3.1 Alat–alat
Alat-alat yang digunakan adalah neraca analitik (Boeco), mikroskop (Olympus), pH meter (Hanna), kamera digital, sonde tikus, spuit, kaca objek, kaca penutup, vial, jangka sorong, alat bedah, lumpang, stamfer dan alat-alat gelas lainnya. 3.2 Bahan–bahan
Bahan–bahan yang digunakan adalah natrium alginat 300 – 400 cps (Wako Pure Chemical Industries, Ltd Japan), akuades, gula pasir, nipagin (Merck), larutan formaldehid 10%, etanol 80%, etanol 70%, etanol 50%, parafin cair (Merck), xylol (Merck), xylena (Merck), larutan hematoksilin 0,2% (Merck), larutan eosin 1% (Merck), canada balsam (Entellan), Aspirin, Omeprazol (Mutifa).
3.3 Prosedur
3.3.1 Pembuatan sirup simpleks
Dikalibrasi gelas beker 100 ml, kemudian ditimbang 65 g gula pasir. Ditambahkan 30 ml akuades ke dalam gelas beker kemudian diaduk. Dipanaskan hingga larut dan berwarna jernih. Dicukupkan dengan akuades hingga 100 ml. 3.3.2 Pembuatan suspensi aspirin
R/ Aspirin 40%
CMC Na 0,5%
Akuades ad 100 ml
Dikalibrasi gelas beker 100 ml. Dipanaskan air sebanyak 20x dari berat CMC Na. Ke dalam lumpang yang berisi air panas, ditaburkan CMC Na, didiamkan hingga mengembang (Fase 1). Di lumpang lain, digerus aspirin, ditambahkan sedikit
demi sedikit akuades sambil digerus (Fase 2). Setelah itu dicampurkan Fase 1 ke dalam Fase 2, digerus hingga homogen, kemudian dicukupkan dengan akuades hingga 100 ml (Sianipar, 2015).
3.3.3 Pembuatan sirup alginat 1 %
R/ Natrium Alginat 1% (b/v)
Nipagin 0,025% (b/v)
Sirup Simpleks 20% (v/v)
Akuades ad 100 ml
Dikalibrasi gelas beker 100 ml, kemudian dilarutkan natrium alginat dalam sebagian akuades kemudian didiamkan selama 24 jam. Diaduk hingga homogen, lalu ditambahkan sirup simpleks. Setelah itu dilarutkan nipagin dengan menggunakan air panas, didinginkan lalu dicampurkan ke dalam sirup. Diaduk hingga homogen lalu tambahkan akuades hingga 100 ml (Fransiska, 2013). 3.3.4 Pembuatan suspensi omeprazol
R/ Omeprazol 0,018%
Nipagin 0,025%
Sirup Simpleks 25%
CMC Na 0,5%
Akuades ad 100 ml
Dikalibrasi gelas beker 100 ml. Dipanaskan air sebanyak 20x dari berat Na. CMC. Ke dalam lumpang yang berisi air panas, ditaburkan Na. CMC, didiamkan hingga mengembang (Fase 1). Di lumpang lain, digerus omeprazol, ditambahkan sedikit demi sedikit sirup simpleks sambil digerus (Fase 2). Setelah itu dilarutkan nipagin dengan menggunakan air panas, didinginkan lalu dicampurkan ke dalam Fase 2, kemudian ditambahkan Fase 1, digerus hingga homogen, kemudian dicukupkan dengan akuades hingga 100 ml (Sianipar, 2015).
R/ Natrium Alginat 1%
Nipagin 0,025%
Sirup Simpleks 25%
Omeprazol 0,018%
Akuades ad 100 ml
Dikalibrasi gelas beker 100 ml, kemudian dilarutkan natrium alginat dalam sebagian akuades kemudian didiamkan selama 24 jam. Diaduk hingga homogen (Fase 1). Di lumpang lain, digerus omeprazol, ditambahkan sedikit demi sedikit sirup simpleks sambil digerus (Fasa 2). Setelah itu dilarutkan nipagin dengan menggunakan air panas, didinginkan lalu dicampurkan ke dalam Fase 2, kemudian ditambahkan Fase 1, digerus hingga homogen, kemudian dicukupkan dengan akuades hingga 100 ml (Sianipar, 2015).
3.3.6 Hewan percobaan
Hewan yang digunakan adalah tikus jantan sehat dengan berat badan 150 - 200 g sebanyak 126 ekor dipelihara dalam kandang yang sesuai, diberi makanan dan minuman yang sesuai, diaklimatisasi selama 2 minggu sebelum diberi perlakuan. Sebelum perlakuan tikus dipuasakan selama 36 jam dengan tujuan mendapatkan lambung yang relatif bersih dari makanan. 3.3.7 Pembuatan ulkus pada tikus
Setelah tikus dipuasakan selama 36 jam, seluruh tikus diberikan aspirin 400 mg/kgBB untuk pembuatan ulkus lambung sebelum pengobatan dengan sirup alginat, suspensi omeprazol dan suspensi kombinasi alginat dengan omeprazol. Keadaan pada masing-masing tikus dianggap sebagai keadaan ulkus mula-mula.
3.3.8 Penyembuhan ulkus pada tikus
Pengelompokan dan jadwal pembedahan hewan penelitian tersaji dalam tabel 3.1 di bawah ini.
Tabel 3.1 Pengelompokan hewan dan jadwal pembedahan
Kelompok Sub-Kelompok Dosis Jumlah hewan Jadwal pembedahan Kontrol Negatif (Akuades) 1 1% 6 3 Hari 2 1% 6 7 Hari 3 1% 6 10 Hari 4 1% 6 14 Hari 5 1% 6 16 Hari Kontrol Positif (Sirup Alginat) 1 1% 6 3 Hari 2 1% 6 7 Hari 3 1% 6 10 Hari 4 1% 6 14 Hari 5 1% 6 16 Hari (Sediaan Uji) Suspensi Omeprazol 1 1% 6 3 Hari 2 1% 6 7 Hari 3 1% 6 10 Hari 4 1% 6 14 Hari 5 1% 6 16 Hari Sediaan Uji (Suspensi Kombinasi Alginat dengan Omeprazol 1 1% 6 3 Hari 2 1% 6 7 Hari 3 1% 6 10 Hari 4 1% 6 14 Hari 5 1% 6 16 Hari
Satu jam setelah pemberian aspirin, tikus dibagi atas kelompok masing-masing kelompok terdiri atas 6 ekor.
Kelompok 1 : Tikus diberikan 1% akuades. Kelompok 2 : Tikus diberikan 1% sirup alginat. Kelompok 3 : Tikus diberikan 1% suspensi omeprazol
Kelompok 4 : Tikus diberikan 1% suspensi kombinasi alginat dengan omeprazol. Tikus dibunuh pada hari ke-3, 7, 10, 14, dan 16 hari dan kemudian diambil lambungnya, dicuci dan diamati jumlah ulkus, panjang dan lebar ulkus (makroskopis). Panjang dan lebar tiap-tiap ulkus diukur dengan menggunakan jangka sorong (area ulkus) (mm2). Perhitungan indeks ulkus mengikuti metode yang dilakukan oleh Ganguly dan Bhatnagar (1973), diperoleh dari area ulkus (mm2) dibagi dengan luas mukosa lambung (mm2). Kemudian mukosa lambung direndam dalam larutan formalin 10% untuk diproses secara histologi dengan pewarnaan haematoxylin-eosin dan diamati secara mikroskopis menggunakan mikroskop cahaya dengan perbesaran 10 x 10 dan 10 x 40 (Manik, 2014).
3.3.9 Pembuatan preparat mikroskopik (histopatologi)
Pembuatan preparat histopatologi sampai siap untuk dilihat secara mikroskopik terdiri dari tahap-tahap sebagai berikut :
Spesimen dipotong sesuai dengan yang diinginkan setebal 1-2 mm. Difiksasi dengan menggunakan larutan formalin 10% minimal 6-7 jam.
Difiksasi kembali dengan menggunakan larutan formalin 10% 2 kali pengulangan, masing-masing selama 1 jam.
Dehidrasi dengan merendam spesimen ke dalam etanol 70%, 80%, dan 96% masing-masing selama 1 jam 30 menit. Tahap dehidrasi bertujuan
untuk mengeluarkan air dari jaringan yang telah difiksasi agar nantinya mudah dilakukan parafinisasi.
Penjernihan dengan merendam spesimen kedalam xylena 3 kali pengulangan, masing-masing selama 2 jam. Tahap penjernihan bertujuan untuk
mengeluarkan alkohol dari jaringan.
Embedding dengan menggunakan paraffin cair 56°C 2 kali pengulangan, masing-masing selama 2 jam.
Blocking pada cassete dan didinginkan pada suhu 4°C beberapa saat.
Spesimen dipotong dengan menggunakan mikrotom (Leica) setebal 2 - 3 µm kemudian dimasukkan di atas kaca objek yang telah diolesi gliserin.
Dilakukan deparafinisasi dengan menggunakan xylol 3 kali pengulangan, masing-masing selama 15 menit.
Direhidrasi dengan menggunakan alkohol 96%, 80%, dan 50% masing- masing selama 15 menit.
Dibersihkan dengan menggunakan air mengalir kemudian diwarnai dengan pewarnaan haematoxyline-eosin (rendam ke dalam zat warna Haematoxyline mayers selama 5 menit kemudian cuci dengan air mengalir, setelah itu direndam ke dalam larutan eosin 1% selama 1 menit).
Dehidrasi dengan etanol 80%, 96%, dan absolut masing-masing 1 menit lalu dikeringkan.
Direndam dalam larutan xilene selama 1 menit, kemudian ditutup dengan kaca objek yang telah diberi Canada balsam (Entellan®)
BAB IV