Penelitian dilakukan di Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan dan di Rumah Kaca, Departemen Proteksi Tanaman, IPB, Bogor. Penelitian dilaksanakan sejak bulan Agustus 2009 sampai dengan Februari 2011.
Respon Varietas Padi terhadap R. solani
Penyediaan patogen (R. solani). Cendawan R. solani diisolasi dari tanaman padi yang menunjukkan gejala penyakit hawar pelepah di daerah
Cikarawang, Bogor. Isolasi menggunakan medium Potato Dextrose Agar (PDA),
dengan komposisi: ekstrak kentang 200 g/l, 20 g/l dekstros, dan15 g/l agar.
Sebelum digunakan dalam pengujian, R. solani yang diperoleh diidentifikasi
secara visual dan mikroskopis serta diuji patogenisitasnya pada tanaman padi. Biakan murni dan miselium R. solani yang digunakan dalam penelitian di sajikan pada Gambar 3.
Gambar 3 Rhizoctonia solani penyebab penyakit hawar pelepah pada tanaman padi: biakan murni pada medium PDA (A); miselium (B).
Uji patogenisitas dilakukan dengan cara menginokulasikan potongan
miselium (diameter 0,5 cm) cendawan R. solani ke bagian pangkal batang
tanaman padi umur 3 minggu yang telah dipersiapkan sebelumnya. Untuk membentuk kondisi lembab, tanaman yang telah diinokulasi disungkup dengan kantong plastik. Setelah diinkubasi selama 7 hari, gejala berupa bercak-bercak besar dengan bagian tengah berwarna putih pucat terlihat di sepanjang pelepah daun yang diinokulasi. Hal ini mengindikasikan bahwa isolat cendawan yang diuji bersifat patogenik terhadap tanaman padi.
B
Pengujian respon varietas padi. Pengujian respon varietas padi terhadap penyakit hawar pelepah menggunakan metode skrining micro-chamber (Jia et al. 2007). Empat belas varietas padi yang digunakan merupakan kelas benih dasar (foundation seed) yang diperoleh dari Unit Penyediaan Benih Sumber, Balai Besar Penelitian Tanaman Padi Sukamandi. Varietas padi tersebut adalah Cibogo, Cigeulis, Ciherang, Cilamaya Muncul, Ciliwung, Cisantana, Inpara 2, Inpari 13, IR 42, IR 64, Mekongga, Membramo, Situ Bagendit, dan Way Apo Buru. Sebelum dilakukan penanaman, disiapkan kantong plastik bening (ukuran 30 x 60 cm) dengan seperempat bagiannya berisi tanah steril. Bagian kantong berisi tanah ditempatkan ke dalam pot (diameter 15 cm, tinggi 15 cm) sedangkan tiga per empat bagiannya yang tidak berisi tanah difungsikan sebagai micro-chamber.
Bibit padi tiap varietas yang akan diuji disemai dalam bak persemaian yang sudah disiapkan. Kemudian dipilih bibit yang menunjukkan pertumbuhan seragam dan ditanam sebanyak 5 bibit/pot, dengan ulangan 4 kali. Setelah tanaman berumur 3 minggu (3-4 helai daun), tiap tanaman diinokulasi dengan menempelkan 1 potongan miselium biakan cendawan R. solani (diameter 0,5 cm) umur 3 hari ke bagian pangkal batang tanaman. Setelah itu bagian kantong plastik bening yang tidak diisi tanah diselimutkan menutupi tanaman padi dengan bagian ujungnya direkat dengan stapler agar terbentuk kondisi lembab. Kondisi lembab tersebut dipertahankan hingga terlihat ada tanaman mati yang disebabkan oleh R. solani yang diinokulasikan. Penyiraman dilakukan melalui bagian ujung kantong plastik yang terbuka dekat perekatan stapler (Gambar 4).
Gambar 4 Inokulasi R. solani ke bagian pangkal batang tanaman padi (A) dan pemasangan micro-chamber (B).
Pengamatan dilakukan terhadap indeks penyakit, keparahan penyakit, dan kejadian penyakit. Indeks penyakit dihitung berdasarkan rumus sebagai berikut (Jia et al. 2007):
Indeks penyakit = x 9
Keterangan: 9 = skor tertinggi gejala penyakit hawar pelepah padi menurut sistem evaluasi standar IRRI (http://www.knowledgebank. irri.org/extension/index.php/crop-damage-diseases/sheath- blight-shb
Keparahan penyakit dan keberadan penyakit dihitung berdasarkan rumus berikut: ). Keparahan penyakit = x 100% Kejadian penyakit = x 100%
Kriteria ketahanan varietas dikelompokan sebagai berikut: indeks penyakit <3 = tahan, 3-5 = agak tahan, >5-7 = agak rentan, dan >7-9 = rentan. Data yang diperoleh dianalisis dengan sidik ragam dan uji lanjut selang ganda Duncan pada taraf 5%.
Eksplorasi dan Seleksi Bakteri Agens Hayati
Penyediaan bakteri agens hayati. Bakteri diisolasi dari contoh tanah sawah, tanah tegalan, tanah aliran sungai, air, dan bagian tanaman padi yang berasal dari beberapa lokasi dan ekosistem. Isolasi bakteri menggunakan metode pengenceran berseri. Sebanyak 10 g contoh tanah, bagian tanaman, atau air, masing-masing diencerkan dengan 90 ml air steril yang mengandung 0,85% NaCl dalam tabung Erlenmeyer 250 ml. Campuran dalam setiap tabung Erlenmeyer dikocok hingga merata, kemudian dibuat pengenceran 10x secara berseri hingga 10-3. Selanjutnya, 0,1 ml masing-masing enceran 10-3 disebar ke dalam cawan petri yang berisi medium King’s B agar (KBA) (20 g protease pepton, 1,5 g K2HPO4, 1,5 g MgSO4.7H2O, 15 ml gliserol, dan 15 g agar dalam 1 l akuades),
nutrient agar (NA), water-yeast extract agar (WYE) (0,25 g yeast extract, 0,5 g K2HPO4, dan 18 g agar dalam 1 l akuades) (Crawford et al. 1993), dan medium
Tinggi letak bercak Tinggi tanaman
Tinggi letak bercak Tinggi tanaman Jumlah tanaman bergejala Jumlah tanaman diamati
yeast and malt extract (YM) selektif (4 g glukosa, 10 g malt extract, dan 4 g yeast extract dalam 1 l akuades, serta 20 mg trimethoprim, 50 mg griseofulvin, dan 50
mg nystatin dalam 1 l medium) (Fotso et al. 2008). Sedangkan untuk
mendapatkan isolat bakteri yang membentuk spora, suspensi pengenceran 10-3
dipanaskan dalam penangas air pada suhu 80 o
Sediaan diinkubasi pada suhu ruang hingga berbagai macam bentuk koloni bakteri tumbuh. Koloni bakteri yang tumbuh pada medium KBA dicek di bawah
lampu ultraviolet untuk membedakan kelompok bakteri Pseudomonas
berfluoresensi dengan bakteri lainnya. Koloni Pseudomonas berfluoresensi (memendarkan warna hijau kekuningan) dan koloni bakteri lainnya dengan karakter berbeda dipindahkan pada medium KBA baru hingga diperoleh biakan murni. Sementara itu, koloni bakteri yang tumbuh pada medium YM dipindahkan pada medium YM baru hingga murni. Kemudian tiap koloni yang diperoleh diperiksa di bawah mikroskop binokuler untuk membedakan kelompok aktinomiset dengan bakteri lainnya. Koloni bakteri dengan karakter berbeda yang tumbuh pada medium TSA dipindahkan pada medium TSA baru hingga diperoleh biakan murni. Biakan murni tiap isolat dibiakan dalam medium LB selama 24 jam, kemudian 1 ml biakan dipindahkan ke dalam tabung ependorf yang telah berisi 1 ml gliserol 40%. Selanjutnya sediaan disimpan pada suhu -20
C selama 30 menit (Kim et al. 1997). Setelah dingin, 0,1 ml suspensi disebar ke dalam cawan petri yang telah berisi medium triptic soy agar (TSA) (17 g pancreatic digest of casein, 15 g agar, 5 g NaCI, 3 g papaic digest of soybean meal, 2,5 g K2 HPO4, dan 2,5 g glukosa dalam 1 l akuades) (Kim et al. 1997).
0
Seleksi in vitro. Seluruh isolat bakteri yang telah diperoleh diseleksi
berdasarkan hasil uji potensi antagonismenya terhadap R. solani yang telah
disediakan. Pengujian dilakukan menggunakan supernatan biakan tiap isolat bakteri. Supernatan dibuat dengan cara: isolat yang diduga kelompok Pseudomonas berfluoresensi, Bacillus, atau aktinomiset dibiakan masing-masing dalam tabung Erlenmeyer 100 ml yang berisi 10 ml medium Luria broth (LB) (0,1 g casein, 0,05 g yeast exstract, dan 0,05 g NaCI dalam 10 ml akuades), medium C untuk digunakan pada tahap pengujian selanjutnya.
triptic soy broth (TSB), atau medium M2 (0,04 g glukosa, 0,04 g yeast ekstrak, dan 0,1 g malt ekstrak dalam 10 ml akuades). Inkubasi dilakukan di atas inkubator bergoyang (150 rpm) pada suhu ruang selama 4 hari. Kemudian biakan disentrifugasi (7840 g, suhu 40
Pengujian potensi antagonis (anticendawan) dari supernatan tiap isolat pada medium padat dilakukan dengan memindahkan 10 µl supernatan dari tiap isolat pada permukaan medium PDA dalam cawan petri. Sebelumnya potongan miselium biakan R. solani berukuran diameter 0,5 cm ditempatkan dipermukaan
medium PDA pada bagian tengah. Tiap pengujian diulang tiga kali. Sediaan
diinkubasikan pada suhu ruang selama 3-4 hari. Supernatan dari isolat bakteri yang menunjukkan potensi anticendawan diindikasikan oleh adanya zona hambatan yang terbentuk di sekitar tempat supernatan isolat bakteri tersebut.
C, selama 10 menit) dan diambil supernatannya untuk diuji potensi antagonismenya terhadap cendawan R. solani pada medium padat dan medium cair.
Metode pengujian yang hampir sama dilakukan pada medium cair. Ke dalam tabung Erlenmeyer 250 ml yang berisi 50 ml medium PDB (1 g dekstrosa, 50 ml air rebusan 10 g kentang), diinokulasi dengan satu potongan miselium cendawan uji berdiameter 0,5 cm. Kemudian tiap sediaan diberi perlakuan 1 ml supernatan isolat bakteri sedangkan untuk kontrol ditambahkan 1 ml medium PDB steril. Tiap perlakuan diulang lima kali. Sediaan diinkubasi dalam suhu ruang selama 10 hari. Potensi anticendawan diamati dengan mengukur bobot basah dan bobot kering miselium cendawan uji dihari terakhir inkubasi. Data yang diperoleh dianalisis dengan sidik ragam dan uji lanjut Dunnet pada taraf 5%.
Seleksi in vivo. Seluruh isolat bakteri yang menunjukkan potensi anticendawan pada hasil uji in vitro diuji secara in vivo pada tanaman padi varietas Mekongga yang agak rentan terhadap penyebab penyakit hawar pelepah padi. Biakan tiap isolat bakteri yang diuji disiapkan dengan cara membiakan isolat tersebut dalam tabung yang berisi 5 ml medium LB, diinkubasi di atas inkubator bergoyang dengan kecepatan 150 rpm selama 24 jam suhu ruang. Perlakuan isolat bakteri diberikan sebanyak dua kali, yaitu pada saat perendaman benih dan saat patogen diinokulasikan.
Perendaman benih dilakukan selama 24 jam dengan biakan isolat bakteri, fungisida heksakonazol 1 ml/l (kontrol positif), atau dengan air steril (kontrol negatif). Sementara itu disiapkan polibag plastik bening (30 x 60 cm) dengan seperempat bagiannya berisi tanah steril. Bagian polibag berisi tanah ditempatkan ke dalam pot plastik (diameter 15 cm, tinggi 15 cm), sedangkan tiga per empat bagiannya yang tidak berisi tanah difungsikan sebagai micro-chamber. Benih yang telah direndam kemudian ditanam (25 benih/pot), dengan ulangan 3 kali. Tanaman yang berumur 3 minggu (3-4 helai daun) dijarangkan, disisakan 10 tanaman/pot kemudian tiap tanaman diinokulasi dengan 1 potongan miselium biakan R. solani (diameter 0,5 cm) yang telah dibiakan dalam medium PDA (3 hari) ke bagian pangkal batang tanaman.
Perlakuan bakteri diberikan kembali dengan cara meneteskan sebanyak 0,1 ml biakan isolat bakteri ke tiap potongan miselium patogen yang baru saja diinokulasikan. Setelah itu bagian polibag yang tidak diisi tanah diselimutkan menutupi tanaman padi dengan beberapa tempat pada bagian ujungnya direkat dengan stapler agar terbentuk kondisi lembab. Kondisi lembab dipertahankan hingga tanaman pada kontrol mati karena diinfeksi R. solani. Penyiram dilakukan melalui bagian ujung polibag plastik yang tidak direkatkan.
Pengamatan dilakukan terhadap indeks penyakit, keparahan penyakit, kejadian penyakit, dan penekanan penyakit. Indeks penyakit, keparahan penyakit, dan kejadian penyakit dihitung berdasarkan rumus yang telah diuraikan sebelumnya, sedangkan penekanan penyakit dihitung menurut rumus:
Penekanan penyakit = x 100%
Keterangan: P = Penekanan penyakit (%)
a = Keparahan penyakit pada kontrol b = Keparahan penyakit pada perlakuan
Data yang diperoleh dianalisis dengan sidik ragam dan uji lanjut selang ganda Duncan pada taraf 5%.
a - b a
HASIL DAN PEMBAHASAN