan sampel darah sapi dilakukan dengan menggunakan venojact
(none) 5 ml pada vena jugularis dan dimasukkan ke dalam tabung centrifuge
14 ml yang berisi alkohol absolut sebagai pengawet dengan perbandingan 1:1. Semua tabung berisi sampel darah disimpan pada suhu kamar dan dibawa ke Laboratorium Biologi Molekuler Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB), Institut Pertanian Bogor dengan cara dimasukkan ke dalam kotak es (ice box).
Bahan-bahan dan Peralatan
Bahan pereaksi untuk PCR digunakan dari Applied Biosystems, Taq
polymerase Gold,Buffer tanpa MgCl2, 20 mM dNTP, 20 mM MgCl2, primer M13
oligo (20 mM M13 FAM, 20 mM M13 PET, 20 mM M13 NED, 20 mM M13 VIC), 20 µMprimerF dan R.
Mesin untuk menghitung konsentrasi DNA digunakan NanoDrop ND 1000
Spectrophotometer. Mesin PCR digunakanGeneAmp PCR System 9700 Applied
Biosystems. Mesin genotiping mikrosatelit digunakan ABI Applied Biosystems
HITACHI 3100 Genetic Analyzer dan mesin untuk denaturasi produk PCR
sebelum masuk mesin genotiping digunakan DNA Engine Gradient Cycler, MJ
Research PTC 200 Peltier Thermal Cycler.
PrimerMikrosatelit
Penelitian ini menggunakan 16 lokus mikrosatelit sebagai penanda molekul. Penanda-penanda dipilih berdasarkan yang direkomendasikan dalam Bishop et al. (1994), Vaiman et al. (1994) dan Sodhi et al. (2006) karena dapat menunjukkan polimorfisme pada sapi. Polimorfisme masing-masing lokus mikrosatelit diungkapkan dengan menggunakan sepasang primer mikrosatelit sapi.Primermikrosatelit tersebut adalah BM1818, INRA005, CSRM60, BM2113, HEL5, HEL9, HEL13, INRA63, INRA35, HEL1, ETH225, ETH10, CSSM66, BM1824, ILSTS006 dan ILSTS005 (Lampiran 15).
Amplifikasi Lokus Mikrosatelit
Mikrosatelit diamplifikasi melalui Polymerase Chain Reaction(PCR). Setiap reaksi PCR dibuat volume 10 µl dengan komposisi reaksi PCR mengandung 1 µl 1x buffer PCR; 1 µl MgCl2(20 mM); 0,2 µl dNTP (20 mM); 0,1 µl primer F (20 µM); 0,5 µlprimerR (20 µM); 0,5 µlprimer M13 oligo (FAM, VIC, PET atau NED); 0,2 µl Taq Polymerase(0,25 U) (ABIApplied Biosystems); 4,5 µl dH2O; dan 2 µl DNA (5 ng/µl). Pencampuran selalu dilakukan penambahan akhir Taq DNA
Polymerase.
Langkah denaturasi pada suhu 95oC selama 10 menit dilanjutkan dengan 14 siklus langkah denaturasi pada suhu 95oC selama 30 detik, 30 detikannealing
65-52 oC (-1oC/siklus) hingga tercapai temperatur primer yang optimal
‘touchdown cycle profile’, dan langkah elongasi pada suhu 72oC selama 30 detik.
Amplifikasi terakhir terdiri atas 30 siklus langkah denaturasi pada suhu 95oC selama 30 detik; 30 detik annealing pada suhu primer optimal 52oC; 30 detik elongasi pada suhu 72oC kemudian dilanjutkan dengan 7 menit langkah ekstensi akhir pada suhu 72oC dan suhu penyimpanan 4oC.
Elektroforesis Produk PCR
Disiapkan plate yang mempunyai 96 sumur dan dimasukkan 12 µl dari campuran 25 µl LIZ Size Standard 500 bp dan 1200 µl Hi-di Formamide
(tergantung jumlah sampel) pada setiap sumur. Produk PCR 1 µl masing-masing sampel dimasukkan ke dalam sumur yang telah berisi campuran LIZ Size
StandarddanHi-di Formamide (12 µl). Plateditutup dengangrey rubber-liddan
didenaturasi pada suhu 95 oC selama 4 menit. Plate kemudian diapit dengan
trayspesifik hitam pada bagian bawah dan trayspesifik putih pada bagian atas yang akan ditempatkan di dalam mesin ABI 3100. Ada dua tempat yang dapat ditempatkan di dalam mesin tersebut. Software mesin dijalankan sebelum dihidupkan mesin. Apabila semua fitur program menunjukkan tanda hijau, maka dapat dimulai impor sample sheetuntuk Plate Manager sebagai tempat muncul
electropherogram. Plate sampel dimasukkan, yaitu ditempatkan di dalam mesin
pada posisi A, dan apabila ada dua plate maka plate terakhir pada posisi B. Selanjutnya mesin siap dijalankan selama ±4 jam dan mesin akan menunjukkan tandacompletedjika proses genotiping telah selesai.
Hasil elektroforesis mesin ABI dapat dilihat dan dianalisis dengan software
Biosystems HITACHI 3100 Genetic Analyzer dengan ladder LIZ size Standard
500 bp. Software pada layar monitor akan menunjukkan peak dalam bentuk grafik-grafik dengan panjang tertentu dalambase pairs (bp) pada masing-masing sampel, dan ini menunjukkan alel-alel mikrosatelit dalam bentuk ukuran tertentu. Alel homozigot dan heterozigot ditentukan berdasarkan variasi ukuran-ukuran grafik yang ditunjukkan program tersebut. Tampilan grafik yang konsisten satu
peak menunjukkan sampel teramplifikasi memiliki satu alel (homozigot), dan sampel yang memiliki duapeakmenunjukkan dua alel (heterozigot). Apabila ada tampilan grafik sibuk yang tidak beraturan, ini menandakan hasil yang kosong, dan apabila diperoleh tanda sinyal yang lebih dari dua grafik, maka sampel tersebut tercemar dengan DNA yang lain dan tidak digunakan.
Angka pada ordinat X-axis merupakan ukuran alel dalam pasang basa
(basepairs) dan angka pada ordinat Y-axis merupakan sinyal warna (label/dye)
yang menunjukkan ketinggian puncak-puncak (peak) yaitu intensitas fluoresen dan menunjukkan konsentrasi hasil amplifikasi (Gambar 6).
Analisis Data
Analisis data alel dilakukan dengan menggunakan software GeneMapper
versi 4.0 (Applied Biosystems) dan hasil-hasil yang diperoleh dimasukkan ke dalam tabulasi data sheet Excel. Data yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan program Arlequin versi 3.11 (Excoffier et al. 2006) yang
didownload pada alamat: http://cmpg.unibe.ch/software/arlequin3 berdasarkan
petunjuk Krafsur et al. (2005), dukungan program Minitab versi 4.13 (Moore 2004) dan datasheetExcel 2007. Frekuensi-frekuensi alel, heterozigositas yang dihitung secara langsung dan heterozigositas harapan Hardy-Weinberg dihitung untuk masing-masing penanda sapi penelitian berbasis data frekuensi. Frekuensi alel setiap lokus mikrosatelit dihitung dengan rumus Nei (Nei 1987; Nei dan Kumar 2000).
Heterozigositas hitung (observed) diperoleh dari persamaan berikut: H = 2n(1 x2)/(2n)
i i
dengan xi merupakan jumlah masing-masing heterozigot pada lokus i; n adalah jumlah individu yang teramati.
Gambar 6 Sinyal fluoresen yang dihasilkan mesin ABI Prism 3100 DNA Analyzer
(Applied Biosystems) yang menunjukkan hasil amplifikasi DNA
mikrosatelit dengan menggunakan marker BM1818
Heterozigositas harapan (expected) Hardy-Weinberg diperoleh dari frekuensi-frekuensi alel yang teramati:
) 1 ( 1 ˆ 1 2
k i Pi n n Hdengan n adalah jumlah kopi gen di dalam sampel, k adalah jumlah haplotipe, dan piadalah frekuensi sampel dari haplotipe ke-i. (Nei 1987; Excoffier et al. 2006).
Keseimbangan Hardy-Weinberg dievaluasi dengan uji indeks Garza- Williamson (Garza dan Williamson 2001) dalam paket Arlequin, dengan menggunakan persamaan statistika G-W:
dengan k adalah jumlah alel yang terdapat pada lokus dalam populasi sampel dan R adalah selisih ukuran alel maksimum dan minimum. Apabila hasil pengujian antara nilai heterozigositas hitung (observed) dan heterozigositas harapan (expected) menunjukkan nilai P (probabilitas) < 5%, maka berbeda nyata, artinya dalam populasi sudah tidak lagi terjadi keseimbangan Hardy- Weinberg.
Jarak genetik standar Nei (Ds) digunakan rumus Nei (1987) dengan hitungan dari nilai heterozigositas yang diperoleh dari frekuensi-frekuensi alel.
Jyy
Jxx
Jxy
Ds
.
ln
;
r j mj i ijr
x
Jxx
2/
;
r j mj i ijr
y
Jyy
2/
;Jxy
x
y
r
r j mj i ij ij/
dengan Jxx adalah rataan diversitas seluruh lokus dalam populasi x, Jyy adalah rataan diversitas seluruh lokus dalam populasi y, Jxy adalah rataan jumlah hasil kali frekuensi populasi x dan y seluruh lokus, xij adalah frekuensi alel ke-i lokus ke-j populasi x, yij frekuensi alel ke-i lokus ke-j populasi y, i = alel ke-n, mj = jumlah alel lokus ke-j, dan j = lokus ke-n. Perhitungan jarak genetik dilakukan dengan menggunakan Arlequin.
Data matriks jarak genetik hasil Arlequin selanjutnya digunakan untuk membuat pohon filogeni dengan menggunakan metode Neighbor-Joining dalam
software program Phylip (phylogeny Inference Package) versi 3.67 dengan
aplikasi Neighbor.exe dari petunjuk Felsenstein (2007), hasilnya berbentuk file
outtree. Pembacaan dan pengaturan file outtree hasil dari analisis program
tersebut digunakansoftware program MEGA versi 4.0Beta Release (Tamura et al. 2007) dengan pilihan Root on Midpoint di submenu View, yaitu mengikuti pengaturan secara otomat pada pohon filogeni dari hasil analisis daerah D-loop