Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dimulai dari isolasi, ekstraksi dan purifikasi DNA, mendapatkan produk PCR dan sekuensing dilakukan pada bulan Agustus 2005 sampai dengan Agustus 2006 di Laboratorium Biologi Molekuler Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) Institut Pertanian Bogor. Sekuensing produk PCR daerah D-loop dilakukan di Laboratorium Bioteknologi PT Charoen Pokphand Indonesia, Tbk., Jakarta.
Pengambilan sampel darah sapi bersamaan dengan pengambilan sampel data fenotipik. Lokasi pengambilan sampel darah sapi Aceh meliputi Kabupaten Aceh Besar (satu sampel masing-masing dari Kecamatan Darul Imarah dan Balai Pembibitan Ternak di Kecamatan Indrapuri), Kota Banda Aceh (satu sampel masing-masing dari Kecamatan Lueng Bata dan Ulee Kareeng), Kabupaten Pidie (satu sampel masing-masing dari Kecamatan Padang Tidji dan Glumpang Baro), dan Kabupaten Aceh Utara (satu sampel masing-masing dari Kecamatan Baktiya Barat dan Cót Girek) (Gambar 4 dan Lampiran 2).
Gambar 4 Lokasi pengambilan sampel darah sapi Aceh dan sapioutgroupuntuk analisis daerahD-loopDNA mitokondria
Lokasi pengambilan sampel darah sapi pembanding dilakukan pada dua sampel darah sapi Bali dari P3Bali (Pulau Bali); dua sampel darah sapi Madura
Aceh Besar Sumatera Barat Jawa Barat Bali Madura Aceh Utara Pidie Banda Aceh
dari Desa Kambingan Timur, Kecamatan Saronggi, Kabupaten Sumenep, Pulau Madura; satu sampel darah sapi PO dari Laboratorium Ternak Potong dan Kerja, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor; dan dua sampel darah sapi Pesisir dari Desa Sungai Liku, Kecamatan Ranah Pasir, Kabupaten Pesisir Selatan, Sumatera Barat (Gambar 4 dan Lampiran 2).
Pelaksanaan Pengambilan Sampel Darah
Pengambilan sampel darah sapi dilakukan dengan menggunakan venojact
(none) 5 ml pada vena jugularis dan dimasukkan ke dalam tabung centrifuge
14 ml yang berisi alkohol absolut sebagai pengawet dengan perbandingan 1:1. Semua tabung berisi sampel darah disimpan pada suhu kamar dan dibawa ke Laboratorium Biologi Molekuler Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB), Institut Pertanian Bogor dengan cara dimasukkan ke dalam kotak es (ice box).
Bahan-bahan dan Peralatan
Bahan-bahan pereaksi untuk isolasi DNA, yaitu lysis buffer, digestion
buffer, rinse buffer, larutanphenol, larutan chloroform Iso Amyl Alcohol (CIAA),
etanol absolut, etanol 70%, larutan TE 1x, larutan TBE 10x. Bahan-bahan untuk visualisasi DNA hasil isolasi dan produk PCR, yaitu agarose standar, larutan TBE 1x, dan pewarnaethidium bromide.
Peralatan yang digunakan adalah venojact(none) 5 ml,ice box,centrifuge tube 14 ml, mikropipet P10, P20, P200, P1000 Gilson (France) beserta pipet tipnya,microtube eppendorf1.5 dan 0.2, gelas ukur, erlenmeyer dan gelas piala.
Peralatan elektronik digunakan mikrosentrifus (Eppendorf Centrifuge 5415 C); tungku pemanas (Sybron Thermolyne Nuova II Hot plate); vortex (Maxi Mix
Thermolyne 37600 Mixer); waterbath (Grand Incubator); kamera pengamatan
Mitsubishi video Copy Processor model P91E CB dilengkapi monitor (UVI Tec);
vacuum dryer (Centri Vap Concentrator, Labconco); magnetic stirrer (Mg 78);
electronic balance (AD HX 100); perangkat Submarine Electrophoresis;
voltage/current regulator(Kayaki PS100); dan Mesin PCR Parkin Elmer 2400.
PerancanganPrimerDaerahD-loopDNA Mitokondria
Daerah D-loopDNA mitokondria diamplifikasi dengan menggunakanprimer
TTT GGG TTA AG-3’, dengan panjang produk 980 bp. Primertersebut didesain menggunakan software Primer3 (http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/ primer/
primer3_www.cgi) pada sekuens D-loop DNA mitokondria Bos indicus (sapi
Nellore) GenBank yang diakses bebas di internet (Nomor Akses AY126697, Mirettiet al. 2002) pada alamat
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
.Tabel 1 Urutan basa dan suhu penempelanprimeruntuk mengamplifikasi daerah
D-loopsapi penelitian
Primer Sekuens Suhuannealing Panjang produk
BIDL-F BIDL-R 5’ACCCCCAAAGCTGAAGTTCT3’ 5’GTGCCTTGCTTTGGGTTAAG3’ 59 o C 980 bp
Isolasi dan Purifikasi DNA Total
Ekstraksi dan purifikasi DNA total dilakukan menurut metode Sambrook et al. (1989) yang dikembangkan Duryadi (1997), yaitu purifikasi total genom DNA dengan standar fenol, kloroform, iso amil alkohol (Chol-IAA) dan diikuti dengan presipitasi etanol absolut.
Tahap pertama dilakukan pencucian sampel darah menggunakan larutan low TE dengan pengulangan tiga kali. Sampel darah beralkohol diambil 250 µl dan dikeringkan, dimasukkan ke dalameppendorf1,5 ml dan ditambahkan 500 µl larutan low TE, selanjutnya divortex sampai merata dan disentrifus 3.000 rpm selama 2 menit. Larutan bagian atas dibuang secara dipipet dan diulangi lagi penambahan low TE. Selanjutnya, endapan divortexmerata, divacumselama 10 menit sampai kering.
Tahap selanjutnya yaitu sampel yang telah kering ditambahkan 500 µl larutan lysis buffer (Sukrosa 0,32 M, Triton X-100 1% w/v, MgCl2 5 mM, 1 mM Tris-HCl pH 7,4) dan digerus dengan menggunakan tongkat kaca selama 3 menit. Setelah halus, divortex merata, disentrifugasi 6.500 rpm selama 1 menit. Supernatan dibuang, endapannya ditambahkan 200 µl larutan rinse buffer (75 mM NaCl, 50 mM Titriplex III/EDTA ph 8,0). Divortex kembali sampai merata dan ditambahkan 500 µl larutandigestion buffer([STES : NaCl 200 mM, Tris-HCl pH 9,0 50 mM, EDTA pH 8,0 100 mM, SDS 1% mg/ml,ProteinaseK 0,5 mg/ml, RNAse 0,1 mg/ml)], enzim:proteinase K 0,5 mg/ml, 25 µl RNAse atau 40 mg/ml jika STES 9.750 ml). Divortexsesaat hingga homogen dan diinkubasi pada suhu 55oC selama semalam (±16 jam).
Lanjutan proses isolasi DNA, disiapkan tiga eppendorf baru yang ditandai sama. Sampel yang telah diinkubasi dibagi dua bagian dengan volume sama (satu bagian dimasukkan ke tube baru) secara dipipet, kemudian ke dalam masing-masing tabung ditambahkan 500 µl larutan fenol. Selanjutnya divortex
sampai homogen dan digoyang 20 menit serta disentrifugasi 13.000 rpm selama 3 menit. Lapisan bagian atas yang bersih diambil dengan pipet dan dimasukkan
ke eppendorf baru (dari dua eppendorf dengan sampel sama dijadikan satu
kembali) dan ditambah 500 µl larutan CIAA (CHCl3dan iso amil alkohol 1:1) serta digoyang 20 menit dan disentrifugasi 13.000 rpm selama 3 menit. Lapisan bagian atas yang lebih bersih dimasukkan ke eppendorf baru secara dipipet hingga volumenya ±500 µl, kemudian ditambahkan 1.000 µl (dua kali volume) etanol absolut dan dimiringkan 5-6 kali serta disimpan dalam freezer selama 30 menit. Selanjutnya disentrifugasi 13.000 rpm selama 5 menit, dilanjutkan dengan pembuangan alkohol dan dicuci dengan penambahan 400 µl alkohol 70%. Setelah disentrifugasi pada 13.000 rpm selama 3 menit, alkohol dibuang dan tepung berwarna putih (DNA) pada dasar eppendorf dikeringkan dengan arah tutupnya ke bawah. Apabila DNA telah kering, maka ditambahkan 50 µl larutan TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA pH 8,0). Sesudah itu divortex
sampai homogen, disentrifugasi pada 13.000 rpm selama ±4 detik dan diinkubasi pada 37oC selama 15 menit serta disimpan dalam freezer sampai saat digunakan.
Elektroforesis untuk Visualisasi DNA Hasil Isolasi
Disiapkan gel, yaitu agarose 0,6 g ditambah larutan 1xTBE 50 ml dan 50 ml aquades steril. Setelah campuran tersebut dipanaskan sampai mendidih, suhu diturunkan dengan cara pengadukan menggunakan stirrer dan ditambahkan 2,5 µl ethidium bromide. Selanjutnya larutan tersebut dituang ke dalam bak cetakan gel (baki) dan dipasang sisir pembuat sumur pada dudukannya. Setelah 45 menit, sisir dilepas perlahan-lahan dan gel ditempatkan di dalam bak alat elektroforesis dan dituang 1x buffer TBE ke dalam bak hingga sekitar 1 mm di atas permukaan gel. Sumur gel siap digunakan (maksimal 12 sumur).
Tergantung jumlah sampel dan kapasitas sumur, diambil 1 µl loading dye
dengan pipetor dan dicampur merata dengan 5 µl sampel DNA uji di atas plastik
cling, dimasukkan ke dalam sumur gel. Apabila sumur-sumur telah terisi dengan
pada tegangan 90 volt selama 30 menit. Pengamatan DNA dilakukan melalui video copy processor model P91E CB, monitor LCD, UVI Tec. Apabila pita-pita DNA pada gel terlihat tebal dan bersih, maka DNA tersebut tergolong bebas kontaminasi dan berkualitas baik.
Amplifikasi DaerahD-loopDNA Mitokondria
Daerah D-loop diamplifikasi melalui Polymerase Chain Reaction (PCR). Setiap reaksi PCR dibuat volume larutan 50 µl dengan komposisi 5 µl 10x buffer PCR; 2,5 µl MgCl2 (25 mM); 1 µl dNTP (40 mM); 0,25 µl Taq Polymerase (5 unit/µl) (Promega PCR Core System I no.cat.M7660, Madison, WI, USA); 1 µl
primerF (20 picomol/ µl); 1 µlprimer R (20 picomol/µl) (Amersham); 1-3 µl DNA
total sebagai DNA cetakan (17,44-413,51 ng/µl); dH2O (Invitrogen) sampai volume 50 µl. Pencampuran selalu dilakukan penambahan akhir Taq DNA
Polymerase.
Kondisi PCR untuk mengamplifikasi produk PCR adalah, pra PCR: denaturasi 94oC selama 2 menit; PCR: 94oC denaturasi 30 detik, 59oCannealing
45 detik dan 72oC elongasi 1 menit sebanyak 35 siklus; dan postPCR: ekstensi 72oC selama 5 menit dan terakhir 4oC suhu penyimpanan.
Kualitas produk PCR diketahui dengan cara dimigrasikan pada gel agarose 1,2% dalam buffer 1xTBE tegangan 90 volt selama 45 menit. Pengamatan dilakukan dengan bantuan video copy processor model P91E CB, monitor LCD, UVI Tec, setelah diwarnai dengan ethidium bromide. Penunjuk ukuran produk PCR digunakan penanda standar 100 bp DNAleader.
Penentuan Sekuens Nukleotida
Penentuan sekuens nukleotida daerah D-loop dilakukan di Laboratorium Molekuler DNA PT Charoen Pokphand Indonesia, Tbk. Tabungeppendorfberisi produk PCR dibawa ke Laboratorium tersebut dalam kondisi dingin dengan memasukkannya ke dalam kotak es berpendinginice pack.
Sampel produk PCR dimurnikan dengan menggunakan QIA-Quick PCR Purification Kit (Qiagen). Sampel produk PCR yang telah dipurifikasi diukur konsentrasinya menggunakan spektrofotometer (UV-VIS Spectrophotometer-
Shimizu) pada =260 nm. Selanjutnya dipergunakan sebagai template untuk
Produk PCR diamplifikasi dengan menggunakanBigDye Terminator v.3.1
Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, USA) dalam mesin PCR. Peng-
gunaan primer dan siklus sekuensing sama seperti untuk PCR normal. Kondisi untuk reaksi penentuan sekuens adalah denaturasi 94oC selama 2 menit; selanjutnya denaturasi 94oC selama 30 detik, 59oCannealing 45 detik, dan 72oC elongasi 1 menit sebanyak 35 siklus; dan diakhiri ekstensi 72oC selama 5 menit. Kelebihan dari bahan reaksiBigDye Terminator danprimer dibuang dari produk siklus sekuensing berdasarkan petunjuk penggunaan pada ABI Prism 3100-
Avant Genetic Analyzer, yaitu dengan tahapan: sebanyak 20 µl produk,
ditambahkan 5 µl EDTA 125 mM dan 60 µl alkohol absolut. Tabung digoyang- goyangkan beberapa kali, diinkubasi pada suhu kamar selama 15 menit. Selan- jutnya, disentrifugasi 6000 rpm pada suhu 4oC selama 30 menit. Supernatan dibuang dan ditambahkan 60 µl alkohol 70%, disentrifugasi 4500 rpm pada suhu 4oC selama 15 menit dan supernatan dibuang. Pada tahap berikut diulangi penambahan alkohol 70% sebanyak 60 µl dan disentrifugasi 4500 rpm pada suhu 4oC selama 15 menit. Tabung dikeringkan dalam alat penguapan selama 2 menit dan ditambahkan 10 µl Hi-di Formamide. Selanjutnya didenaturasi pada suhu 95oC selama 4 menit dan segera ditempatkan di atas es selama 5 menit.
Analisis sekuensing DNA menggunakan ABI Prism 3100-Avant Genetic
Analyzer. Sebanyak 10 µl produk-produk PCR yang telah dipurifikasi dan
didenaturasi dalam siklus sekuensing dimasukkan ke dalam satu plate yang mempunyai 96 sumur. Dibuat plate rekaman di dalam program software koleksi sekuensing. Mesin sekunser dijalankan sampai electropherogrammenunjukkan bahwa semua fragmen DNA mengalir sepanjang kapiler array dan dideteksi dengan pendeteksi laser. Electropherogramakan muncul dan kini tersedia bagi analisis bioinforrnatika.
Analisis Data
Pensejajaran runutan basa nukleotida D-loop dilakukan dengan menggunakan software Squint Alignment Editor versi 1.02 dari situs
Bioinformatics Institute pada alamat www.Bioinformatics.org.nz dan software
program MEGA versi 4.0 Beta Release (Tamura et al. 2007). Hasil analisis program MEGA diperoleh matriks jarak genetik (D) 2 parameter Kimura berdasarkan persamaan basa nukleotida, dan pohon filogeni digunakan metode