Tiga isolat bakteri terpilih yang menunjukkan penghambatan kuat terhadap pertumbuhan R. solani dan menekan perkembangan penyakit hawar pelepah padi pada pengujian sebelumnya yaitu isolat SS19, TT47, dan isolat BR2. Penampilan koloni ketiga isolat tersebut pada medium nutrient agar disajikan pada Gambar 9.
Gambar 9 Morfologi koloni isolat bakteri agens hayati: SS19 koloni berbentuk sirkular, pinggiran rata, berwarna putih bening; TT47 koloni berbentuk sirkular, pinggiran rata, berwarna kuning; dan BR2 koloni berbentuk tidak beraturan, pinggiran berombak, berwarna putih susu. Uji fitotoksisitas bakteri agens hayati. Pengujian isolat bakteri agens hayati sebagai perlakuan benih (seed treatment) menunjukkan bahwa daya kecambah, panjang akar dan panjang batang tidak berbeda nyata dengan kontrol (Tabel 4 dan Gambar 10). Hal ini berarti seluruh isolat bakteri antagonis tidak bersifat fitotoksis dan memiliki kemampuan meningkatkan daya kecambah serta meningkatkan panjang akar meskipun kemampuan tersebut tidak berbeda nyata dengan kontrol. Dengan kata lain disamping tidak bersifat fitotoksis, isolat bakteri tersebut juga dapat meningkatkan pertumbuhan tanaman. Dengan demikian isolat bakteri tersebut dapat digunakan sebagai seed treatment untuk melindungi bibit dari serangan patogen dan memperbaiki vigor bibit.
Tabel 4 Daya kecambah, panjang akar, dan panjang batang bibit padi setelah diberi perlakuan isolat bakteri agens hayati
Isolat/ Perlakuan Daya kecambah (%) Panjang akar (cm) Panjang batang (cm) SS19 100 a 4,6 a 2,9 a TT47 94,6 a 5,1 a 2,7 a BR2 98,3 a 4,8 a 3,0 a Air steril (K) 94,2 a 4,1 a 3,0 a
Rataan selajur yang diikuti oleh huruf yang sama tidak berbeda nyata menurut uji selang ganda Duncan pada taraf 5%.
Gambar 10 Kecambah benih padi setelah diberi perlakuan bakteri agens hayati: isolat SS19 (A), isolat TT47 (B), isolat BR2 (C), dan tanpa perlakuan isolat bakteri (D).
Uji produksi siderofor. Uji produksi siderofor terhadap isolat SS19, TT47, dan BR2 mengindikasikan bahwa ketiga isolat bakteri tersebut menghasilkan siderofor. Isolat TT47 menunjukkan pembentukan daerah bening di sekeliling koloninya yang lebih luas dibandingkan dengan daerah bening yang dibentuk oleh isolat SS19 ataupun BR2. Hal ini mungkin disebabkan oleh jenis dan jumlah siderofor yang dihasilkan isolat tersebut berbeda.
Siderofor merupakan senyawa pengelat besi yang disekresikan oleh suatu mikroorganisme pada kondisi tempat tumbuhnya kekurangan zat besi. Senyawa tersebut berperan penting dalam menekan penyakit tanaman melalui mekanisme persaingan zat besi. Hasil penelitian Chaiharn et al. (2009) menunjukkan bahwa terdapat hubungan yang kuat antara bakteri antagonis yang menghasilkan siderofor dengan kemampuannya menekan pertumbuhan beberapa cendawan patogen pada tanaman padi.
Uji produksi enzim kitinase. Hasil uji produksi enzim kitinase terhadap isolat SS19, TT47, dan isolat BR2 menunjukkan bahwa isolat SS19 dan isolat TT47 menghasilkan enzim kitinase, sedangkan isolat BR2 tidak menghasilkan enzim kitinase.
Enzim kitinase (EC3.2.1.14) merupakan suatu enzim yang mampu mendegradasi polimer kitin menjadi kitin oligosakarida atau monomer N- asetilglukosamin. Enzim ini dapat dihasilkan oleh bakteri, cendawan, tanaman, dan hewan. Namun demikian jenis kitinase yang dihasilkan memiliki spesifitas yang bervariasi terhadap substrat dan karakteristik yang berlainan (Arora et al.
2007). Bakteri menghasilkan kitinase sebagai sarana memperoleh nutrisi dan agens parasistisme, cendawan mengeluarkan kitinase untuk proses morfogensis, sedangkan tanaman memproduksi kitinase untuk mempertahankan diri dari patogen (Gooday 1994).
Bakteri yang menghasilkan enzim kitinase berpotensi besar dimanfaatkan sebagai agens hayati. Enzim kitinase yang dihasilkan digunakan untuk menghidrolisis polimer kitin untuk memperoleh karbon, nitrogen, dan energi. Hal ini mengakibatkan bakteri penghasil enzim kitinase dapat menekan pertumbuhan dan perkembangan cendawan patogen, nematoda atau serangga hama karena kitin merupakan komponen struktural dari sebagian besar dinding sel organisme tersebut (Adams 2004). Kerusakan komponen kitin suatu organisme mengakibatkan kekuatan struktur dinding sel menjadi berkurang, terganggunya proses fisiologis sel, gangguan pertumbuhan, dan kelangsungan hidupnya.
Selain enzim kitinase, suatu bakteri dapat juga menghasilkan enzim ekstraselular atau senyawa metabolit lainnya, seperti enzim glukanase, siderofor, asam salisilat, dan hidrogen sianida. Kemampuan suatu bakteri menghasilkan produk metabolit tersebut berkorelasi positif dengan potensi antagonistiknya terhadap cendawan patogen (Nagarajkumar et al. 2004). Bakteri yang menghasilkan kitinase dan produk metabolit lainnya tidak hanya dapat menekan pertumbuhan dan perkembangan cendawan patogen tetapi juga dapat meningkatkan pertumbuhan dan hasil tanaman (Dey et al. 2004).
Uji pelarutan fosfat. Hasil uji pelarutan fosfat terhadap isolat SS19, TT47, dan BR2 menunjukkan bahwa ketiga isolat tersebut dapat melarutkan fosfat. Kemampuan isolat bakteri melarutkan fosfat merupakan salah satu faktor penting bagi isolat yang akan menjadi kandidat sebagai agens hayati mengingat fosfat adalah unsur esensial kedua setelah nitrogen yang berperan penting dalam proses fotosisntesis dan perkembangan akar tanaman.
Dalam tanah, mikroorganisme yang mampu melarutkan fosfat akan melarutkan fosfat organik dan anorganik menjadi fosfat terlarut sehingga dapat digunakan/diserap oleh akar tanaman dan mikrob tanah lainnya. Mikrob tersebut juga dapat melarutkan unsur P yang terikat pada unsur lain (Fe, Al, Ca, dan Mg) sehingga unsur P tersebut menjadi tersedia bagi tanaman (Rao 1982)
Pada tanah-tanah masam, fosfat akan bersenyawa dalam bentuk-bentuk Al- P, Fe-P, dan occluded–P, sedangkan pada tanah-tanah alkali, Fosfat akan bersenyawa dengan kalsium (Ca) sebagai Ca-P membentuk senyawa kompleks yang sukar larut. Untuk itu diperlukan penambahan mikrob yang dapat meningkatkan ketersediaan fosfat dan meningkatkan efisiensi pemupukan P. Salah satunya adalah dengan penambahan mikrob pelarut fosfat yang tersedia secara alami dalam tanah.
Identifikasi Isolat Bakteri Agens Hayati
Identifikasi secara molekuler. Hasil amplifikasi gen 16S rRNA dari genom isolat SS19, TT47, dan BR2 disajikan pada Gambar 11. Hasil identifikasi secara molekuler terhadap sekuens parsial 16S rRNA dari 3 isolat tersebut menunjukkan bahwa isolat SS19, TT47, dan BR2 secara berturut-turut mirip dengan Serratia marcescens (94%), Ralstonia pickettii (98%), dan Bacillus subtilis (99%) (Tabel 5 dan Lampiran 2).
Gambar 11 Elektroforesis gel agaros 1% hasil amplifikasi gen 16S rRNA dari genom isolat bakteri agens hayati. Marker DNA (M), isolat SS19 (1), isolat TT47 (2), dan isolat BR2 (3).
Tabel 5 Identifikasi secara parsial sekuen 16S rRNA dari isolat bakteri SS19, TT47, dan BR2 menggunakan program BLAST
Kode isolat
Asal isolat Nomor akses
Identitas
(%) Spesies
SS19 Tanah sawah, Subang JF317349.1 94 Serratia marcescens
TT47 Tanah tegalan, Tembilahan HQ696445.1 98 Ralstonia pickettii
BR2 Tanah tegalan, Bogor JN644613.1 99 Bacillus subtilis
Tiga jenis bakteri terbaik yang teridentifikasi sebagai S. marcescens SS19, R. pickettii TT47, dan B. subtilis BR2 merupakan jenis bakteri yang telah banyak dimanfaatkan dalam kehidupan manusia. Bakteri S. marcescens telah digunakan sebagai agens pengendali hayati penyakit hawar pelepah padi (Someya et al.
2003). Namun peneliti lainnya melaporkan bahwa S. marcescens strain W2.3 (JF317349.1) yang memiliki kemiripan 94% terhadap isolat SS19 merupakan bakteri patogen pada ikan (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/JF317349). Sementara itu sejumlah isolat R. pickettii diketahui memiliki potensi besar sebagai agens bioremediasi dan mampu mendegradasi sejumlah senyawa toksik (Ryan et al. 2007; Elango et al. 2006), memiliki kemampuan hidup dan tumbuh dengan cepat dalam kondisi nutrisi rendah (oligotrofik) (McAlister et al. 2002), serta belum pernah dilaporkan terdeteksi sebagai patogen pada tanaman dan hewan. R. pickettii strain KTO-35 (HQ696445) yang memiliki kemiripan 98% terhadap
1500 bp
isolat TT47 merupakan bakteri endofit pada tanaman Populus euphratica
(http://www.ncbi. nlm.nih.gov/nuccore/HQ696445.1). Begitu juga dengan B. subtilis telah banyak dilaporkan dapat dikembangkan sebagai agens pengendalian hayati berbagai penyakit tanaman (Leelasuphakul et al. 2008; Sign et al. 2008; Grover et al. 2010). Sementara itu, B. subtilis strain MP_17 1B (JN644613.1) yang memiliki kemiripan 99% terhadap isolat BR2 dilaporkan sebagai bakteri yang yang hidup dalam saluran pencernaan nyamuk Culex quinquefasciatus
(http://www.ncbi. nlm.nih.gov/nuccore /348161525).
Identifikasi karakter morfologi dan biokimia. Hasil pengujian terhadap beberapa karakter morfologi dan biokimia isolat SS19, TT47, dan BR2 disajikan pada Tabel 6 dan Gambar 12. Hasil pengujian membuktikan bahwa sebagian besar karakter isolat SS19, TT47, dan BR2 yang diperoleh berturut-turut termasuk dalam karakter Serratia marcescens, Ralstonia pickettii, dan Bacillus subtilis, dengan tingkat kemiripan masing-masing 94, 98, dan 99%.
Gambar 12 Uji produksi asam dari gula manitol terhadap isolat bakteri SS19, TT47, dan BR2: medium warna kuning mengindikasikan ada produksi asam, medium warna biru mengindikasikan tidak ada produksi asam, dan K- adalah perlakuan gula manitol tanpa bakteri.
Tabel 6 Karakter morfologi, biokimia, dan pertumbuhan isolat bakteri SS19, TT47, dan BR2 Karakter Isolat SS19 TT47 BR2 Morfologi koloni: - Ukuran (mm) 2 1,5 4
- Bentuk Sirkular Sirkular Tidak beraturan
- Elevasi Agak cembung Agak cembung Datar
- Pinggiran Rata Rata Berombak
- Warna Putih bening Kuning tua Putih susu
- Permukaan Licin Licin Licin
Morfologi sel Batang Batang Batang
Reaksi Gram Gram negatif Gram negatif Gram positif Ukuran sel (µ m) 0,5 x 1,0 1,0 x 4,0 0,5 x 1,75
Endospora Tidak ada Tidak ada Ada
Motil Ya Ya Tidak
Biokimia:
- Arginin dehidrolase Tidak ada Tidak ada Tidak ada - Gelatin hidrolase Tidak ada Tidak ada Tidak ada - Produksi asam dari gula:
Arabinosa Tidak Tidak Tidak
L-Arginin Tidak Tidak Tidak
Manitol Ya Tidak Tidak
Xylose Tidak Tidak Tidak
- Uji VP Ya Ya Tidak
Pertumbuhan:
- Suhu 40oC Tumbuh Tumbuh Tumbuh
- Suhu 4oC Tidak tumbuh Tidak tumbuh Tidak tumbuh
SIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa isolat bakteri SS19, TT47, dan BR2 adalah tidak bersifat fitotoksis, dapat meningkatkan pertumbuhan tanaman, memproduksi sederofor, dan mampu melarutkan fosfat. Isolat bakteri SS19 danTT47 dapat menghasilkan enzim kitinase sedangkan isolat BR2 tidak menghasilkan enzim kitinase. Berdasarkan hasil identifikasi secara molekuler terhadap gen 16S rRNA dan beberapa karakter morfologi dan biokimia
menunjukkan bahwa isolat bakteri SS19, TT47, dan BR2 secara berturut-turut teridentifikasi sebagai Serratia marcescens, Ralstonia pickettii, dan Bacillus subtilis, dengan tingkat kemiripan 94, 98, dan 99%.
DAFTAR PUSTAKA
Adams DJ. 2004. Fungal cell wall of chitinases and glucanases. Microbiology
150: 2029-2035.
Arora NK, Kim MJ, Kang SC, Maheshwari DK. 2007. Role of chitinase and β- 1,3-glukanase activities produced by a fluorecent pseudomonad and in vitro
inhibition of Phythopthora capsici and Rhizoctonia solani. Can J Microbiol
53: 207-212.
Chaiharn M, Chunhaleuchanon S, Lumyong S. 2009. Screening siderofor producing bacteria as pontential biological control agents for fungal rice pathogens in Thailand. World J Microbiol Biotechnol 25: 1919-1928. Cowan ST. 1974. Manual for The Identification of Medical Bacteria. Ed ke-2.
Cambridge:Cambridge University Press.
Dey R, Pal KK, Bhatt DM, Chauhan SM. 2004. Growth promotion and yield enhancement of peanut (Arachis hypogaea L.) by application of plant growth-promoting rhizobacteria. Microbiol Res 159: 371-394.
Elango VE. Liggenstoffer AS, Fathepure BZ. 2006. Biodegradation of vinyl chloride and cis-dichloroethene by a Ralstonia sp. strain TRW-1. Appl Microbiol Biotechnol 72: 1270–1275.
[EPA] Environmental Protection Agency. 1997. Bacillus subtilis Final Risk
Assessment
2011].
Gooday GW. 1994. Physiology of Microbial Degradation of Chitin and Chitosan. Di dalam, Ratledge C, Editor. Biochemistry of Microbial Degradation. Netherlands: Kluwer Academic Publ. 279-312.
Grover M, Nain L, Singh SB, Saxena AK. 2010. Molecular and biochemical approaches for characterization of antifungal trait of a potent biocontrol agent Bacillus subtilis RP24. Curr Microbiol 60: 99–106.
Holt JG, Krieg NR, Sneath PHA, Staley JT, Williams ST. 1994. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. Ed ke-9. Maryland:Williams & Wilkins.
Husen E. 2003. Screening of soil bacteria for plant growth promotion activities
Leelasuphakul W, Hemmanee P, Chuenchitt S. 2008. Growth inhibitory properties of Bacillus subtilis strains and their metabolites against the green mold pathogen (Penicillium digitatum Sacc.) of citrus fruit.
Postharvest Biol Technol 48: 113–121.
McAlister MB, Kulakov LA, O’Hanlon JF, Larkin MJ, Ogden KL. 2002. Survival and nutritional requirements of three bacteria isolated from ultrapure water. J Ind Microbiol Biotechnol 29, 75–82.
Mew TW. Cottyn B, Pamplona R, Barrios H, Xiangmin L, Zhiyi C, Fan L, Nilpanit N, Arunyanart P, Kim PV, Du PV. 2004. Applying rice seed- associated antagonistic bacteria to manage rice sheath blight in developing countries. Plant Dis 88: 557-564.
Nagarajkumar M, Bhaskaran R, Velazhahan R. 2004. Involvement of secondary metabolites and extracelluler lytic enzymes produced by Pseudomonas fluorescens in inhibition of Rhizoctonia solani, the rice sheath blight pathogen. Microbiol Res 159: 73-81.
[NFNA] The National Forest and Nature Agency. 2000. Risk assessment of genetically modified derivatives of Pseudomonas fluorescens F 133 for use in bioremediation of PCB contaminated soil. Ministry of Environment and
Energy, Denmark.
[3 Januari 2012].
Rao AVS, Venkateswarin B, Kami P. 1982. Isolation of phosphate disolving soil actinomycete. Curr Sci 51: 1117-118.
Ryan MP, Pembroke JT, Adley CC. 2007. Ralstonia picketii in environmental biotechnology: potential and applications. J Appl Microbiol 103: 754-764. Sambrook J, Russel R. 2001. Molecular Cloning A Laboratory Manual. Ed ke-3.
Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York.
Sign N, Pandey P, Dubey RC, Maheshwari DK. 2008. Biological control of root rot fungus Macrophomina phaseolina and growth enhancement of Pinus oxburghii (Sarg.) by rhizosphere competent Bacillus subtilis BN1. World J Microbiol Biotechnol 24:1669–1679.
Singh PP, Shin YC, Park CS, Chung YR. 1999. Biological control of fusarium wilt of cucumber by chitinolytic bacteria. Phytopathology 89: 92-99.
Someya N, Nakajima M, Watanabe T, Hibi, Akutsu K. 2003. Influence of bacteria isolated from rice plants and rhizospheres on antibiotic production by the antagonistic bacterium Serratia marcescens strain B2. J Gen Plant Pathol 69: 342-347.
Supriadi 2006. Analisis risiko agens hayati untuk pengendalian patogen pada tanaman. J Lit Pert 25: 75-80.
AKTIVITAS SENYAWA BIOAKTIF ANTICENDAWAN DARI Ralstonia pickettii TT47 DAN Bacillus subtilis BR2 TERHADAP Rhizoctonia solani