QTL ANALYSIS OF AGRONOMIC TRAITS UNDER LOW LIGHT INTENSITY CONDITION
3. Konstruksi Peta Pautan Toleransi terhadap Intensitas Cahaya Rendah
kedelai pada kondisi intensitas cahaya rendah
Sumber keragaman db JK KT E(KT) F hitung
Ulangan r-1 JKU KTU KTU/KTE
Genotipe g-1 JKG KTG M1 KTG/KTE
Galat (r-1)( g-1) JKE KTE M2
Total rg-1
4. Analisis korelasi: dilakukan untuk mengetahui keeratan hubungan antar karakter dengan menghitung nilai koefisien korelasi Pearson. Masing-masing nilai koefisien korelasi diuji pada taraf nyata 0.01 (Gomez dan Gomez 1995). Nilai koefisien korelasi (r) dihitung dengan rumus:
rxy = covxy
σx σy
dimana,
covxy = peragam antara karakter x dengan karakter y
σx = simpangan baku karakter komponen hasil
σy = simpangan baku karakter hasil
3. Konstruksi Peta Pautan Toleransi terhadap Intensitas Cahaya Rendah
Konstruksi peta pautan bagi toleransi terhadap intensitas cahaya rendah dimulai dengan seleksi primer RAPD pada kedua tetua untuk memilih primer yang menghasilkan amplifikasi yang polimorfik dan terpaut dengan tetua toleran. Selanjutnya primer terpilih digunakan untuk menguji populasi RILs F6 dan data yang diperoleh digunakan untuk membuat peta pautan bagi toleransi terhadap intensitas cahaya rendah.
Bahan Tanaman
Bahan tanaman yang digunakan adalah tetua Ceneng dan Godek yang merupakan tetua toleran dan peka terhadap intensitas cahaya rendah. Bahan tanaman yang menjadi populasi pemetaan adalah 45 RILs F6.
Metode Isolasi DNA
Prosedur isolasi DNA yang digunakan adalah mengikuti metode CTAB yang dimodifikasi oleh Toruan-Mathius dan Hutabarat (1997). Berikut adalah
tahapan isolasi DNA yang dilakukan. DNA total diisolasi dari daun kedelai yang sudah berumur tiga minggu. Sebanyak 0.2 g daun muda digerus sampai menjadi tepung dengan menambahkan nitrogen cair. Daun kedelai yang sudah berbentuk tepung kemudian dipindahkan ke dalam tabung mikro yang telah berisi 1 ml buffer CTAB dan ditambahkan 2% β-mercaptoethanol dan divortek lalu dipanaskan pada suhu 65°C selama 30 menit.
Campuran tersebut dibiarkan mencapai suhu kamar kemudian ditambahkan 750 µl kloroform : isoamil alcohol (24:1) dan divortek kemudian disentrifugasi kembali pada kecepatan 11.000 rpm selama 10 menit. Larutan bagian atas dipipet ke dalam tabung lain, lalu ditambahkan 1 ml isopropanol dingin, dikocok perlahan-lahan sehingga tercampur merata dan disimpan selama 30 menit dalam freezer.
Setelah itu DNA diendapkan dengan cara disentrifugasi pada kecepatan 11.000 rpm selama 10 menit. Cairan bagian atas dibuang dan pellet DNA dikeringkan dengan cara membalikkan tabung. Pelet DNA yang telah kering dilarutkan dalam 200 µl buffer TE, ditambahkan 10 µl RNAse (10 mg/ml) dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 1 jam. Setelah diinkubasi, maka ditambahkan natrium asetat 3 M, pH 5.2 sebanyak 1/10 volume (20 µl) dan alkohol absolut 2.5 volume (500 µl) dan dikocok sehingga homogen lalu disimpan di freezer selama 30 menit. Selanjutnya disentrifugasi pada kecepatan 14.000 rpm selama 10 menit. Cairan dibuang, pellet DNA dicuci dengan alkohol 70% dan dikering anginkan. Pellet tersebut dilarutkan dalam 100 µl buffer TE, lalu diambil sebanyak 2 µl untuk pengujian kualitas dan kuantitas DNA dengan menggunakan elektroforesis pada gel agarose, sedangkan sisanya disimpan pada suhu 20°C.
Pengujian kuantitas DNA
Sebanyak 2 µl larutan stok DNA ditambah dengan 8 µl H2O dan 2 µl
loading buffer. Sebagai standar dipipet sebanyak 1 µl λ DNA (536 ng/µl) ditambah dengan 4 µl H2O dan loading buffer 1 µl.
Gel agarose dengan konsentrasi 1% dibuat dengan cara menimbang sebanyak 0.40 g agarose yang ditambah dengan 40 ml larutan TAE 1x kemudian dipanaskan dalam microwave sampai larut sempurna. Larutan dibiarkan
mencapai suhu sekitar 50°C, selanjutnya dituangkan ke dalam cetakan gel yang telah dipasangi “comb” untuk membuat sumur, dan dibiarkan memadat selama sekitar 1 jam. Kemudian “comb” dilepaskan dari gel yang telah padat. Selanjutnya gel diletakan pada peralatan elektroforesis, dan diisi dengan buffer TAE 1x sampai gel terendam.
DNA yang telah disiapkan dan λ DNA dimasukan ke dalam sumur pada gel. Alat elektroforesis disambungkan ke power supply yang telah diset pada 50 volt selama ± I jam. Gel lalu dilepas dari alat elektroforesis dan direndam dalam larutan etidium bromida 0.5 ppm selama 30 menit dan dicuci dengan air mengalir selama 10 menit. Terakhir, gel diletakkan di atas UV transluminator untuk mengamati fragmen DNA yang diperoleh dan difoto.
Pengujian kualitas DNA
Sebanyak 2 µl larutan stok DNA ditambah dengan 2 µ buffer 10x, 0.5 µl enzim restriksi Eco R1(12 u/µl) dan 15.5 µl H2O. Semua campuran tersebut
diinkubasi pada suhu 37°C selama 2 jam. Untuk menghentikan reaksi maka ditambahkan 1 µl EDTA 0.5 M pH 8. Sebelum dielektroforesis terlebih dahulu ditambahkan 4 µl loading buffer.
Gel agarose dengan konsentrasi 1% dibuat dengan cara menimbang sebanyak 0.4 g agarose yang ditambah dengan 40 ml larutan TAE 1x kemudian dipanaskan dalam microwave sampai larut sempurna. Larutan dibiarkan mencapai suhu sekitar 50°C, selanjutnya dituangkan ke dalam cetakan gel yang telah dipasangi “comb” untuk membuat sumur, dan dibiarkan memadat selama sekitar 1 jam. Kemudian “comb” dilepaskan dari gel yang telah padat. Selanjutnya gel diletakkan pada peralatan elektroforesis, dan diisi dengna buffer TAE 1x sampai gel terendam.
DNA yang telah disiapkan dan λ DNA dimasukan ke dalam sumur pada gel. Alat elektroforesis disambungkan ke power supply yang telah diset pada 50 volt selama ± 1 jam. Gel lalu dilepas dari alat elektroforesis dan direndam dalam larutan ethidium bromida 0.5 ppm selama 30 menit dan dicuci dengan air mengalir selama 10 menit. Terakhir, gel diletakkan di atas UV transluminator untuk mengamati fragmen DNA yang diperoleh dan diphoto.
Amplifikasi DNA
DNA diamplifikasi menggunakan primer acak sebagai marka molekular. Reaksi amplifikasi dilakukan dengan menggunakan 10 pmol primer (10 pmol/µl), 2 µl DNA cetakan, dan 18 µl dH2O sampai volume akhir. Setiap beads telah
mengandung AmpliTagTM DNA polimerase, Stoffel fragmen, dNTP (masing- masing dATP, dCTP, dGTP, dan dTTP 0.4 mM dalam 25 µl), 2.5 µg bovine serum albumin (BSA) dan buffer (3 mM MgCl2, 30 mM KCL, dan 10 mM Tris, pH 8.3 dalam 25 µl volume reaksi).
Selanjutnya semua dimasukan ke dalam tabung volume 500 µl, dikocok secara perlahan agar larutan tercampur sempurna. Minyak mineral ditambahkan ke atas campuran PCR sebanyak 20 µl mineral oil untuk menghindari penguapan selama berlangsungnya reaksi.
Program untuk PCR awal pada suhu 95°C selama 4 menit satu siklus. Denaturasi DNA terjadi pada suhu 95°C selama 1 menit. Penempelan primer ke DNA cetakan pada suhu sesuai dengan susunan basa pada primer kira-kira 36°C selama 1 menit pada pemanjangan pada 72°C selama 2 menit sebanyak 45 siklus, PCR akhir pada suhu 72°C selama 7 menit sebanyak satu siklus, kemudian diambil untuk elektroforesis.
Elektroforesis dan visualisasi DNA
Ke dalam tabung yang berisi produk amplifikasi ditambahkan 5 µl loading buffer, sedangkan ke dalam tabung yang 5 µl marker DNA ditambahkan 1 µl loading buffer. Gel agarose dengan konsentrasi 2% dibuat dengan cara menimbang sebanyak 0.8 g agarose yang ditambah dengan 40 ml larutan TAE 1x kemudian dipanaskan dalam microwave sampai larut sempurna. Larutan dibiarkan mencapai suhu sekitar 50°C, selanjutnya dituangkan ke dalam cetakan gel yang telah dipasangi “comb” untuk membuat sumur, dan dibiarkan memadat selama sekitar 1 jam. Kemudian “comb” dilepaskan dari gel yang telah padat. Selanjutnya gel diletakan pada peralatan elektroforesis, dan diisi dengan buffer TAE 1x sampai gel terendam.
Produk amplifikasi PCR dan marker dimasukan ke dalam sumur pada gel. Alat elektroforesis disambungkan ke power supply yang telah diset pada 50 volt
selama ± I jam. Gel lalu dilepas dari alat elektroforesis dan direndam dalam larutan etidium bromida 0.5 ppm selama 30 menit dan dicuci dengan air mengalir selama 10 menit. Terakhir, gel diletakkan di atas UV transluminator untuk mengamati fragmen DNA yang diperoleh dan diphoto.
Analisa Data
Posisi pita hasil amplifikasi akan menunjukkan panjang pita tertentu sesuai dengan posisinya terhadap marker pembanding. Setiap pita amplifikasi merupakan satu lokus dengan ukuran pita tertentu. Kriteria penskoran adalah berdasarkan muncul atau tidaknya pita. Lokus yang dipilih untuk pemetaan adalah lokus yang hanya menghasilkan amplifikasi pada tetua Ceneng. Ketentuan yang digunakan untuk memberikan skor pada setiap pita adalah :
1. Diberikan skor A jika muncul pita pada tetua Ceneng 2. Diberikan skor A jika tidak muncul pita pada tetua Ceneng 3. Diberi skor B jika muncul pita pada tetua Godek
4. Diberi skor B jika tidak muncul pita pada tetua Godek
Data yang diperoleh dari hasil penskoran hasil amplifikasi digunakan untuk mengkonstruksi peta pautan dengan menggunakan perangkat lunak MAPMAKER/EXP 3.0 (Lander et al. 1987; Lincoln et al. 1992). Keterpautan antar lokus ditetapkan pada LOD (logg of the odd) 3.0 dengan fraksi rekombinan sebesar 25%. Unit jarak peta diduga dengan menggunakan fungsi Haldane (Haldane 1919 dalam Liu 1998).
Dalam analisis QTL diperlukan data kuantitatif dan data molekuler. Dalam penelitian ini data kuantitatif yang digunakan adalah data fenotipe RILs F6 yang diperoleh pada tahap percobaan 2, sedangkan data molekuler adalah data genotipe yang diperoleh pada percobaan tahap 3. Analisis data untuk mengidentifikasi adanya QTL dilakukan dengan metode simple interval mapping (SIM) dengan bantuan perangkat lunak PLABQTL (Utz dan Melchinger 2003).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pemetaan QTL merupakan metode terkini dalam kegiatan pemuliaan tanaman secara konvensional dengan memanfaatkan marka molekuler yang terpaut dengan QTL sebagai alat bantu dalam kegiatan seleksi. Beberapa hal yang harus diperhatikan dalam pemetaan QTL adalah ketersediaan populasi pemetaan dan jenis marka yang sesuai.
Tahapan penelitian untuk mengidentifikasi QTL yang mengendalikan karakter agronomi yang terdiri dari karakter hasil dan komponen hasil pada kondisi intensitas cahaya rendah adalah pembentukan populasi pemetaan yaitu untuk mendapatkan RILs F6, analisis fenotipe untuk mengetahui keragaan fenotipe RILs F6 pada kondisi intensitas cahaya rendah dan konstruksi peta pautan tetua toleran intensitas cahaya rendah berdasarkan marka RAPD. Konstruksi peta pautan dilaksanakan dalam dua tahap yaitu seleksi primer untuk mendapatkan primer polimorfik dan terpaut dengan tetua toleran dan analisis genotipe yaitu analisis RILs F6 dengan menggunakan primer yang polimorfik dan terpaut dengan tetua toleran untuk mendapatkan peta pautan toleransi berdasarkan marka RAPD. Data yang diperoleh dari hasil analisis fenotipe dan analisis genotipe digunakan untuk mengidentifikasi QTL yang mengendalikan karakter agronomi kedelai pada kondisi intensitas cahaya rendah.