Tusuk gigi
METODE PENELITIAN Penyiapan Asap Cair
Asap cair dibuat dengan menggunakan pirolisator. Pirolisis dibuat dengan suhu pemanasan 0-400 oC selama 5 jam. Crude asap cair berwarna cokelat kehitaman yang diperoleh selanjutnya didestilasi 1x dengan suhu 150-200 oC sehingga diperoleh asap cair berwarna kuning kocokelatan yang siap digunakan sebagai bahan penelitian.
Isolasi dan Uji Konfirmasi Genetik Blood Disease Bacterium (BDB)
BDB diisolasi dari tangkai buah dari bagian tandan buah pisang yang memperlihatkan gejala penyakit darah.
Koloni BDB hasil isolasi yang tumbuh di media TZC selanjutnya diekstraksi DNA genomnya dengan menggunakan Presto TM Mini gDNA Bacteria Kit (Genetika Science).
Fragmen spesifik DNA genom BDB
kemudian diamplifikasi dengan teknik polymerase chain reaction dengan primer spesifik, yaitu 121F (5‘-CGT ATTGGA TGC Scientific) sesuai dengan anjuran perusahaan. Sebanyak 1 µl DNA template BDB ditambahkan pada Mix PCR tersebut di atas. Amplifikasi fragmen spesifik DNA genom BDB dilakukan dengan menggunakan mesin PCR (Gene Amp PCR System 9700). Program PCR yang tahap terakhir adalah final extension pada suhu 72 oC selama 10 menit, kemudian suhu dipertahankan pada 11 oC. Produk PCR di eletroforesis dengan larutan agarose 2%, pada suhu 100 volt selama 30 menit, selanjutnya produk DNA divisualisasi di bawah lampu transillumintor UV (Hadiwiyono 2011).
Uji Daya Hambat Asap Cair terhadap BDB pada Media padat TZC
Pengujian ini dilakukan dengan menggunakan metode difusi agar mengacu pada prosedur Madigan et al. (1997).
Pengamatan dilakukan terhadap diameter zona hambat.
Uji Daya Hambat Asap Cair terhadap BDB pada Media Luria Bertani Cair
Pengujian ini dilakukan dengan metode pengukuran kerapatan bakteri dengan spektrofotometri pada panjang gelombang 600 nm, mengacu pada prosedur Madigan et al.(1997).
Pengamatan terhadap Morfologi Sel BDB
Setelah kontak dengan asap cair SWT 2.0%, morfologi sel BDB diamati dengan teknik Scanning Electron Mycroscopyc (SEM) mengikuti prosedur (Jeol 1995). Pengamatan SEM dilakukan di LIPI Cibinong Bogor.
Pengujian Asap Cair dalam Menekan Kejadian Penyakit Darah
118 Pengujian ini mengikuti prosedur (Kloepper & Tuzun 1996). Bibit pisang kepok kuning diberi asap cair TKP, PNS dan SWT dengan konsentrasi 0.0%
(kontrol), 0.5%, 1.0%, dan 2.0% (v/v).
Asap cair disiramkan ke dalam media tanah sebanyak 100 mL/polibag. Setelah 2x24 jam perlakuan asap cair, bibit diinokulasi dengan suspensi BDB dengan kerapatan sel 108 sel/mL (OD=0.1) sebanyak 2 mL dengan cara disuntikkan pada bonggol. Peubah yang diamati adalah persentase kejadian penyakit.
Analisis Data Hasil Penelitian
Semua data hasil penelitian dianalisis secara statistik dengan Analysis of Variance (ANOVA) dan perlakuan yang berpengaruh nyata dilakukan uji Duncan’s Multiple Range Test (DMRT) pada taraf 5%.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi dan Uji Konfirmasi Genetik Blood Disease Bacterium (BDB)
Koloni BDB pada media TZC dan fragmen spesifik BDB berhasil diperoleh (Gambar 1A dan 1B). Ciri-ciri koloni BDB hasil isolasi yang tumbuh di media TZC sesuai dengan pendapat Supriadi (2003) yaitu berbentuk bulat, diameternya 0.5-2.0 mm, berwarna merah di tengah dan putih di bagian pinggirnya. Ciri lainnya adalah koloninya cenderung lengket pada permukaan medium sehingga agak sulit kalau diambil dengan jarum ose (Gambar 1A), sedangkan fragmen spesifik Blood Disease Bacterium yang diperoleh memiliki ukuran sesuai dengan laporan Hadiwiyono (2011), yaitu 317 bp (Gambar 1B).
Gambar 1 (A) morfologi koloni tunggal Blood Disease Bacterium pada media TZC (B) fragmen spesifik genom Blood Disease Bacterium
Daya Hambat Asap Cair terhadap BDB pada Media TZCdan Media LB
Hasil uji menunjukkan bahwa asap cair TKP, PNS, dan SWT memiliki aktivitas penghambatan terhadap BDB, ditunjukkan
dengan terbentuknya zona hambat/zona bening pada media TZC (Gambar 2), dan terjadinya penurunan kerapatan sel (Optical Density) BDB (Tabel 1).
Gambar 2 Zona hambat BDB yang dibentuk oleh perlakuan asap cair dari: (A) buah pinus, (B) tempurung kelapa, dan (C) pelepah kelapa sawit. Konsentrasi asap cair ditunjukkan oleh: 1 (0.0%), 2 (0.5%), 3 (1.0%), 4 (2.0%), dan 5 (Agrept 20 WP)
Prosiding Plant Protection Day II (2): 116-122 Potensi Asap Cari Dari …
119 Semakin tinggi konsentrasi asap cair TKP, PNS dan SWT yang digunakan cenderung meningkatkan diameter zona hambat dan persentase penurunan nilai OD. Dari Tabel 1 juga terlihat bahwa Agrept 20 WP memiliki daya hambat lebih baik daripada asap cair TKP, PNS, dan SWT pada konsentrasi 0.5%, hal ini disebabkan karena Agrept 20 WP merupakan bakterisida yang bekerja mengganggu biosintesis protein sehingga metabolisme bakteri terganggu (Wainwright 1991).
Mulai pada konsentrasi 1.0% daya hambat asap cair SWT, TKP, dan PNS lebih tinggi daripada Agrept 20 WP, dan pada konsentrasi 2.0% ketiganya memberikan daya hambat paling tinggi.
Senyawa aktif dalam asap cair yang diduga berperan dalam menghambat pertumbuhan BDB pada media TZC dan media LB cair adalah senyawa fenol, alkohol dan asam asetat (Girrard 1992).
Menurut Davidson et al. (2005), asam asetat memiliki daya hambat lebih tinggi terhadap pertumbuhan bakteri daripada
senyawa fenol dan alkohol, namun apabila ketiga senyawa tersebut digabungkan akan menghasilkan kemampuan penghambatan yang lebih besar daripada masing-masing senyawa. Menurut Luc (2007), senyawa asam, fenol dan alkohol, dapat merusak protein dan lipid pembentuk dinding sel dan membran sel bakteri, sehingga fungsi dinding sel dan membran sel menjadi tidak stabil dan ketidakstabilan dinding sel dan membran sitoplasma ini dapat mempercepat terjadinya kebocoran sel.
Hasil pengamatan morfologi sel BDB dengan teknik SEM
Hasil pengamatan dengan teknik SEM menunjukkan bahwa asap cair dapat merusak dinding sel dan membran sel BDB (Gambar 3). Dibandingkan kontrol (Gambar 3 A) permukaan dinding sel bakteri rusak (permukaan sel terlihat kasar, tidak rata, bagian pinggir dinding selnya menjadi bergerigi dan berlubang), tampak sel bocor dan cairan sitoplasma merembes keluar (Gambar 3B).
Gambar 3 Kondisi morfologi sel BDB pada (A) kontrol (tanpa asap cair) (pembesaran 7500x) (B) perlakuan asap cair SWT 2.0% (pembesaran 10.000x)
Eugenol dapat menginaktivasi enzim transpeptidase sehingga dapat menyebabkan kekuatan dinding sel bakteri menjadi lemah, dan akibatnya sel bakteri mudah lisis/bocor (Oyedemi et al. 2008).
Senyawa aktif dalam asap cair yang diduga berperan dalam merusak dinding sel dan membran sel bakteri adalah asam asetat, fenol dan alkohol. Senyawa aktif lainnya dalam asap cair yang diduga memiliki aktivitas yang sama adalah vanillin dan syringaldehyde. Vanillin dan syringaldehyde memiliki struktur dasar fenol (-OH), dan metoksi (-OCH3) yang
sama dengan eugenol, sehingga diduga keduanya memiliki aktivitas yang sama dengan eugenol.
Pengaruh Asap Cair dalam Menekan Kejadian Penyakit Darah
Hasil penelitian menunjukkan bahwa asap cair TKP, PNS, dan SWT dapat menekan kejadian penyakit darah sampai 100% (Tabel 2). Senyawa aktif dalam asap cair TKP, PNS,dan SWT yang diduga berkontribusi dalam menekan kejadian penyakit darah adalah fenol, alkohol dan asam asetat.
120
Tabel 1. Pengaruh jenis dan konsentrasi asap cair terhadap diameter zona hambat dan persentase penurunan nilai OD
Jenis asap cair Konsentrasi (%)
Diameter zona hambat (mm)
Persentase penurunan OD (%)
Tempurung kelapa 0.5 8.50 b 27.20 c
1.0 21.83 d 74.10 f
2.0 23.20 e 97.60 g
Buah pinus 0.5 8.33 b 20.20 b
1.0 20.77 cd 74.00 f
2.0 22.27 de 97.50 g
Pelepah kelapa sawit 0.5 8.83 b 28.90 d
1.0 25.20 f 74.30 f
2.0 30.43 g 97.70 g
Kontrol (inokulasi BDB saja) 0.00 a 0.00 a
Agrept 20 WP 20.00 c 72.50 e
Keterangan: Angka-angka pada kolom yang sama yang diikuti oleh huruf yang sama tidak berbeda nyata pada taraf uji 5% (uji DMRT)
Tabel 2. Pengaruh jenis dan konsentrasi asap cair terhadap persentase kejadian penyakit darah dan penekanan kejadian penyakit darah
Jenis asap cair Konsentrasi (%)
Kejadian penyakit (%) Penekanan kejadian penyakit (%)
Tempurung kelapa 0.5 0 100 a
1.0 0 100 a
2.0 0 100 a
Buah pinus 0.5 0 100 a
1.0 0 100 a
2.0 0 100 a
Pelepah kelapa sawit 0.5 0 100 a
1.0 0 100 a
2.0 0 100 a
Kontrol (inokulasi BDB saja) 100 0 b
Keterangan: Angka-angka pada kolom yang sama yang diikuti oleh huruf yang sama tidak berbeda nyata pada taraf uji 5% (uji DMRT)
Senyawa lainnya yang diduga memiliki aktivitas yang sama adalah karrikin. Karrikin diturunkan dari hasil pirolisis komponen selulosa, dan dimasukkan ke dalam zat pengatur tumbuh dari kelas butenolide (Chiwocha et al. 2009). Sinyal karrikin dapat mengaktifkan reseptor KAI2 (Karrikin Insensitive 2) pada tanaman. KAI2 adalah protein α/β-hydrolase yang memiliki aktivitas mengkatalisis hidrolisis atom karbonil dari cincin butenolide karrikin, sehingga cincin butenolide karrikin menjadi terbuka, dan pembukaan cincin butenolide ini akan mempercepat proses transduksi sinyal karrikin dalam tanaman (Guo et al. 2013).
Sinyal Acyl Homoserine Lactone (AHLs) merupakan sinyal quorum sensing bakteri gram negatif untuk mengatur
fungsi biologis yang berbeda termasuk ekspresi gen yang terlibat dalam virulensi dan patogenisitas bakteri (Miller & Bassier 2001). Molekul AHLs bakteri memiliki struktur dasar lactone yang sama dengan karrikin, sehingga diduga setelah protein α/β-hydrolase ini aktif, protein ini akan mendegradasi AHLs bakteri yang berkembang dalam tanaman, akibatnya quorum sensing bakteri menjadi terhambat, dan infeksi bakteri dapat ditekan.
Senyawa-senyawa aktif lainnya yang terdeteksi dalam asap cair SWT, TKP dan PNS yang juga diduga berperan dalam menghambat biofilm bakteri dan menghambat sistem quorum sensing bakteri adalah: vanillin, eugenol, curcumin dan furanone/2(5H)-furanone. Senyawa vanillin, eugenol, curcumin dan furanone/2(5H)-furanone berinteraksi
dengan mengikat situs spesifik pada protein reseptor LuxR, dan pengikatan senyawa vanillin terhadap protein ini dapat
Prosiding Plant Protection Day II (2): 116-122 Potensi Asap Cari Dari …
121 mempercepat degradasi protein LuxR atau menginduksi ketidakstabilan protein LuxR akibatnya fungsional protein LuxR untuk mengenali dan mengikat AHLs bakteri menjadi terganggu, gangguan ini dapat menyebabkan quorum sensing menjadi terhambat (Kappachery et al. 2010; Zhou et al. 2013; Menefield et al. 2002;
Rudrappa & Bais 2008).
DAFTAR PUSTAKA
Almunady T, Panagan, Syarif N. 2009. Uji daya hambat asapcair hasil pirolisis kayu pelawan(Tristania abavata) terhadap bakteri Echerichia coli.
Jurnal Penelitian Sains 9: 30-32 Almunady T, Panagan, Syarif N. 2009. Uji
daya hambat asapcair hasil pirolisis kayu pelawan(Tristania abavata) terhadap bakteri Echerichia coli.
Jurnal Penelitian Sains 9: 30-32 Chiwocha SDS, Dixon WK, Flematti RG,
Ghisalberti LE, Merritt JD, Nelson CD, Riseborough MJ, Smith MS, Stevens CJ. 2009. Karrikins: a new family of plant growth regulators in smoke. Plant Sci. 177: 252–256 Davidson PM, Sofos JN, Branen AL. 2005.
Antimicrobials in Food.Thirdb Edition.
Taylor and Francis Group, CRC Press, Boca Raton
[Ditlinhorti] Direktorat Perlindungan Hortikultura. 2011. Penyakit Layu bakteri (Penyakit Darah/Moko Desease): Ralstonia (Pseudomonas) solanacearum E.F. Smith pv.
celebensis.
http://www.deptan.go.id/ditlinhorti.
[diakses 21 Maret 2015].
Girrard JP. 1992. Smoking in Technology of Meat Products. Clermont Ferrand.
Ellis Horwood, New York, USA.
Guo Y, Zheng Z, La Clair JJ, Chory J, Noel PJ. 2013. Smoke-derived karrikin perception by the α/β-hydrolase KAI2 from Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 110(20):
8284 8289.
Hadiwiyono. 2011. Blood bacterial wilt disease of banana: the distribution of pathogen in infected plant, symptoms, and potentiality of
diseased tissues as source of infective inoculums. Bioscience 3(3):
112-117
Jeol.1995. Spescimen Preparation Methods for Scanning Electron Microscope.
JEOL Application Note. Tokyo, Japan.
Kappachery S, Paul D, Yoon J, and Kweon J H. 2010. Vanillin, a potential agent to prevent biofouling of reverse osmosis membrane. J. Bioadhesion Biofilm Res. 26: 667-672.
Kloepper JW, Tuzun S. 1996. Induced
Acid Bacteria: Production, Purification, and Food Apllication.
Journal of Molecular Micribiology and Biotechnology 13: 1994-1999.
Madigan TM, Martinko JM, Parker J.
1997.Brock: Biology of Microorganisms. Eighth Edition.
Prentice Hall International Inc.
Toronto, USA.
Menefield M, Rasmussen TB, Henzter M.
2002. Halogenated furanones inhibit quorum sensing through accelerated LuxR turnover. Microbiology. 48(Pt 4):1119-1127.
Miller MB, Bassier BL. 2001. Quorum sensing in Bacteria. Annu. Rev.
Microbiol. 55(1): 165-199
Mugiastuti E, Manan A. 2009.
Pemanfaatan asap cair untuk mengendalikan Fusarium oxysporum dan Meloidogyne spp. Jurnal Pembangunan Pedesaan 9 (1): 43-49
Oyedemi SO, Okoh IA, Mabinya VL, Pirochenva G, Afolayan JA. 2008. The proposed mechanism of bactericidal action of eugenol, α-terpinol and γ-terpinene against Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes, Proteus vulgaris and Escherichia coli. African Journal of Biotechnology 8(7): 1280-1286.
Rudrappa T, Bais HP. 2008. Curcumin a know phenolic from Curcuma longa, attenuates the virulence of Pseudomonas aeruginosa PAO1 in whole plant and animal pathogenicity
122 models. J. Agric Food Chem.
56(6):1955-1962
Sequeira L. 1998. Bacterial Wilt : The Missing Element in International Banana Improvement Programs. In:
P.H. Prior, C. Allen and J.E Elphinstone, (Eds). Bacterial Wilt Disease, Molecular and Ecological Aspects. Gosier 22-27 Jun. Berlin : INRA. p 6-14.
Souza JBG, Re-Poppi N, Raposo L. 2012.
Characterization of pyroligneous acid used in agriculture by gas chromatography-mass
spectrometry. Journal of Brazilian Chemical Society 23(4): 610-617 Supriadi. 2003. A simple methode for
distinguishing isolate of blood disease bacterium (BDB) from
Ralstonia solanacearum through detection bacteriophage production.
Australasian Plant Pathology 32:
429-431.
Supriadi. 2005. Present status of Blood disease in Indonesia. In: Allen C, Prior P, Hayward CA. Bacterial Wilt Disease and The Ralstonia solanacearum species complex.APS Press. St. Paul. Minnesota USA.
Wainwright M. 1991. Streptomycin:
discovery and resultant controversy.
Hist.Phil.Life Sci. 13: 97-118
Zhou L, Zheng H, Tang Y, Yu W, Gong Q.
2013. Eugenol inhibits quorum sensing at sub-inhibitory concentrations. Biotechnol Lett 35(4):631-7. doi: 10.1007/s10529-012-1126
Prosiding Plant Protection Day II (2): 123-128 Sertifikasi Fitosanitari Ekspor Buah …
123
SERTIFIKASI FITOSANITARI EKSPOR BUAH SALAK TUJUAN CHINA