Sebelum dilakukan isolasi aktinomisetes, terlebih dahulu dilakukan penelitian pendahuluan untuk menentukan metode pra-perlakuan sampel yang paling tepat. Pra-perlakuan sampel dilakukan untuk mengurangi pertumbuhan mikroba yang tidak dikehendaki (mikroba kontaminan), sehingga proses isolasi aktinomisetes menjadi lebih mudah. Sampel yang digunakan untuk penentuan metode pra-perlakuan ini adalah sampel yang diambil dari Pantai Anyer Banten. Hasil pra-perlakuan sampel isolasi aktinomisetes disajikan dalam Tabel 5.
Pra-perlakuan ke-1 sampai dengan ke-5 menunjukkan mikroba kontaminan menutup seluruh permukaan medium agar (Tabel 5). Hal ini akan menekan pertumbuhan aktinomisetes dan mempersulit proses pengambilan koloni aktinomisetes. Pra-perlakuan dengan pemanasan dan pengasaman diharapkan dapat menekan pertumbuhan bakteri Gram-negatif yang banyak terdapat di air laut. Dibandingkan dengan metode 1 sebagai kontrol, metode pemanasan dan pengasaman mampu menekan bakteri kontaminan, terbukti kecepatan pertumbuhan bakteri kontaminan lebih lambat dibandingkan dengan kontrol (metode ke-1). Namun demikian metode pemanasan dan pengasaman belum efektif untuk digunakan dalam isolasi ini, karena pada hari ke-3 permukaan medium agar masih dipenuhi oleh bakteri kontaminan, koloni aktinomisetes akan muncul pada hari ke-15 sampai dengan hari ke-21 (Hozzein et al. 2008; Dhanasekaran et al. 2009). Seperti halnya metode ke-2 dan ke-3, metode isolasi dengan penambahan sikoloheksimid dan nistatin pada medium isolasi, belum dapat menekan pertumbuhan bakteri kontaminan secara keseluruhan. Pada hari ke-3 pertumbuhan bakteri kontaminan masih menutup seluruh permukaan medium agar. Sikloheksimid dan nistatin hanya efektif menghambat pertumbuhan fungi dan khamir. Dengan demikian mikroba yang mampu tumbuh dan berkembang pada medium yang mengandung sikloheksimid dan nistatin diduga adalah kelompok bakteri.
Tabel 5 Hasil pra-perlakuan sampel pada proses isolasi aktinomisetes.
Metode ke-
Jenis pra-perlakuan Pengamatan pertumbuhan
mikroba kontaminan
Keterangan
1 Tanpa adanya pra-perlakuan (kontrol)
Sangat banyak Inkubasi hari ke-2, seluruh permukaan medium isolasi dipenuhi mikroba
kontaminan 2 Pemanasan sampel pada 60 °C
selama 4 jam
Banyak Inkubasi hari ke-3, seluruh permukaan medium isolasi dipenuhi mikroba
kontaminan 3 Pengasaman sampel pada pH 2
selama 2 Jam
Banyak Inkubasi hari ke-3, seluruh permukaan medium isolasi dipenuhi mikroba
kontaminan 4 Pemanasan sampel pada 60 °C
selama 4 jam dan penambahan sikloheksimid 100 μg mL-1 dan nistatin 25 μg mL-1
Banyak Inkubasi hari ke-3, seluruh permukaan medium dipenuhi mikroba kontaminan
5 Pengasaman pada pH 2 selama 2 jam dan penambahan
sikloheksimid 100 μg mL-1 dan nistatin 25 μg mL-1
Banyak Inkubasi hari ke-3, seluruh permukaan medium dipenuhi mikroba kontaminan
6 Pemanasan pada 60 °C selama 4 jam dan penambahan
sikloheksimid 100 μg mL-1, nistatin 25 μg mL-1, asam
nalidiksat 20 μg mL-1, rifampisin 5 μg mL-1
Sedang Pertumbuhan koloni terpisah dan tidak tertutup oleh
mikroba kontaminan
7 Pengasaman pada pH 2 selama 2 jam dan penambahan
sikloheksimid 100μg mL-1, nystatin 25 μg mL-1, asam
nalidiksat 20 μg mL-1, rifampisin 5 μg mL-1
Sedang Pertumbuhan koloni terpisah dan tidak tertutup oleh
mikroba kontaminan
8 Pemanasan pada 60 °C selama 4 jam dan penambahan
sikloheksimid 100 μg mL-1, nistatin 25 μg mL-1, asam nalidiksat 40 μg mL-1, rifampisin 10 μg mL-1
Tidak tumbuh Pertumbuhan koloni aktinomisetes juga tertekan (tidak tumbuh)
9 Pengasaman pada pH 2 selama 2 jam dan penambahan
sikloheksimid 100 μg mL-1, nistatin 45 μg mL-1, asam nalidiksat 30 μg mL-1, rifampisin 10 μg mL-1
Tidak tumbuh Pertumbuhan koloni aktinomisetes juga tertekan (tidak tumbuh).
Keterangan : Komposisi medium isolasi; soluble starch 10 g, pepton 2 g, ekstrak khamir 4 g, agar 16 g dalam 1000 mL air laut
Selanjutnya penambahan antibiotik rifampisin 5 μg mL-1 dan asam nalidiksat 20 μg mL-1 terlihat mampu menekan pertumbuhan bakteri Gram-postif dan Gram-negatif. Kombinasi antara pra-perlakuan pemanasan atau pengasaman dengan penambahan antibiotik sikloheksimid 100 μg mL-1, nistatin 25 μg mL-1, asam nalidiksat 20 μg mL-1, rifampisin 5 μg mL-1 mampu menekan pertumbuhan mikroba kontaminan, sehingga pada inkubasi sampai dengan hari ke-21 beberapa koloni aktinomisetes dapat tumbuh dan tidak tertutup oleh mikroba kontaminan, baik itu fungi maupun bakteri lainnya. Namun demikian beberapa koloni fungi dan bakteri tetap tumbuh dalam medium agar, dan tidak menutup koloni lainnya. Menurut Seong et al. 2001 pemanasan suspensi sampel pada suhu 70 °C selama 15 menit mampu menurunkan populasi bakteri Gram-negatif dan fungi kontaminan, serta dapat menaikkan rasio koloni aktinomisetes. Penambahan nistatin 50 μg mL-1 dan asam nalidiksat 20 μg mL-1 mampu menekan pertumbuhan fungi dalam medium isolasi. Menurut Pisano et al. (1989) rifampicin 2,5 μg mL-1 efektif menekan pertumbuhan bakteri Gram-negatif. Namun demikian komposisi dan konsentrasi antibiotik dalam medium isolasi yang digunakan akan berbeda tergantung dari biodiversitas mikrooganisme di dalam sampel. Pada penelitian ini penggunaan pra-perlakuan kombinasi pemanasan atau pengasaman sampel yang dikombinasikan dengan sikloheksimid dan nistatin belum sepenuhnya efektif untuk mengurangi sejumlah bakteri kontaminan. Kombinasi metode pra-perlakuan pemanasan atau pengasaman dengan penambahan sikloheksimid 100 μg mL-1, nistatin 25 μg mL-1, asam nalidiksat 20 μg mL-1, rifampisin 5 μg mL-1 dalam medium agar, lebih efektif menghambat mikroba kontaminan dan meningkatkan jumlah koloni aktinomisetes. Rifampisin diketahui efektif menghambat bakteri Gram-negatif dan Gram-positif, serta mampu menghambat mikobakterium yang banyak terdapat di daerah perairan. Namun demikian pada penambahan konsentrasi rifampisin dan asam nalidiksat menjadi dua kalinya (pra-perlakuan ke-8 dan ke-9) ternyata berakibat menghambat pertumbuhan koloni aktinomisetes dan mikroba lainnya. Sampai dengan inkubasi 21 hari, belum ada koloni aktinomisetes yang mampu tumbuh pada medium isolasi tersebut. Dengan demikian pada tahap selanjutnya akan digunakan pra-perlakuan dengan metode ke-6 dan ke-7.
IV.2. Isolasi Aktinomisetes
Hasil isolasi aktinomisetes laut yang diambil dari tiga lokasi diperoleh 5 isolat dari pantai utara Cirebon, 29 isolat dari Pantai Anyer Banten, dan 6 isolat dari Pantai Kukup Gunung Kidul Yogyakarta. Jumlah aktinomisetes yang dapat diisolasi setiap bobot sampel sedimen laut relatif lebih sedikit dibandingkan dengan isolasi aktinomisetes dari tanah. Namun demikian potensi untuk mendapatkan mikroba unggul dari aktinomisetes laut lebih besar karena kondisi lingkungan laut yang lebih bervariasi dibandingkan di tanah. Menurut Goodfellow (1983) bahwa walaupun jumlah aktinomisetes yang dapat diisolasi dari laut cenderung lebih sedikit dibandingkan dari tanah namun demikian karakteristik aktinomisetes laut lebih bervariasi dan lebih berpotensi.
Pada komposisi medium isolasi dan sejumlah antibiotik yang ditambahkan sama, maka apabila dilihat dari kedua proses pra-perlakuan yaitu dengan menggunakan panas (heatshock treatment) dan menggunakan pengasaman (acid treatment) maka terlihat bahwa pra-perlakuan dengan pemanasan lebih efektif dibandingkan pra-perlakuan dengan pengasaman. Praperlakuan pemanasan terbukti mampu menekan pertumbuhan bakteri kontaminan yang biasanya akan tumbuh pada awal inkubasi. Sebaliknya pra-perlakuan asam terbukti masih banyak bakteri kontaminan yang tumbuh dan menyebabkan sulitnya proses pemurnian koloni aktinomisetes. Menurut Hoskisson et al. (2000) perlakuan pemanasan sampel pada 60 °C mampu meningkatkan 5 kali jumlah spora Micromonospora echinospora yang dikulturkan dibandingkan tanpa pemanasan. Disamping mampu menekan bakteri kontaminan perlakuan pemanasan terbukti mampu meningkatkan aktivasi proses respirasi spora dan memacu penggunaan senyawa yang digunakan. Apabila pemanasan dinaikkan menjadi 70 °C, maka waktu yang dibutuhkan untuk proses aktivasi menjadi lebih pendek, namun terjadi pengurangan jumlah spora yang dikulturkan. Pemanasan sampel pada suhu 50 °C selama 30 menit tidak berpengaruh tarhadap pertumbuhan spora yang dikulturkan dibandingkan kontrol. Hal yang sama disampaikan oleh Karwowski (1986) bahwa pemanasan pada suhu 70 °C dalam waktu lebih dari 30 menit berpotensi mengurangi jumlah spora yang dapat dikulturkan pada medium isolasi. Hal yang
sama dilakukan oleh Seong et al. (2001). Pemanasan suspensi sampel pada 70 °C dalam waktu lebih dari 30 menit dengan kombinasi penambahan Nistatin 50 μg
mL-1dan asam nalidiksat 20 μg mL-1 mampu menekan pertumbuhan mikroba kontaminan seperti khamir dan fungi.
Apabila dilihat dari jumlah aktinomisetes yang dapat diisolasi setiap lokasi pengambilan sampel, terlihat bahwa sampel dari Pantai Anyer Banten menunjukkan jumlah aktinomisetes terbanyak dibanding dengan sampel dari pantai Selatan Yogyakarta dan pantai Utara Cirebon. Perbedaan jumlah isolat yang diperoleh dalam setiap lokasi pengambilan sampel terlihat sangat besar. Salah satu penyebab sedikitnya isolat aktinomisetes yang mampu diisolasi dari Pantai Selatan Yogyakarta dan Pantai Utara Cirebon diduga adalah rentang waktu yang cukup lama antara pengambilan sampel dengan proses penyebaran sampel dalam medium agar (medium isolasi). Hal ini menyebabkan bakteri kontaminan tumbuh secara cepat dan bertambah banyak, sehingga mempersulit proses isolasi. Sebagian besar sampel dari pantai Utara Cirebon dan Pantai Selatan Yogyakarta menunjukkan pertumbuhan bakteri kontaminan yang cepat dan menutup seluruh permukaan medium isolasi dalam satu minggu inkubasi yang menyebabkan sulit tumbuhnya aktinomisetes.
