BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Penyiapan Bahan
1. Hasil determinasi tanaman
Determinasi tanaman pada penelitian ini dilakukan untuk memastikan bahwa tanaman yang digunakan sebagai antiinflamasi adalah benar daun
Macaranga tanarius L., sehingga tidak menyebabkan adanya kesalahan dalam penyiapan penggunaan bahan. Bahan dalam penelitian ini berupa serbuk dari daun
Macaranga tanarius L., yang diperoleh dari lingkungan Paingan, Maguwoharjo, Sleman, Yogyakarta.
Determinasi dilakukan di Laboratorium Botani Farmasi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Determinasi dilakukan dengan membandingkan bagian dari tanaman seperti daun, batang, bunga, dan buah menggunakan herbarium Macaranga tanarius L. (Gilda, 2014). Selain itu untuk membuktikan kebenarannya juga dilakukan determinasi bagian tumbuhan menggunakan buku acuan (Steenis et al., 1992) hingga tingkat spesies.
Berdasarkan hasil determinasi dan telah sesuai dengan herbarium
Macaranga tanarius L., yang ada di Botani Farmasi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta, maka terbukti bahwa daun yang digunakan dalam penelitian ini adalah benar merupakan daun Macaranga tanarius L. (Lampiran 2). 2. Pembuatan serbuk daun Macaranga tanarius L.
Proses penyerbukan dilakukan oleh Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu Universitas Gadjah Mada (LPPT UGM) Yogyakarta. Sebelum dilakukan proses penyerbukan, penyiapan daun Macaranga tanarius L. dilakukan oleh peneliti dimulai dari pengambilan, penyortiran, pencucian hingga pengeringan daun Macaranga tanarius L.
Pengambilan daun Macaranga tanarius L. dilakukan pada pagi hari pukul 07.00-10.00 WIB. Menurut Santoso (2008), waktu panen sebaiknya dilakukan pada pagi hari pukul 07.00-10.00 atau sore hari. Waktu panen pada pagi hari merupakan waktu yang paling baik, yaitu saat embun mulai menghilang dan cahaya matahari belum terlalu terik. Jika panen dilakukan pada siang hari, faktor cuaca panas dan penguapan membuat hasil panen rusak. Jika keterbatasan waktu yang tidak dapat melakukan panen pada pagi hari, panen dapat dilakukan pada sore hari (Rahayu dan Soeleman, 2013).
Pencucian daun Macaranga tanarius L. dilakukan dengan menggunakan air mengalir, bertujuan agar daun yang diperoleh bebas kotoran dan debu. Selain itu, dilakukan penyortiran untuk memilih daun yang sesuai dengan kriteria dalam
penelitian yaitu berwarna hijau, tidak berlubang, tidak berpenyakit dan busuk. Proses pengeringan dilakukan ± 3 hari dengan cara ditutup kain hitam, hingga didapatkan daun yang layu untuk selanjutnya dilakukan proses penyerbukan.
Proses penyerbukan dilakukan sesuai prosedur yang tersedia di LPPT UGM. Daun Macaranga tanarius L. yang telah layu dipotong-potong untuk memudahkan proses penyerbukan, kemudian dilakukan proses pengeringan kembali dalam almari pengering pada suhu 45ºC selama 20 jam, hingga menghasilkan potongan daun yang benar-benar kering (dapat diremas). Pengeringan tersebut bertujuan untuk mengurangi kadar air, mencegah timbulnya jamur sehingga dapat disimpan lebih lama tanpa bahan pengawet dan tidak mudah rusak sehingga komposisi kimianya tidak mengalami perubahan. Setelah itu potongan daun tersebut diserbuk menggunakan mesin penyerbuk dengan diameter lubang saringan 1 mm, hasil penyerbukan ditimbang dan dikemas. Serbuk dengan penghalusan yang tinggi memungkinkan sel-sel yang rusak semakin besar, sehingga memudahkan pengambilan kandungan senyawa langsung oleh pelarut yang digunakan.
Serbuk yang digunakan untuk proses ekstraksi mekanik (maserasi), disaring lagi menggunakan pengayak dengan nomor mess 40, hal ini dikarenakan ukuran serbuk yang masih terlalu besar. Pengayakan dilakukan dengan tujuan agar didapatkan ukuran serbuk yang kecil dengan luas permukaan besar, sehingga interaksi zat cairan (pelarut) dengan serbuk akan semakin besar dan proses ekstraksi akan semakin efektif. Selain itu waktu yang diperlukan juga lebih singkat dan mempermudah proses penyarian karena semakin luas permukaan serbuk maka
perpindahan massa pada proses ekstraksi akan berlangsung cepat (Susiana dkk., 2012).
Daun kering Macaranga tanarius L. yang digunakan dalam penelitian ini sebayak 2,7 kg dan setelah dilakukan penyerbukan pada LPPT UGM didapatkan bobot serbuk daun Macaranga tanarius L. seberat 1200 gram serbuk halus yang akan digunakan untuk proses pembuatan fraksi etanol-heksan ekstrak metanol-air daun Macaranga tanarius L.
3. Penetapan kadar air serbuk daun Macaranga tanarius L.
Penetapan kadar air pada serbuk kering daun Macaranga tanarius L. dilakukan di Laboratorium Pengujian “LPPT-UGM” menggunakan metode gravimetri dengan prosedur yang telah tersedia. Tujuan dari penetapan kadar air dari serbuk kering daun Macaranga tanarius L. yaitu untuk mengetahui serbuk yang digunakan telah memenuhi persyaratan serbuk yang baik, yaitu kurang dari 10% (Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan, 1995).
Hasil perhitungan kadar air dari serbuk daun Macaranga tanarius L. sebesar 6,66%b/b (lampiran 3). Berdasarkan hasil pengujian tersebut menunjukkan bahwa kadar air serbuk daun Macaranga tanarius L., telah memenuhi persyaratan kadar air yang telah ditetapkan.
4. Fraksi etanol-heksan ekstrak metanol air daun Macaranga tanarius L. Metode fraksinasi daun Macaranga tanarius L., pada penelitian ini menggunakan pelarut metanol 70% dan air untuk proses ekstraksi hingga didapatkan ekstrak kental, yang selanjutnya di fraksinasi menggunakan dua pelaut dengan nilai polaritas yang berbeda yaitu heksan dan etanol 95%. Perbedaan
kepolaran ini diharapkan dapat selektif menyari komponen yang telah tersari pada hasil ekstrak kental metanol-air sehingga didapatkan senyawa yang terlarut sesuai dengan kepolaran senyawa yang terkandung di dalamnya.
a. Proses ekstraksi metanol-air daun Macaranga tanarius L.
Proses ekstraksi metanol-air dilakukan melalui proses maserasi yaitu penggojokan menggunakan shaker, dengan kecepatan penggojokan yang konstan (140 rpm). Tujuan maserasi ini adalah agar seluruh serbuk dapat kontak dengan pelarut dan senyawa yang dituju dapat terekstrak. Selain itu penggojokan menggunakan shaker membantu mempercepat ekstraksi sehingga waktu yang dibutuhkan lebih singkat dibandingkan dengan metode penyarian dengan cara merendam serbuk dengan sesekali penggojokan. Ekstraksi yang dilakukan dengan metode ini disebut ekstraksi mekanik. Pemilihan metode maserasi pada tahap ekstraksi disebabkan karena metode penyarian ini lebih sederhana, tidak menggunakan alat yang spesifik, pengerjaannya relatif mudah untuk dilakukan dan lebih efisien, selain itu metode maserasi dapat digunakan untuk jenis senyawa yang tahan terhadap panas maupun tidak tahan terhadap panas sehingga pada penelitian ini digunakan metode maserasi, karena kandungan senyawa daun Macaranga tanarius tidak diketahui merpakan jenis senyawa yang tahan terhadap panas atau tidak.
Seberat 40 gram serbuk kering daun Macaranga tanarius L., dimasukkan ke dalam erlenmeyer dan direndam dalam 200 mL pelarut metanol dan air (100 mL metanol dan 100 mL air), kemudian diaduk dengan kecepatan konstan menggunakan shaker, selama 72 jam (Puteri dan Kawabata, 2010). Semakin lama
waktu maserasi maka kesempatan untuk bersentuhan antara serbuk dengan pelarut akan semakin besar, sehingga proses ekstraksi akan lebih sempurna.
Penggunaan metanol 70% pada proses maserasi ekstrak metanol-air karena mayoritas senyawa antioksidan konstituen akan berhasil diekstrak dalam ekstraksi pertama dengan pelarut metanol (Lim et al., 2009). Selain itu, konsentrasi tinggi metanol dapat menghambat aktivitas dari oksidase, yang menghancurkan senyawa polifenol dalam daun, karena cedera atau kerusakan daun (Pinelo, Rubilar, Sineire,
and Nunez, 2004). Sedangkan air merupakan perlarut yang aman dan mampu manyari komponen senyawa glikosida dan tanin sesuai dengan kandungan yang telah dilaporkan pada penelitian terhadap daun Macaranga tanarius L.
Oleh karena itu pada penelitian ini dipilih menggunakan pelarut metanol-air. Pemilihan pelarut ini berdasarkan kesesuaian kepolaran antara senyawa aktif dengan larutan penyari yang digunakan, sehingga diharapkan dapat melarutkan komponen senyawa yang larut dan bercampur dengan cairan penyari.
Hasil maserat yang didapatkan dari gabungan proses maserasi dan remaserasi yang telah disaring, dipekatkan menggunakan vaccum rotary evaporator. Suhu yang digunakan pada proses evaporasi metanol-air ini adalah 650C yang merupkan titik didih metanol. Proses pemekatan dilakukan ± 3 jam, penghentian proses pemekatan ini dilihat pada tetesan pelarut yang telah berhenti menetes di bagian pembuangan labu alas bulat yang terpasang pada alat vaccum rotary evaporator, yang menunjukkan bahwa sebagian besar pelarut telah menguap dan hanya meninggalkan senyawa aktif yang dituju. Evaporasi dengan menggunakan bantuan pompa vakum akan menurunkan tekanan uap pelarut
sehingga pelarut akan menguap di bawah titik didih normalnya. Tekanan yang diberikan dari pompa vakum tersebut mengakibatkan pelarut menguap dari campuran kemudian akan terkondensasi masuk ke dalam labu penampung.
Setelah proses pemekatan masih tersisa filtrat yang cukup banyak, dengan kandungan pelarut air maka filtrat tersebut ditempatkan pada cawan porselin untuk selanjutnya dilakukan proses pemekatan dibantu dengan waterbath, tujuannya adalah menghilangkan pelarut air yang belum menguap saat proses evaporator. Hasil yang didapatkan berupa ekstrak kental yang kemudian disimpan dalam oven pada suhu ± 400C selama 24 jam untuk mendapatkan bobot tetap. Ekstrak kental yang berada dalam cawan ditimbang setiap waktu tertentu selama 24 jam atau hingga mendapatkan bobot konstan. Hasil yang diperoleh pada pembuatan ekstrak kental metanol-air daun Macaranga tanarius L., sebanyak 126,24 gram yang selanjutnya digunakan untuk fraksinasi dengan etanol-heksan.
b. Proses fraksi etanol-heksan daun Macaranga tanarius L.
Setelah didapatkan ekstrak kental dengan bobot tetap, maka proses selanjutnya adalah fraksinasi menggunakan pelarut heksan dan etanol. Penggunaan pelarut tersebut disesuaikan pada tingkat kelarutan senyawa aktif pada pelarut yang digunakan. Hal ini dikarenakan pemilihan cairan penyari yang tepat tergantung pada sifat fisika kimia zat aktif dalam simplisia dengan prinsip like dissolve like.
Pemilihan penggunaan etanol dikarenakan etanol merupakan pelarut pilihan untuk memperoleh ekstrak secara klasik seperti ekstrak kering, kental, dan cair. Perbandingan penggunaan pelarut etanol-heksan sebesar 1:1, karena dengan perbandingan tersebut dapat dicegah terjadinya ekstraksi klorofil atau zat yang
bersifat resin dan polimer yang pada umumnya bukan merupakan bagian penting untuk aktivitas ekstrak (Agoes, 2009). Oleh karena itu, pada proses fraksinasi ini digunakan pelarut etanol-heksan dari eksrak kental metanol-air daun Macaranga tanarius L. Penggunaan kedua campuran pelarut tersebut diharapkan dapat selektif menarik senyawa yang lebih spesifik berdasarkan kedekatan nilai log P yang menggambarkan nilai kepolaran antara senyawa yang dituju dengan pelarut yang digunakan.
Proses fraksinasi, menggunakan ekstrak kental yang telah didapatkan dari penyarian sebelumnya menggunakan metanol-air, kemudian dimaserasi menggunakan etanol-heksan dengan kecepatan konstran 140 rpm selama 24 jam dan dilakukan remaserasi. Hasil filtrat disaring menggunakan kertas saring dan
corong Buchner digabungkan untuk selanjutnya dipekatkan menggunakan vaccum rotary evaporator pada suhu campuran heksan dan etanol yaitu 58,70C ≈ 600
C (Agoes, 2009). Setelah tidak terdapat tetesan pada labu alas bulat yang terpasang pada evaporator maka filtrat yang berwarna coklat pekat tersebut ditempatkan pada cawan porselin untuk selanjutnya disimpan dalam oven pada suhu 40-500C untuk mendapatkan bobot fraksi yang tetap.
Penetapan bobot pada fraksi didapatkan dari pengeringan tetap dengan penyusutan sebesar 0% pada pemanasan 400C. Tujuannya penetapan bobot tersebut adalah untuk menentukan batasan seberapa banyak senyawa yang hilang selama proses pengeringan, karena dapat mempengaruhi bobot fraksi yang didapatkan. Bobot tersebut akan mempengaruhi konsentrasi dan dosis fraksi yang akan diberikan ke hewan uji untuk melihat aktivitas penghambatan inflamasi. Hasil dari
proses pengeringan didapatkan tidak ada perubahan pada bobot frakasi sehingga didapatkan bobot pengeringan tetap. Pengeringan fraksi untuk setiap cawannya, dilakukan dengan cara penimbangan pada masing-masing cawan untuk mendapatkan bobot fraksi yang tetap.
Pembuatan fraksi etanol-heksan ekstrak metanol-air daun Macaranga tanarius L. dalam bentuk kental dengan bobot tetap (penyusutan 0%) dibutuhkan 1200 gram serbuk kering, menghasilkan 126,24 gram ekstrak kental metanol-air hingga didapatkan fraksi kental sebanyak 30,5806 gram. Dari hasil penimbangan bobot fraksi etanol-heksan ekstrak metanol-air daun Macaranga tanarius L., didapatkan rendemen sebesar 2,55%. Rendemen didapatkan dari penimbangan bobot total fraksi kental yang diperoleh dibandingkan bobotnya dengan serbuk simplisia awal yang digunakan (dinyatakan dalam persen (%)). Rendemen merupakan presentase bagian bahan baku yang dapat digunakan atau dimanfaatkan dengan total bahan baku. Rendemen yang didapatkan sangatlah kecil sehingga untuk menghasilkan fraksi etanol-heksan memerlukan sampel yang banyak.
