Salah satu komponen utama dalam medium fermentasi mikroba disamping sumber karbon adalah sumber nitrogen. Nitrogen digunakan sebagai sumber sintesis asam amino, purin, piridin, protein, DNA dan RNA (Vogel 1996). Sumber nitrogen juga berperan penting dalam pembentukan biomassa sel pada fase pertumbuhan, disamping itu sumber nitrogen juga berperan penting dalam pembentukan metabolit sekunder khususnya antibiotik golongan peptida (Umezawa et al. 1978). Disamping konsentrasi sumber nitrogen dalam medium fermentasi, jenis sumber nitrogen juga berpengaruh terhadap produktifitas metabolit primer atau sekunder yang dihasilkan oleh mikroorganisme. Sumber nitrogen komplek organik banyak digunakan dalam produksi metabolit sekunder antibiotik dibandingkan dengan sumber nitrogen inorganik seperti nitrat, nitrit, dan ammonium sulfat (Aharonowitz 1980). Dengan demikian pemilihan jenis sumber nitrogen berperan penting dalam proses produksi metabolit primer atau sekunder. Sumber nitrogen yang digunakan dalam percobaan ini meliputi sumber nitrogen kompleks seperti pepton, ekstrak khamir, kasein hidrolisat dan sumber nitrogen non kompleks seperti asam glutamat dan ammonium sulfat. Hasil
percobaan pemilihan sumber nitrogen terbaik menunjukkan bahwa pepton terlihat menghasilkan konsentrasi siklo(tirosil-prolil) paling tinggi, yaitu sebesar 22,7 mg L-1, selanjutnya kasein sebesar 21,65 mg L-1, ekstrak khamir 12,88 mg L-1, dan asam glutamate 9,99 mg L-1. Sumber nitrogen ammonium sulfat terlihat tidak menghasilkan konsentrasi antibiotik.
Hasil analisis ragam (Lampiran 14a) menunjukkan bahwa perlakuan terhadap beberapa sumber nitrogen berpengaruh nyata terhadap konsentrasi antibiotik yang dihasilkan. Namun demikian hasil Uji Duncan dengan taraf nyata α (0,05) menunjukkan bahwa konsentrasi antibiotik yang dihasilkan oleh sumber nitrogen pepton dan kasein adalah tidak berbeda nyata. Dilihat dari tingkat konsumsi nitrogen antara pepton dan kasein (Tabel 11), yaitu nitrogen total awal fermentasi dikurangi nitrogen total akhir fermentasi adalah hampir sama, hal ini menunjukkan bahwa penggunakan sumber nitrogen pepton dan kasein tidak berbeda nyata. Data selengkapnya disajikan dalam Gambar 22 dan Tabel 11.
0 5 10 15 20 25
amonium sulfat ekstrak khamir asam glutamat kasein pepton
sumber nitrogen k o n s en tr asi s ik lo( ti ro s il -pr o li l) (m g L -1 )
Gambar 22 Pengaruh sumber nitrogen terhadap konsentrasi siklo(tirosil-prolil)
Dari Tabel 11 terlihat bahwa tingkat konsumsi pepton dan kasein relatif tinggi dibandingkan dengan sumber nitrogen lainnya, hal ini diimbangi juga dengan produktivitas antibiotik yang tinggi. Berbeda halnya dengan konsumsi
sumber nitrogen ekstrak khamir, terlihat tingkat konsumsi ekstrak khamir tinggi namun produktivitas antibiotik relatif lebih kecil dibanding pepton dan kasein. Diduga tingginya konsumsi ekstrak khamir ini lebih banyak dikonversi menjadi biomassa dibandingkan dengan konversi menjadi siklo(tirosil-prolil).
Tabel 11 Pengaruh perlakuan sumber nitrogen terhadap konsentrasi siklo(tirosil- prolil) Sumber nitrogen Nitrogen total awal fermentasi (mg.mL-1) Nitrogen total akhir fermentasi (mg.mL-1) Konsentrasi siklo(tirosil- prolil) (mg.L-1) Jumlah konsumsi nitrogen total (mg.mL-1) Asam glutamat (C5H9NO4) 0,76 0,44 9,99 0,32 Pepton 0,76 0,35 22,70 0,41 Kasein 0,75 0,34 21,65 0,41 Ekstrak khamir 0,74 0,30 12,88 0,44 Amonium sulfat (NH4)2SO4 0,75 0,55 0 0,20
Pepton (Difco) merupakan produk hidrolisis dari protein hewani yang diambil dari albumin. Pepton mengandung bermacam-macam asam amino hasil hidrolisis protein hewani. Pepton banyak digunakan untuk medium sumber nitrogen kompleks dalam proses fermentasi. Sedangkan kasein (Difco) merupakan produk hidrolisis protein susu yang diperoleh dari kasein susu. Seperti halnya pepton, kasein juga kaya akan protein yang disusun dari beberapa macam asam amino. Kasein banyak digunakan dalam medium fermentasi atau campuran dalam medium agar. Menurut Aharonowitz (1980), keterlibatan nitrogen dalam regulasi metabolisme biosintesis antibiotik dapat dikategorikan dalam 2 jalur. Pertama, nitrogen dalam bentuk asam amino terlibat langsung dalam pembentukan antibiotik. Asam amino bertindak sebagai prekursor dalam proses pembentukan antibiotik. Proses ini banyak terjadi dalam pembentukan antibiotik golongan peptida. Sebagai contoh pada biosintesis antibiotik gramisidin oleh Bacillus sp dan Pseudomonas, dibutuhkan 5 asam amino yang terlibat langsung sebagai prekursor dalam pembentukan biosintesis gramisidin tersebut. Kedua, nitrogen dalam bentuk atom nitrogen terlibat dalam biosintesis metabolit primer dan berlanjut menjadi senyawa metabolit sekunder.
Dilihat dari keterlibatan nitrogen dalam biosintesis antibiotik seperti yang dikemukaan oleh Aharonowitz (1980), diduga peran nitrogen dalam biosintesis
siklo(tirosil-prolil) mengikuti jalur yang pertama, yaitu asam amino terlibat langsung dalam biosintesis antibiotik. Hal ini dikuatkan dari penggunaan sumber nitrogen pepton dan kasein yang mengandung asam amino menghasilkan produktivitas siklo(tirosil-prolil) yang lebih tinggi. Lautru et al. (2002) menjelaskan bahwa biosintesis siklo(phe-leu) disusun oleh asam amino phenil alanin dengan leusin secara langsung dari asam amino, masing-masing asam amino diaktifkan oleh siklodipeptida sintetase (CDPSs) melalui gen AlbC. Sampai saat ini belum ada literatur yang menjelaskan mengenai biosintesis pembentukan siklo(tirosil-prolil). Biosintesis pembentukan siklo(tirosil-prolil) diduga melalui jalur pengaktifan asam amino tirosin dan prolin dengan menggunakan siklodipeptida sintetase seperti yang dijelaskan oleh Lautru et al. (2002). Kemungkinan reaksi pembentukan siklo(tirosil-prolil) terjadi adalah seperti yang disajikan dalam Gambar 23.
HO O O H HN N H2+ - H3+ - + siklodipeptida sintetase(CDPSs)
prolin tirosin siklo(tirosil-prolil)
Gambar 23 Reaksi pembentukan siklo(tirosil-prolil)
Apabila dilihat dari komposisi asam amino dari sumber nitrogen pepton, kasein, dan ekstrak khamir, terlihat bahwa ketiga sumber nitrogen ini mengandung asam amino prolin dan tirosin dalam bentuk bebas dan terikat dalam protein seperti yang disajikan dalam Tabel 12.
Pepton mengandung total prolin, tirosin bebas, dan total tirosin yang lebih tinggi dibandingkan kasein dan ekstrak khamir. Kasein mengandung jumlah prolin bebas, total prolin, tirosin bebas, dan total tirosin yang lebih besar dibandingkan dengan ekstrak khamir. Konsentrasi siklo(tirosil-prolil) yang dihasilkan oleh pepton dan kasein lebih tinggi dibandingkan dengan ekstrak khamir. Hal ini mendukung dugaan bahwa biosintesis siklo(tirosil-prolil)
dipengaruhi oleh adanya asam amino prolin dan tirosin dalam medium fermentasi seperti yang dijelaskan oleh Lautru et al. (2002).
Tabel 12 Kandungan prolin dan tirosin dalam pepton, kasein, dan ekstrak khamir.
Sumber Nitrogen Komplek Prolin Bebas (%) Total Prolin (%) Tirosin Bebas (%) Total Tirosin (%) Pepton (Difco) 0,3 8,8 0,5 0,6 Kasein (Difco) 0,5 8,0 0,4 0,4 Ekstrak khamir (Difco) 0,3 2,3 0,1 0,2 sumber: katalog Difco 2004.
Penggunaan sumber nitrogen asam glutamat terlihat mampu menghasilkan siklo(tirosil-prolil) walaupun lebih kecil dibandingkan dengan pepton, kasein, dan ekstrak khamir. Hal ini dapat dijelaskan bahwa asam glutamat merupakan lintasan dalam pembentukan asam amino prolin melalui L-glutamil-γ-phosphate, glutamic- γ-semialdehyde (GSA), dan pyroline-5-carboxylate seperti yang disajikan dalam Gambar 24. Dengan demikian glutamat berperan dalam preursor pembentukan prolin.
Gambar 24 Biosintesis prolin melalui lintasan asam glutamat (http://www.hort.purdue.edu/rhodcv/hort640c/proline/pr00003.htm)
Selain berperan sebagai prekursor pembentukan prolin, asam glutamat juga berperan dalam pembentukan tirosin. Sebagai sumber nitrogen, glutamat berperan dalam proses transaminase pembentukan tirosin melalui p- hydroxyphenylpyruvate seperti yang disajikan dalam Gambar 25.
Gambar 25 Biosintesis tirosin melalui transaminase p-hydroxyphenylpyruvate
(http://en.wikibooks.org/wiki/Principles_of_Biochemistry/Synthesis_of_aminoacids).
Pepton juga menjadi sumber nitrogen terbaik pada produksi antibiotik oxytetracycline menggunakan isolat Streptomyces rimosus (Abou-Zeid et al. 1981) dan menjadi sumber nitrogen terbaik pada produksi antibiotik streptolydigin menggunakan isolat Streptomyces lydicus AS 4.2501. (Liangzhi et al. 2007).