Gina Mondrida, Triningsih, Sutari, Sri Setiyowati, Agus Ariyanto, Puji Widayati, V.Yulianti Susilo dan W.Lestari.
Pusat Teknologi Radioisotop dan Radiofarmaka (PTRR) -BATAN Gedung 11, Kawasan Puspiptek Serpong
gina-m@batan.go.id
ABSTRAK
PEMBUATAN KOMPONEN KIT IRMA TSH UNTUK DETEKSI HORMON TIROID. Hormon tiroid merupakan hormon yang sangat diperlukan oleh tubuh untuk pertumbuhan fisik secara normal, perkembangan otak dan mental. Jika fungsi kelenjar tiroid terganggu maka sirkulasi hormon tiroid (T3 dan T4) dalam darah akan tidak normal,
sehingga menyebabkan beberapa penyakit tiroid. Oleh karena itu perlu dilakukan penetapan kadar TSH (Thyroid Stimulating Hormon) di dalam darah guna mengetahui apakah fungsi kelenjar tiroid bekerja secara normal. Penetapan kadar TSH (Thyroid Stimulating Hormon) di dalam darah biasa dilakukan dengan metode IRMA (Immunoradiometricassay). Metode IRMA merupakan salah satu teknik immunoassay yang berdasarkan reaksi imunologi (ikatan antigen-antibodi) dengan menggunakan radionuklida 125I sebagai perunut sehingga cuplikan dalam jumlah kecil dapat dideteksi. Pada penelitian ini telah dicoba membuat komponen kit IRMA TSH. Pembuatan kit IRMA TSH terdiri dari beberapa komponen yang perlu dipersiapkan yaitu: pembuatan perunut TSH (TSH-125I), pembuatan larutan standar TSH, pembuatan tabung berlapis antibodi TSH (coated tube). Perunut TSH (TSH-125I) dibuat dengan metode kloramin-T dengan rendemen penandaan 85,79 %, kemurnian radiokimia 98,20 %, serta aktifitas spesifik 34,316 µCi/µg. Seri larutan standar dibuat dengan melarutkan standar TSH dengan horse serum yang sudah dilewatkan dalam kolom charcoal. Komponen coated tube dibuat dengan menyalutkan monoklonal antibodi TSH (titer 1: 450) pada tabung star polistiren. Kit IRMA TSH yang dibuat menunjukkan kinerja assay yang baik, dengan NSB (Non Spesific Binding) = 0,74 % dan B/T = 32,06 %.
Kata kunci : Tiroid, IRMA (Immunoradiometricassay), TSH -125I, Coated tube
ABSTRACT
PRODUCTION OF TSH IRMA KIT COMPONENT FOR DETECTION OF TYROID HORMONE. Thyroid hormone is an extremely important hormone needed by the body for normal physical growth, brain and mental development.If the thyroid gland function is disrupted then the circulation of thyroid hormone (T3 and T4) in blood
will be abnormal, so it will cause some thyroid diseases. Therefore, TSH assay (Thyroid Stimulating Hormon) in the blood needs to be done to know wheather the function of the thyroid gland works normally. Detection of Thyroid Stimulating Hormon (TSH) in blood is commonly performed by Immunoradiometricassay (IRMA) method. IRMA method is one of the immunoassay techniques that is based on immunological reactions (antigen-antibody binding) using radionuclide 125I as a tracer, so the sampel in small quantity can be detected. In this research, TSH IRMA kit
components have beenproduced. The production of TSH IRMA kit consists of several components that need to be prepared i.e: TSH tracer (TSH-125I), TSH standard solution and TSH antibody coated tube. The TSH tracer (TSH-125I)
was prepared using a cloramine-T method with a labeling yield of 85.79%, radiochemical purity of 98.20% and specific activity of 34.316 Ci / mg. Series of standard solutions prepared by dissolving standard serum TSH with a horse that has been passed in a charcoal column. Coated tubes were made by coating TSH monoclonal antibody (titer 1: 450) in polystyrene star tubes. TSH IRMA kit assay showed good performance, with the NSB (Non-specific binding) = 0,74 % and B/T = 32,06 %.
Key words : Thyroid, IRMA (Immunoradiometricassay), TSH-125I, coated tube
PENDAHULUAN
ormon tiroid merupakan hormon yang sangat penting diperlukan oleh tubuh untuk pertumbuhan normal, perkembangan otak, mental dan fisik. Hormon-hormon yang aktif seperti T3 (triiodotironin) dan T4 (tiroksin) berguna sebagai katalis untuk reaksi oksidatif dalam sel jaringan
(thyrotropin releasing hormon) dari hipothalamus. Range normal TSH untuk orang dewasa 0,4 – 4,5 mIU/L, sedangkan untuk bayi 3 – 18 mIU/L. Jika fungsi kelenjar tiroid terganggu maka sirkulasi hormon tiroid (T3 dan T4) dalam darah akan tidak normal, sehingga menyebabkan beberapa penyakit tiroid seperti gangguan pada janin, abortus cacat bawaan, retardasi mental, bisu tuli, kelumpuhan dan
Gina Mondrida, dkk. ISSN 0216 - 3128 141
Prosiding Pertemuan dan Presentasi Ilmiah – Penelitian Dasar Ilmu Pengetahuan dan Teknologi Nuklir 2014 Pusat Sains dan Teknologi Akselerator - BATAN
Yogyakarta, 10 - 11 Juni 2014 ditunjukkan dengan prestasi dan IQ anak kurang,
sedangkan pada orang dewasa dapat terjadi gondok dan segala komplikasinya sampai terjadi kanker kelenjar tiroid [1,2,3,4]. Oleh karena itu perlu dilakukan penetapan kadar TSH (Thyroid Stimulating Hormon) di dalam darah guna mengetahui apakah fungsi kelenjar tiroid bekerja secara normal. Penetapan kadar TSH (Thyroid Stimulating Hormon) di dalam darah biasa dilakukan dengan teknik IRMA (Immunoradiometricassay)[5,6]. Selama ini kit IRMA TSH untuk deteksi TSH (Thyroid Stimulating Hormon) didapatkan dari impor dengan harga yang cukup mahal. PTRR telah membuat kit ini sejak beberapa tahun lalu dengan metoda partikel magnetik. Metode ini mempunyai banyak kekurangan, antara lain: pengerjaannya lebih rumit dan menggunakan peralatan yang lebih banyak, seperti: rotator, magnetic, separator dan lain-lain. Oleh karena itu perlu dilakukan penelitian pembuatan kit IRMA TSH dengan metode coated tube untuk deteksi hormon tiroid, yang lebih sederhana dan cepat.
Metode IRMA merupakan metode analisis yang berdasarkan pada reaksi imunologi (ikatan antigen- antibodi), dimana akan terjadi reaksi antara antigen (Ag) yang terdapat pada standar atau cuplikan dengan antibodi monoklonal bertanda (Ab*) dalam jumlah berlebih[7,8,11].
Prinsip penentuan kadar TSH (Thyroid Stimulating Hormon) dengan teknik IRMA adalah reaksi antara antigen (Ag) yang terdapat pada standar atau cuplikan dengan antibodi monoklonal bertanda (Ab*) dalam jumlah berlebih. Ke dalam suatu tabung yang sudah disalut dengan monoklonal antibodi TSH, kemudian ditambahkan sampel darah pasien (antigen tak bertanda) dan perunut TSH (monoklonal antibodi bertanda) dalam jumlah berlebih, kemudian diinkubasi. Setelah diinkubasi dalam waktu tertentu, selanjutnya dilakukan pemisahan antara antibodi bertanda (Ab*) bebas dan antibodi bertanda (Ab*) terikat. Besarnya keradioaktifan Ab* terikat ditentukan dengan pencacah gamma (γ). Dalam hal ini kadar Ag berbanding lurus dengan jumlah Ab* terikat. Makin banyak Ag (analit) dalam standar / cuplikan, makin banyak Ab* terikat (Ab*-Ag) yang terbentuk [9].
Kit IRMA yang baik harus menunjukkan kinerja assay, yaitu % NSB (Non Specific Binding) yang rendah dan ikatan maksimum (% B/T) yang tinggi. Kit yang baik umumnya mempunyai nilai NSB < 2 %. Jika nilai NSB tinggi, dapat diperkirakan bahwa antibodi bertanda atau antibodi telah rusak. Nilai B/T dalam kit IRMA haruslah mempunyai nilai % B/T >10%. Nilai ini tidak boleh turun secara drastis selama masa pakai kit tersebut. Jika nilai B/T rendah, maka dapat diperkirakan antibodi bertanda (perunut) atau antibodinya telah rusak [10].
Tujuan penelitian ini adalah untuk membuat komponen kit IRMA TSH dengan metode coated tube yang memenuhi syarat dan dapat digunakan dalam deteksi kadar TSH (Thyroid Stimulating Hormon) dalam serum darah manusia.
TATA KERJA
Alat dan BahanBahan yang digunakan adalah Monoklonal antibodi TSH beta for coating (E86214M dari Biodesign), Human TSH 98 % pure (H6TO4), Monoklonal antibodi TSH intact for labelling (E86712M dari Biodesign), Na125I dari PTRR-
BATAN, Kolom PD-10, Kloramin-T,
Natriumbisulfit (Na2S2O5), Bovin Serum Albumin, Tricloric Acid, Larutan Dapar Fosfat dari Merck, Tabung star (NUNC, Swedia) dan bahan kimia lainnya.
Alat yang digunakan adalah pencacah gamma model 600 Gammatec II (The Nucleus Inc & Model buatan USA) digunakan untuk pengukuran keradioaktifan pada saat penandaan, Gamma Management System (GMS, Berthold, Germany) untuk pencacahan pada saat melakukan assay, pH meter produksi Fisher Accument model 810 untuk pengukuran pH larutan bufer. Alat pengaduk model vorteks untuk mengaduk pereaksi pada saat penandaan dan assay. Timbangan analitik Mettler AE 160 untuk menimbang bahan-bahan yang diperlukan. Juga peralatan-peralatan lain yang digunakan sebagai peralatan penunjang untuk melakukan penelitian, seperti statif, berbagai ukuran pipet eppendorf beserta tipnya, peralatan gelas untuk pengenceran larutan, stop watch dan rak tabung reaksi.
Pembuatan Larutan Perunut TSH (TSH -125I) Ke dalam tabung polistiren ditambahkan 3,5 l (10 g) larutan Monoklonal antibodi TSH intact for labelling (E86712M dari Biodesign), 10 l dapar fosfat 0,5 M pH 7,5, sejumlah larutan Na125I (± 0,4 mCi) dan 10 l (10 g) Cloramin-T dalam larutan (0,5M dapar fosfat pH 7,5). Campuran diinkubasi selama 2 menit sambil diaduk. Kemudian reaksi dihentikan dengan penambahan 25 l (100 g) larutan Na2S2O5 dalam larutan (0,5 M dapar fosfat pH 7,5). Kemudian ditambahkan 10 l (10 g) KI 0,1 %. Hasil penandaan dimurnikan dengan menggunakan kolom sephadex G-25 (K9/30, Pharmacia). Selanjutnya ditentukan rendemen penandaan dan kemurnian radiokimia dari perunut TSH dengan metode kromatografi lapis tipis dengan fase diam kertas Whatman I dan fase gerak yaitu etanol : butanol : NH4OH dengan perbandingan 3:2:1.
142 ISSN 0216 - 3128 Gina Mondrida, dkk. Sebanyak 10 l Human TSH 98 % pure
(H6TO4), diencerkan dengan horse serum yang sudah dilewatkan kedalam kolom charcoal / celite. Diperoleh larutan standar TSH dengan konsentrasi (0, 0,5, 2,5, 5, 10, 20 dan 40 IU/mL). Untuk mengetahui konsentrasi dengan tepat, maka digunakan spektrofotometer UV/Vis. Larutan standar ini digunakan untuk membuat kurva kalibrasi menggunakan prosedur assay (protokol pengujian kit IRMA TSH) sebagaimana tersebut di bawah ini. Pembuatan Coated Tube TSH
Sebanyak 166,7 l (3 mg/ml) Monoklonal antibodi TSH beta (E86214M) dilarutkan dengan 225 ml NaHCO3 0,05M pH 8,5 (Titer 1:450). Kemudian dimasukkan sebanyak 250 l ke dalam masing- masing tabung star NUNC dan diinkubasi selama 44 jam pada suhu kamar. Buang cairan, kemudian tabung tersebut dibilas dengan NaHCO3 0,05M pH 8,5 + 0,1 % BSA (Bovin Serum Albumin) + Tween 0,05 % (washing solution). Kemudian ditambahkan ke dalam masing-masing tabung 1 ml NaHCO3 0,05M pH 8,5 + 3 % BSA (Blocking solution) dan diinkubasi selama 22 jam pada suhu kamar. Buang cairan, kemudian tabung tersebut dibilas dengan NaHCO3 0,05M pH 8,5 + 0,1 % BSA (Bovin Serum Albumin) + Tween 0,05 % (washing solution). Tabung dikeringkan pada suhu kamar, setelah itu disimpan pada suhu 4oC. Tabung bersalut monoklonal antibodi TSH ini disebut tabung coated tube (CT) dan siap digunakan untuk assay.
Protokol Assay kit IRMA TSH
Tabung coated tube (CT) diberi nomor lalu ditambahkan 50 l larutan standar TSH dengan konsentrasi (0, 2,5, 5, 10, 20 dan 40 IU/mL) ke dalam masing-masing tabung CT dan 50 l larutan perunut TSH (TSH-125I) dengan aktifitas tertentu, serta 300 l assay buffer ( PBS 0,05 M pH 7,5 + BSA 0,1 %). Kemudian tabung tersebut dikocok dengan vortek hingga homogen dan diinkubasi semalam pada suhu kamar dengan shaker pada 400 rpm. Supernatan dibuang dengan membalikkan tabung di atas kertas tisu selama 5 menit. Masing- masing tabung diukur dengan alat pencacah gamma selama 1 menit.
Penentuan rendemen hasil penandaan
Fraksi yang mengandung antigen/antibodi bertanda kemudian dikumpulkan dan dihitung rendemen penandaannya dengan rumus sebagai berikut :
Radioaktifitas TSH-125I
% Rendemen = --- X 100% Radioaktifitas 125I awal
Uji kemurnian radiokimia perunut TSH
Uji kemurnian radiokimia perunut TSH (TSH- 125I) ditentukan dengan kromatografi lapis tipis (KLT) dengan fasa diam kertas whatman 1 dan fasa gerak campuran Ethanol : Butanol : NH4OH dengan perbandingan 3:2:1. Rf perunut TSH (TSH-125I) = 0,0.
K R = X 100 %
Penentuan Aktivitas Jenis Hasil Penandaan Aktivitas jenis hasil penandaan ditentukan dengan cara sebagai berikut:
% Yield x aktivitas Na125I (µCi) Aktivitas Jenis = --- Jumlah MAb yang digunakan
HASIL DAN PEMBAHASAN
Dari hasil pembuatan perunut TSH (TSH-125I) dengan cara penandaan monoklonal antibodi TSH dengan Na125I (produksi PTRR), menggunakan oksidator kloramin-T dan kolom PD-10 serta eluen dapar fosfat 0,05 M pH 7,5, didapatkan rendemen penandaan (Yield) rata-rata sebesar 85,79 %. TSH- 125I keluar duluan pada fraksi no.6 - 8, sedangkan 125I bebas keluar belakangan pada fraksi no.18 – 20 seperti yang terlihat pada gambar 1.
Gambar 1. Kromatogram hasil penandaan TSH dengan Na125I (produksi PTRR), menggunakan oksidator kloramin-T dan kolom PD-10 serta eluen dapar fosfat 0,05 M pH 7,5.
Dari hasil uji kemurnian radiokimia perunut TSH (TSH-125I), perunut TSH (TSH-125I) tertinggal di nol (Rf = 0,0 – 0,1) dengan kemurnian radiokimia sebesar 98,20%, sedangkan pengotornya naik (Rf = 1), seperti yang terlihat pada gambar 2. Hal ini menunjukkan bahwa metoda uji kemurnian
