2.1 Saluran Pencernaan dan Makanan Ikan Mas
3.1.2 Materi a. Hewan uji
Hewan uji yang digunakan berupa ikan mas dengan ukuran berat 15-20 g per ekor. Jumlah ikan yang digunakan sebanyak 108 ekor. Masing-masing ditempatkan pada aquaria berukuran 50x40x40 cm dan setiap akuarium berisi sebanyak 4 ekor per unit percobaan. Satu unit percobaan mewakili satu ulangan. b. Sumber inokulum
Saluran pencernaan ikan mas yang telah diberi perlakuan selama 8 hari, merupakan sumber inokulum mikroflora. Saluran pencernaan yang telah dihaluskan, diencerkan menggunakan NaCl fisiologis 0,85% kemudian dikultur pada media MRSA (DeMan Rogosa Sharp Agar) dikerjakan secara in vitro.
14 MRSA merupakan media sensitif yang digunakan untuk menguji keberadaan bakteri gram positif, khususnya bakteri asam laktat.
c. Pakan uji
Pakan uji yang digunakan dalam penelitian ini merupakan pakan iso-energi dan iso-protein yang disusun dengan komposisi nutrien yang telah disesuaikan dengan kebutuhan hewan uji, dengan kandungan protein sebesar 26%. Pakan perlakuan terdiri dari pakan kontrol (tanpa antibiotik) dan pakan yang dicampur dengan 3 jenis antibiotik berbeda; streptomisin (S), tetrasiklin (T), dan amphisilin (A) dengan dosis berbeda; 100, 150 dan 200 ppm. Pakan basal tanpa antibiotik merupakan pakan kontrol, yang digunakan sebagai pembanding pada pakan dengan penambahan antibiotik. Komposisi pakan dapat diamati pada Tabel 1.
Tabel 1 Komposisi pakan untuk melihat efektivitas jenis dan dosis antibiotik terhadap penurunan populasi mikroflora saluran pencernaan setiap perlakuan (% BK)
Bahan Pakan K S100 S150 S200 T100 T150 T200 A100 A150 A200
T. ikan 15,80 15,80 15,80 15,80 15,80 15,80 15,80 15,80 15,80 15,80 T. udang 14,55 14,55 14,55 14,55 14,55 14,55 14,55 14,55 14,55 14,55 T. kedelai 17,49 17,49 17,49 17,49 17,49 17,49 17,49 17,49 17,49 17,49 T. jagung giling 22,44 22,44 22,44 22,44 22,44 22,44 22,44 22,44 22,44 22,44 Dedak 16,74 16,74 16,74 16,74 16,74 16,74 16,74 16,74 16,74 16,74 Terigu 9,98 9,98 9,98 9,98 9,98 9,98 9,98 9,98 9,98 9,98 Minyak Kedelai 3,00 3,00 3,00 3,00 3,00 3,00 3,00 3,00 3,00 3,00 Streptomisin (ppm) 0,00 100 150 200 0 0 0 0 0 0 Tetrasiklin (ppm) 0 0 0 0 100 150 200 0 0 0 Amphisilin (ppm) 0 0 0 0 0 0 0 100 150 200 Keterangan: K: Kontrol, S100, S150, S200 (Streptomisin dosis 100, 150, 200 ppm), T100, T150,
T200 (Tetrasiklin dosis 100, 150, 200 ppm) dan A100, A150, A200 (Ampisilin dosis 100, 150, 200 ppm)
Pellet yang telah dibuat diukur gross energinya dan analisis kimia proksimat (AOAC 1993). Hasil komposisi kimiawi pellet pada Tabel 1 terdiri dari kadar air (6,6%), abu(8,7%), lemak kasar (8,6%), protein kasar (26,0%), serat kasar (3,8%), BETN (52,8%) dengan gross energi pellet (3465,3 Kal/kg).
3.1.3 Prosedur kerja
Hewan uji dipelihara di dalam aquarium dan bagian sisi wadah ditutup dengan terpal berwarna gelap, untuk meminimalisir stress pada ikan yang
15 diakibatkan oleh lingkungan. Untuk menghindari ikan tidak melompat, dibagian atas aquarium ditutup dengan menggunakan kassa nyamuk, yang sisin-sisinya dijepit. Sebelum digunakan, wadah dan semua peralatannya didisinfektan terlebih dahulu menggunakan kaporit (CaCO3
Perlakuan pemberian pakan dimulai pada hari pertama setelah pemuasaan 24 jam pasca aklimasi hingga hari ke-8. Pakan uji diberikan dua kali sehari secara
ad libitum pada pagi hari pukul 8.00 WIB dan sore hari pukul 14.00 WIB. Setelah 8 hari diberi pakan uji, ikan uji diamati populasi total mikroflora pada saluran cerna dengan cara pengambilan saluran pencernaan ikan mas sebagai sumber inokulum. Pengambilan sampel dilakukan dengan pemingsanan hewan uji dengan zat anastesi minyak cengeh 1 ppm. Pembedahan dilakukan dengan menggunakan gunting yang telah disterilkan dengan alkohol 70% dan dikerjakan dekat api bunsen untuk mencegah kontaminasi. Organ pencernaan (usus) dikeluarkan dari ikan mas yang telah dimatikan. Organ pencernaan di ukur panjangnya dan ditimbang 1,2 g. Organ pencernaan digerus, setelah dihaluskan 1 g diencerkan dengan 9 ml cairan fisiologis (NaCl 0.85%) steril. Prosedur isolasi mikroba mengacu pada metode yang dilakukan pada hewan terrestrial seperti petunjuk Hungate (1966), serta mengkombinasikannya dengan prosedur isolasi mikroba dari saluran pencernaan ikan seperti metode yang dilakukan oleh Nakayama et al.
(1994) dan Tae (2003). Kultur mikroba dilakukan dalam suasana aerob. Pengenceran berseri di lakukan dari 10
). Aquarium diisi air sebanyak 40-45 L dan direndam dengan kaporit 24 jam, kemudian dibilas dengan rendaman air bersih sebanyak 3 kali dan didiamkan selama 24 jam. Ikan mas dengan bobot rata-rata 15-20g ditebar dengan kepadatan 4 ekor per aquarium (1 unit percobaan). Sebelum di tebar, ikan diaklimasi terlebih dahulu selama 1 minggu dan diberi pakan pellet, hal ini bertujuan untuk mengadaptasi ikan dengan lingkungan pemeliharaan. Setelah masa aklimasi selesai ikan uji dipuasakan selama 24 jam dengan tujuan menghilangkan sisa pakan dalam tubuh.
-1
sampai 10-7, dengan cara mengambil 0,5 ml dari kultur mikroba pada media cair dan dimasukkan ke dalam 4,50 ml media pengencer pertama (cairan fisiologis NaCl 0,85%), selanjutnya dari media pengencer pertama diambil 0,5 ml dan dimasukkan ke dalam 4,50 ml media pengencer kedua dan seterusnya hingga media pengencer terakhir. Homogenisasi
16 (dengan vortex) selalu dilakukan sebelum rangkaian kegiatan pengenceran dilakukan. Hasil pengenceran 10-4 – 10-7 ditransfer sebanyak 0,1 ml ke dalam media kultur padat MRSA. Media MRSA ditujukan untuk melihat perlakuan terhadap respon populasi bakteri asam laktat pada saluran pencernaan. Kultur dalam media agar (in vitro) menggunakan metode agar tuang ke dalam cawan petri sebanyak 10 ml. Hasil kultur diinkubasi pada suhu 290
Keterangan:
C selama 48 jam. Parameter yang diukur merupakan populasi total mikroflora berdasarkan jumlah koloni mikroba yang dihasilkan, data disajikan dalam bentuk Log (cfu/ml) dengan menggunakan rumus (Bergeys, 2002) sebagai berikut:
PM = Populasi mikroba (cfu/ ml) K = Jumlah Koloni
A = Volume inokulasi dalam media pengencer (ml)
B = Pada pengenceran keberapa koloni mikrobanya dihitung C = Volume inokulasi dari media pengencer ke media padat (ml)
Pengamatan perlakuan terhadap respon persen kematian dilakukan untuk melihat efektivitas antibiotik terhadap penurunan populasi total mikroflora, dengan rumus sebagai berikut:
Persen kematian mikroflora
Jenis dan dosis antibiotik yang paling efektif menurunkan populasi mikroflora ditetapkan sebagai kontrol negatif pada percobaan kedua.
3.1.4 Analisis Data
Desain percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Rancangan Acak Lengkap Faktorial (RAL) 3x3 dengan 3 ulangan. Faktor A adalah 3 jenis antibiotik yang terdiri dari A1 = streptomisin, A2 = tetrasklin dan A3 = amphisilin. Faktor B adalah 3 level dosis yang terdiri dari B1 = 100 ppm, B2 = 150 ppm dan B3 = 200 ppm. Perlakuan kontrol digunakan sebagai pembanding pada pakan dengan antibiotik. Adapun model matematika rancangan tersebut adalah, sebagai berikut:
17 Yijk= µ + αi +βj + (αβ)ij+ ε
Y
ijk
ijk adalah nilai pengamatan pada faktor A (jenis antibiotik) taraf ke i, faktor B (dosis) taraf ke-j dan kelompok ke k. (µ, αi, βj) adalah komponen aditif dari rataan, pengaruh utama jenis antibiotik dan dosis. (αβ)ij merupakan komponen interaksi dari jenis antibiotik dan dosis. (εijk) adalah pengaruh acak yang menyebar normal (0,σε2
Data yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan sidik ragam (ANOVA) menggunakan SPSS 13.0 apabila terdapat perbedaan pada perlakuan akan dilakukan uji lanjut dengan Duncan test.
).
3.2 Evaluasi kontribusi mikroflora saluran pencernaan ikan mas terhadap
