Sebanyak 5 l kaldu fermentasi yang telah mengalami perlakuan sonifikasi untuk memecah sel, disentrifugasi pada kecepatan 14000 x g selama 15 menit. Sel beserta supernatan dipisahkan, dan masing-masing diekstraksi dengan pelarut organik dan dikeringkan sampai diperoleh bobot konstan. Sebanyak 5 l kaldu fermentasi diperoleh bobot kering sel sisa ekstraksi sebanyak 4,73 g L-1, bobot kering ekstrak sel dengan metanol sebanyak 2,72 g L-1 dan bobot kering ekstrak supernatan dengan etil asetat sebanyak 0,33 g L-1. Ekstrak supernatan yang terbukti menunjukkan aktivitas antimikroba selanjutnya dipurifikasi dengan menggunakan kromatografi kolom dan HPLC preparatif. Fraksi-fraksi yang dihasilkan dalam proses purifikasi dengan kromatografi kolom dan HPLC prepratif ditampung dan masing-masing fraksi diuji aktivitas antibakterinya untuk menentukan fraksi mana yang memiliki aktivitas. Selanjutnya untuk mengetahui profil kromatogram hasil pemurnian maka fraksi aktif dianalisis menggunakan HPLC analitik. Hasil HPLC analitik menggunakan kolom Water Column symmetry C18 (4,6 x 250 mm, Part No.WAT054275) menunjukkan bahwa senyawa aktif hasil pemurnian memiliki kemurnian yang relatif tinggi (Gambar 10a). Senyawa aktif ini dicirikan dengan waktu retensi 12,1 menit dan memiliki serapan maksimum pada panjang gelombang 210 dan 274,5 nm (Gambar 11b).
Menurut Kumar et al. 2009 sebagian besar antibiotik golongan peptida memiliki serapan panjang gelombang maksimum pada 210-230 dan 270-280 nm. Serapan pada panjang gelombang 220-230 nm berhubungan dengan karakteristik serapan ikatan peptida. Kromatogram HPLC analitik dan spektrum serapan UV vis antibiotik yang telah dimurnikan disajikan dalam Gambar 10a & 10b.
(a) AU 0.00 1.00 2.00 Minutes 5.00 10.00 15.00 20.00
12
.0
6
1
AU 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 nm 250.00 300.00 350.00 210.6 274.5 (b) menit (a)Gambar 10 (a) Kromatogram HPLC analitik senyawa aktif murni hasil isolasi. (b) Spektrum serapan UV vis senyawa aktif murni hasil isolasi.
Senyawa aktif murni yang diperoleh selanjutnya ditentukan bobot molekul dan struktur molekulnya menggunakan LC-MS, 1HNMR, 13C NMR, DEPT 13C NMR, dan FTIR. Dari hasil analisis menggunakan LC-MS diketahui bahwa senyawa aktif yang dihasilkan oleh isolat A11 memiliki bobot molekul sebesar 260 g mol-1, pada LC-MS m/z (M+H)+ ditunjukkan sebesar 261 (Gambar 11).
Dari database program LCT Premier-XE Waters menunjukkan bahwa senyawa ini memiliki 14 atom karbon, 16 atom hidrogen, 2 atom nitrogen, dan 3 atom oksigen.
Gambar 11 Spektrum LC-MS m/z 261 (M+H)+ senyawa aktif yang dihasilkan oleh isolat Streptomyces sp.A11.
Selanjutnya hubungan tata letak atom karbon dan atom hidrogen ditentukan menggunakan 1HNMR, 13CNMR, DEPT 13CNMR. Spektrum 1HNMR yang diperoleh dari Bruker AV-500 (500 MHz) dengan tetramethylsilane (TMS) sebagai standar internal dalam pelarut metanol-D4 dan memberikan data sebagai berikut; δH: 4,4 (t, 1H), 4,0(1H, dd), 2,1 (2H, m), 1,8 (2H, m), 3,5 (2H, dd), 3,1 (2H, dd), 7,0 (2H, d), 6,7 (2H, d), dan δC : 170,8 (s), 58,0 (d), 167,0 (s), 60,1 (d), 29,4 (t), 22,5 (t), 45,9 (t), 37,7 (t), 127,7 (s), 132,1 (d), 116,3 (d), 157,7 (s). Spektrum 1HNMR dan 13CNMR ditunjukkan pada Gambar 12a dan 12b.
12. (a)
12.(b)
Gambar 12 Spektrum 1HNMR (a) dan spektrum 13CNMR (b) senyawa aktif yang dihasilkan oleh isolat Streptomyces sp.A11.
Dari hasil interpretasi spektrum LC-MS, 1HNMR, dan 13C NMR, diduga struktur molekul senyawa tersebut adalah seperti yang disajikan dalam Gambar 13.
Gambar 13 Struktur molekul senyawa aktif yang dihasilkan oleh isolat A11
Dua singlet atom karbon yang merupakan atom karbon dari gugus keton pada δC 170,8 (s)(C1) dan δC 166,9 (s) (C4) (Gambar 12b). Analisis lebih lanjut dari spektrum 13C, dua atom karbon yang tidak tersubstitusi ditunjukkan pada δC 127,7 (C1’) dan 157,7 (C4’). Enam karbon methine ditunjukkan pada δC 57,9 (C3), 60,1 (C6), 132,1 (C2’), 116,3 (C3’), 116,2 (C5’), 132,1 (C6’), dan empat karbon methylene ditunjukkan pada δC 29,4 (C7), 22,5 (C8), 45,9 (C9), 37,7 (C10).
DEPT 135° dan 90° (Gambar 14) menunjukkan ada enam karbon methine [δC 57,9 (C3), 60,1 (C6), 132,1 (C2’), 116,3 (C3’), 116,2 (C5’), 132,1 (C6’)] dan empat karbon methylene [δC 29,4 (C7), 22,5 (C8), 45,9 (C9), 37,7 (C10)]. Dari spektrum DEPT 13C NMR terlihat puncak (C6’) tumpang tindih dengan (C2’) dan (C3’) tumpang tindih dengan (C5’). Hal ini disebabkan posisi (C6’) simetri dengan (C2’) dan (C3’) simetri dengan (C5’) yang mendapatkan pengaruh atau gugus tetangga dan awan elektron yang sama besar.
Apabila dilihat dari geseran kimianya, proton pada posisi C3’ dan C5’ lebih upfield dibandingkan dengan proton pada posisi C2’ and C6’, hal ini disebabkan karena efek lindungan (shielding effect) dari gugus hidroksi pada posisi C4’ dan membentuk posisi ortho dengan atom C3’ and C5’. Hal yang sama terjadi pada C1’ (posisi para dengan C4’) yang tergeser lebih upfield dibandingkan C2’ dan C6’.
Gambar 14 Spektrum DEPT 13
C NMR senyawa aktif yang dihasilkan oleh isolat Streptomyces sp.A11
Hasil analisis menggunakan spektrum infra merah (Gambar 15), pita karakteristik senyawa ini ditunjukkan pada 3383 cm-1 (N-H), 3227 cm-1 (O-H), 2959 cm-1 (saturated C-H), 1660 cm-1 (C=O), 1515 cm-1 (cincin benzen), 1456 cm-1 (methine), 1344 cm-1 (methylene), 1232 cm-1 (fenol), 1116 cm-1 (C-O), 827 cm-1 (p-disubstituted benzene ring). Pola spektrum infra merah ini sangat mirip dengan senyawa siklo(tirosil-prolil) yang telah ditemukan sebelumnya oleh Milne et al. (1992). Informasi yang diperoleh dari spectrum infra merah menguatkan bahwa senyawa aktif yang diperoleh adalah siklo(tirosil-prolil). Identifikasi dilanjutkan pada uji titik leleh menggunakan Gallen Kamp Melting Point Bicasa. Hasil uji menunjukkan bahwa senyawa aktif yang dihasilkan oleh Streptomyces sp A11 memiliki titik leleh sebesar 140 °C.
Gambar 15 Spektrum inframerah senyawa aktif yang dihasilkan oleh isolat Streptomyces sp.A11
Data spektrum infra merah yang menunjukkan gugus fungsional yang terdapat dalam senyawa tersebut memperkuat data 13C NMR dan 1H NMR. Data kombinasi spektrum 13C NMR dan 1H NMR yang menunjukkan posisi atom C dan atom H pada gugus fungsional yang ditunjukkan oleh spektrum Infra Red disajikan dalam Tabel 8.
Senyawa aktif yang dihasilkan oleh isolat A11 termasuk dalam kelompok siklodipeptida dengan nama siklo(tirosil-prolil). Siklo(tirosil-prolil) juga dihasilkan oleh Alternaria alternate yang digunakan sebagai host-specific phytotoxin untuk tumbuhan spotted knapweed (Stierle et al.1988) dan dihasilkan juga oleh Pseudomonas fluorescens GcM5-1A yang diisolasi dari pine wood nematode (PWN), Bursaphelenchus xylophilus (Guo et al. 2007). Menurut Graz et al.(2000) disamping memiliki aktivitas antibakteri, siklo(tirosil-prolil) adalah senyawa yang dapat digunakan untuk mengiduksi pematangan dalam terapi sel kanker, disamping itu menurut Graz et al.(1999) siklo(tirosil-prolil) juga memiliki aktivitas dalam pematangan sel gastrointestinal.
Apabila dibandingkan dengan sebelum diperoleh isolat A11 dari Pantai Anyer Banten, penelitian ini telah mampu memberikan nilai tambah terhadap
isolat-isolat mikroba laut yang belum sepenuhnya dimanfaatkan. Dengan ditemukannya senyawa aktif siklo(tirosil-prolil) yang dihasilkan oleh isolat Streptomyces sp.A11 maka ada nilai tambah yang diperoleh dari pemanfaatan isolat ini. Siklo(tirosil-prolil) memiliki nilai ekonomis yang tinggi, dari daftar harga Chem-info di dalam (http://www.chem-info.com/trade/sell/Cyclo(-Pro- Tyr)-518590.html) menunjukkan bahwa harga siklo(tirosil-prolil) murni sebesar US$ 155 per gramnya. Dengan demikian senyawa ini memiliki potensi untuk dikembangkan dan diproduksi.
Tabel 8 Data spektrum 13C NMR dan 1H NMR yang menunjukkan posisi atom C dan H pada gugus fungsionalnya
No δ13 C (ppm) δ1H (ppm) (dalam MeOD) Gugus fungsional 1 170,8 (s) C O N R 2 3 57,9 (d) 4,4 (t) CH 4 166,9 (s) C O N R 5 6 60,1 (d) 4,0(dd) CH 7 29,4 (t) 2,1 (m) -CH2- 8 22,5 (t) 1,8 (m) -CH2- 9 45,9 (t) 3,5 (dd) CH2 N 10 37,7 (t) 3,1 (dd) -CH2- 1’ 127,7 (s) C R 2’ 132,1 (d) 7,0 (d) =CH- 3’ 116,3 (d) 6,7 (d) =CH- 4’ 157,7 (s) C OH 5’ 116,3 (d) 6,7 (d) =CH- 6’ 132,1 (d) 7,0 (d) =CH-
IV.5. Penentuan Minimum Inhibitory Concentration (MIC) Senyawa Aktif