ABSTRACT
THE ISOLATION AND IDENTIFICATION OF CIPROFLOXACIN RESISTANCE GENES ON ISOLATESCHERICHIA COLIMULTI-DRUGS RESISTANCE
OF URINARY TRACT INFECTIONS PATIENT IN REGIONAL PUBLIC HOSPITAL ABDOEL MOELOEK LAMPUNG PROVINCE
By
BASUKI RACHMAD
The increasing of Escherichia coliresistance to fluoroquinolone antibiotics has been widely reported around the world. A total of 30E.coli isolates from patients with UTI in RSUDAM Lampung Province, was found 18 isolates ofE.coliMDR have plasmid and 73.3% were resistant to ciprofloxacin. E.coli resistance to the antibiotic fluoroquinolone (eg ciprofloxacin) is generally caused by chromosomal mutations in genes gyrA and parc, and gene plasmid. This study aims to determine the presence of ciprofloxacin resistance gene, both contained in plasmid DNA (plasmid mediated quinolone resistance) is qnr, oqxA and oqxB and the chromosomal DNA (quinolone Resistance Determining Regions) is gyrA and parC. Isolation of plasmid and chromosomal DNA of the 18 isolates was performed using each kit accordingly. The existence of genes in the isolates were detected by PCR using Thermal Cycler T100TM. Electrophoresis in 1% agarose gel of amplicons using BIO-RADTM PowerPac. Visualization of amplicons with BIO-RADTM UVITEC produce DNA gene fragments qnr at 593 bp (1 isolate), oqxA (866 bp, 2 isolates), oqxB (781 bp, 2 isolates), gyrA (191 bp, 18 isolates) and parC (264 bp, 18 isolates). From these data can be proposed that resistance to ciprofloxacin allegedly caused by the presence of ciprofloxacin resistance gene, both of which are located in the plasmid and chromosome. DNA sequencing is recommended to determine the sequence of bases on the tape produced so that the pattern of mutations in these genes are associated with MDR can be solved.
ABSTRAK
ISOLASI DAN IDENTIFIKASI GEN RESISTENSI CIPROFLOXACIN PADA ISOLATESCHERICHIA COLI MULTIDRUGS RESISTANCE
DARI PENDERITA INFEKSI SALURAN KEMIH DI RSUD ABDOEL MOELOEK PROVINSI LAMPUNG
Oleh
BASUKI RACHMAD
Peningkatan resistensi Escherichia coli terhadap antibiotik fluorokuinolon telah banyak dilaporkan di seluruh dunia. Sebanyak 30 isolat E.coli dari pasien ISK di RSUDAM Provinsi Lampung, ditemukan 18 isolat E.coli MDR mempunyai plasmid dan 73,3% resisten terhadap ciprofloxacin. Resistensi E.coli terhadap antibiotik fluorokuinolon (misal ciprofloxacin) umumnya disebabkan mutasi kromosom pada gen gyrA dan parC, dan adanya gen plasmid. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui keberadaan gen resistensi ciprofloxacin, baik yang terdapat pada DNA plasmid (Plasmid Mediated Quinolone Resistance) yaitu qnr, oqxA dan oqxB maupun pada DNA kromosom (Quinolone Resistance Determining Regions) yaitu gyrA dan parC. Isolasi DNA plasmid dan kromosom dilakukan terhadap 18 isolat tadi menggunakan masing-masing kit yang sesuai. Keberadaan gen di dalam isolat dideteksi secara PCR menggunakan T100TMThermal Cycler. Elektroforesis di dalam gel agarosa 1% dari amplikon menggunakan BIO-RADTM PowerPac. Visualisasi amplikon dengan BIO-RADTM UVITEC menghasilkan pita DNA fragmen gen qnr pada 593 bp (1 isolat), oqxA (866 bp, 2 isolat), oqxB (781 bp, 2 isolat), gyrA (191 bp, 18 isolat) dan parC (264 bp, 18 isolat). Dari data tersebut dapat diusulkan bahwa resistensi terhadap ciprofloxacin diduga kuat disebabkan oleh adanya gen resistensi ciprofloxacin, baik yang berlokasi di plasmid maupun kromosom. Sekuensing DNA disarankan untuk menentukan urutan basa-basa pada pita yang dihasilkan sehingga pola mutasi pada gen-gen tersebut yang berkaitan dengan MDR dapat dipecahkan.
ISOLASI DAN IDENTIFIKASI GEN RESISTENSI CIPROFLOXACIN PADA ISOLATESCHERICHIA COLI MULTIDRUGS RESISTANCE
DARI PENDERITA INFEKSI SALURAN KEMIH DI RSUD ABDOEL MOELOEK PROVINSI LAMPUNG
(TESIS)
Oleh
BASUKI RACHMAD
PROGRAM PASCASARJANA MAGISTER KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS LAMPUNG
ISOLASI DAN IDENTIFIKASI GEN RESISTENSI CIPROFLOXACIN PADA ISOLATESCHERICHIA COLI MULTIDRUGS RESISTANCE
DARI PENDERITA MOELOEK PROVINSI LAMPUNG
Oleh
BASUKI RACHMAD
Tesis
Sebagai Salah Satu Syarat untuk Mencapai Gelar MAGISTER KIMIA
Pada
Program Pascasarjana Magister Kimia
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung
PROGRAM PASCASARJANA MAGISTER KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS LAMPUNG
ABSTRACT
THE ISOLATION AND IDENTIFICATION OF CIPROFLOXACIN RESISTANCE GENES ON ISOLATESCHERICHIA COLIMULTI-DRUGS RESISTANCE
OF URINARY TRACT INFECTIONS PATIENT IN REGIONAL PUBLIC HOSPITAL ABDOEL MOELOEK LAMPUNG PROVINCE
By
BASUKI RACHMAD
The increasing of Escherichia coliresistance to fluoroquinolone antibiotics has been widely reported around the world. A total of 30E.coli isolates from patients with UTI in RSUDAM Lampung Province, was found 18 isolates ofE.coliMDR have plasmid and 73.3% were resistant to ciprofloxacin. E.coli resistance to the antibiotic fluoroquinolone (eg ciprofloxacin) is generally caused by chromosomal mutations in genes gyrA and parc, and gene plasmid. This study aims to determine the presence of ciprofloxacin resistance gene, both contained in plasmid DNA (plasmid mediated quinolone resistance) is qnr, oqxA and oqxB and the chromosomal DNA (quinolone Resistance Determining Regions) is gyrA and parC. Isolation of plasmid and chromosomal DNA of the 18 isolates was performed using each kit accordingly. The existence of genes in the isolates were detected by PCR using Thermal Cycler T100TM. Electrophoresis in 1% agarose gel of amplicons using BIO-RADTM PowerPac. Visualization of amplicons with BIO-RADTM UVITEC produce DNA gene fragments qnr at 593 bp (1 isolate), oqxA (866 bp, 2 isolates), oqxB (781 bp, 2 isolates), gyrA (191 bp, 18 isolates) and parC (264 bp, 18 isolates). From these data can be proposed that resistance to ciprofloxacin allegedly caused by the presence of ciprofloxacin resistance gene, both of which are located in the plasmid and chromosome. DNA sequencing is recommended to determine the sequence of bases on the tape produced so that the pattern of mutations in these genes are associated with MDR can be solved.
ABSTRAK
ISOLASI DAN IDENTIFIKASI GEN RESISTENSI CIPROFLOXACIN PADA ISOLATESCHERICHIA COLI MULTIDRUGS RESISTANCE
DARI PENDERITA INFEKSI SALURAN KEMIH DI RSUD ABDOEL MOELOEK PROVINSI LAMPUNG
Oleh
BASUKI RACHMAD
Peningkatan resistensi Escherichia coli terhadap antibiotik fluorokuinolon telah banyak dilaporkan di seluruh dunia. Sebanyak 30 isolat E.coli dari pasien ISK di RSUDAM Provinsi Lampung, ditemukan 18 isolat E.coli MDR mempunyai plasmid dan 73,3% resisten terhadap ciprofloxacin. Resistensi E.coli terhadap antibiotik fluorokuinolon (misal ciprofloxacin) umumnya disebabkan mutasi kromosom pada gen gyrA dan parC, dan adanya gen plasmid. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui keberadaan gen resistensi ciprofloxacin, baik yang terdapat pada DNA plasmid (Plasmid Mediated Quinolone Resistance) yaitu qnr, oqxA dan oqxB maupun pada DNA kromosom (Quinolone Resistance Determining Regions) yaitu gyrA dan parC. Isolasi DNA plasmid dan kromosom dilakukan terhadap 18 isolat tadi menggunakan masing-masing kit yang sesuai. Keberadaan gen di dalam isolat dideteksi secara PCR menggunakan T100TMThermal Cycler. Elektroforesis di dalam gel agarosa 1% dari amplikon menggunakan BIO-RADTM PowerPac. Visualisasi amplikon dengan BIO-RADTM UVITEC menghasilkan pita DNA fragmen gen qnr pada 593 bp (1 isolat), oqxA (866 bp, 2 isolat), oqxB (781 bp, 2 isolat), gyrA (191 bp, 18 isolat) dan parC (264 bp, 18 isolat). Dari data tersebut dapat diusulkan bahwa resistensi terhadap ciprofloxacin diduga kuat disebabkan oleh adanya gen resistensi ciprofloxacin, baik yang berlokasi di plasmid maupun kromosom. Sekuensing DNA disarankan untuk menentukan urutan basa-basa pada pita yang dihasilkan sehingga pola mutasi pada gen-gen tersebut yang berkaitan dengan MDR dapat dipecahkan.
Judul Tesis : ISOLASI DAN IDENTIFIKASI GEN
Fakultas : Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
MENYETUJUI
DR. Eng. Suripto Dwi Yuwono, S.Si, M.T NIP 19740705 20003 1 001
Ketua Program Pascasarjana Kimia
MENGESAHKAN
1. Tim Penguji
Ketua : Mulyono, S.Si, M.Si, Ph.D ____________
Sekretaris : Drs. Andi Setiawan, M.Sc, Ph.D ____________
Anggota : Prof. Dr. Ir. Yandri AS., M.S ____________
2. Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Prof. Suharso, S.Si, M.Sc, Ph.D NIP196905301995121001
3. Direktur Program Pascasarjana
Prof. Dr. Sudjarwo, M.S NIP. 195305281981031002
PERNYATAAN
Dengan ini saya menyatakan dengan sebenarnya bahwa :
1. Tesis dengan judul “ISOLASI DAN IDENTIFIKASI GEN RESISTENSI CIPROFLOXACIN PADA ISOLAT ESCHERICHIA COLI MULTIDRUGS RESISTANCE DARI PENDERITA INFEKSI SALURAN KEMIH DI RSUD ABDOEL MOELOEK PROVINSI LAMPUNG” adalah karya saya sendiri dan saya tidak melakukan penjiplakan atas karya penulis lain dengan cara yang tidak sesuai dengan tata etika ilmiah yang berlaku dalam masyarakat akademik atau yang disebut plagiatisme.
2. Hak intelektual atas karya ilmiah ini diserahkan kepada Universitas Lampung.
Atas pernyataan ini, apabila dikemudian hari ternyata ditemukan adanya ketidakbenaran, saya bersedia menanggung akibat dan sanksi yang diberikan kepada saya; saya bersedia dan sanggup dituntut sesuai dengan hukum yang berlaku.
Bandar Lampung, Januari 2017 Pembuat Pernyataan
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Surabaya Jawa Timur pada tanggal 09 Februari 1972, sebagai anak ke-5 dari 7 bersaudara, dari Bapak Soebandi (alm) dan Ibu Soekasih (Almh). Menikah tahun 2001 dengan Helda dan dikaruniai 3 anak, yaitu Zahra Rabi’ulawali Ibnu Balda (putri), Zaki Taufiqurrohman Ibnu Balda (putra) dan Zahwa Lathifah Ibnu Balda (putri)..
Pendidikan Taman Kanak-kanak (TK) Usaha Tama Kelurahan Gundih Kecamatan Bubutan Kotamadya Surabaya diselesaikan tahun 1977, Sekolah Dasar (SD) diselesaikan di SDN Bubutan X/72 pada tahun 1984, Sekolah Lanjutan Tingkat Pertama (SLTP) diselesaikan di SMPN Prosernal-Prokimal Kotabumi Lampung Utara pada tahun 1987, dan Sekolah Menengah Kejuruan diselesaikan di SMAK (Sekolah Menengah Analis Kesehatan) Depkes Tanjungkarang Bandarlampung pada tahun 1991. Setelah itu pada tahun 1992 penulis diangkat sebagai PNS di RSUD Kotabumi Lampung Utara.
mahasiswa Tugas Belajar dari BPPSDM Kemenkes di Program DIV Politeknik Kesehatan Bandung Jurusan Analis Kesehatan dan lulus tahun 2012.
SANWACANA
Alhamdulillahirobbilalamin segala puji hanya milik Allah SWT, Tuhan semesta alam pemilik kerajaan langit dan bumi atas nikmat Iman dan Islam serta kasih sayang-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan studi S2 ini. Shalawat dan salam senantiasa penulis haturkan kepada junjungan Nabi Besar Muhammad SAW beserta keluarga dan sahabatnya, semoga diYaummil Akhir nanti mendapat syafaat dan diakui sebagai umatnya,Aamiin.
Tesis dengan judul “Isolasi dan Identifikasi Gen Resistensi Ciprofloxacin pada Isolat Escherichia coli dari Penderita Infeksi Saluran Kemih di RSUD Abdoel Moeloek Provinsi Lampung” adalah salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Kimia di Universitas Lampung.
Dalam kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada :
1. Bapak Mulyono, S.Si, M.Si, Ph.D selaku Pembimbing I, Pembimbing Akademik sekaligus Sekretaris Jurusan Kimia atas bimbingannya kepada penulis selama ini,jazaakumullah khaiiran katsiran.
2. Bapak Drs. Andi Setiawan, M.Sc, PhD selaku Pembimbing II atas bimbingannya kepada penulis selama ini,jazaakumullah khaiiran katsiran 3. Bapak Prof Dr. Ir Yandri AS., M.S selaku Pembahas / Penguji Non
4. Bapak Dr.Eng. Suripto Dwi Yuwono, S.Si, M.T. selaku Ketua Jurusan Kimia FMIPA Unila,jazaakumullah khaiiran katsiran.
5. Bapak Prof. Suharso, Ph.D selaku dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung.
6. Bapak Dr. Rudy T.M. Situmeang, M.Sc. Selaku selaku Ketua Program Studi Pascasarjana Magister Kimia.
7. Bapak dan Ibu Dosen Program Pascasarjana Magister Kimia Jurusan Kimia FMIPA Unila atas seluruh dedikasi dan ilmu yang diberikan selama penulis menempuh studi,jazaakumullah khaiiran katsiran
8. Syukur dan doa penulis untuk almarhum dan almarhumah kedua orang tuaku Bapak Soebandi dan Ibu Soekasih yang sepanjang hayatnya telah membesarkan dan mendidikku sehingga bisa jadi seperti sekarang ini. Semoga Allah SWT membalas cinta dan kasih sayangnya dengan jannah-Nya,aamiin allahuma aamiin.
9. Isriku tercinta, Helda dan ke-3 buah hati kamiZahra Rabi’ulawali Ibnu Balda, Zaki Taufiqurrohman Ibnu Balda dan Zahwa Lathifah Ibnu Balda sebagai inspirator dan motivator dalam membangun keluarga samawa.
10. Keluarga besarku Mbak Endang, Mas Hadi, Mas Slamet, Mas Agus, Dek Siti dan Dek Nunuk, terima kasih telah mendoakanku menjadi adik / kakak yang baik dan dapat dibanggakan untuk keluarga Soebandi (alm).
12. Kawan-kawan Magister Kimia Unila Angkatan 2014, terutama Buk Rahmawaty untuk persaudaraannya yang tulus dan ikhlas, jazaakumullah khaiiran katsiran.
13. Rekan-rekan kerja di Laboratorium RSUD Mayjen HM Ryacudu Kotabumi atas pengertian dan kebijaksanaannya selama penulis menempuh study S2 ini. 14. Adinda Arif selaku mahasiswa S1 Kimia Unila Angkatan 2012, Bapak dan Ibu Staf Administrasi Jurusan Kimia FMIPA Unila, terima kasih atas bantuannya dalam melengkapi persyaratan seminar hasil dan ujian komprehensif tesis untuk dapat menuju wisuda.
15. Terakhir yang tak kalah penting untuk Buk Dwi Handayani selaku dosen di Bagian Parasitologi FK Unsri dan Buk Meisya selaku Pranata Laboratorium Pendidikan di Laboratorium Biomolekuler FK Unsri, terima kasih sebesar-besarnya telah membimbingku di dalam kerja penelitian.
Bandar Lampung, Januari 2017
Dengan nama Allah yang Maha
Pengasih, Maha Penyayang
Demi masa
Sungguh, manusia berada dalam
kerugian,
kecuali orang-orang yang beriman dan
mengerjakan kebajikan serta saling
menasihati untuk kebenaran dan saling
menasihati untuk kesabaran .
Persembahanku....
Dengan mengucap Alhamdulillahirabbil alamin
Ku dedikasikan amal jariyah dari karya kecilku ini untuk Kedua Orang Tuaku (Alm dan Almh) dan Kedua Mertuaku Abak dan Oneh, yang telah memberikan kasih sayang dan doa restunya dalam mengarungi samudera
kehidupan yang fana ini
Istriku Helda tercinta, pendamping setia dan motivator paling hebat dalam hidupku
Ketiga anakku Zahra Rabi ulawali Ibnu Balda, Zaki Taufiqurrohman Ibnu Balda dan Zahwa Lathifa Ibnu Baldah,
DAFTAR ISI
A. Infeksi Saluran Kemih (ISK) ... 6
1. Definisi ... 6
2. Penyebab ISK ... 7
3. Gejala Klinis ... 8
B. Bakteri Gram NegatifEscherichia coli... 8
1. Bakteri ... 9
2. Identifikasi Bakteri Gram Negatif ... 10
3. Escherichia coli ... 12
C. Antibiotika Golongan Fluorokuinolon ... 14
1. Ciprofloxacin ... 16
2. Mekanisame Kerja Fluorokuinolon ... 17
3. Mekanisme Resistensi Florokuinolon ... 19
D. Gen-gen Plasmid ... 24
E. Gen-Gen Kromosom ... 26
F. Polymerase Chain Reaction(PCR) ... 33
1. Tiga Tahap Proses Penggandaan DNA ... 34
2. Prinsip Kerja Mesin PCR ... 36
III. METODOLOGI PENELITIAN... 40
A. Tempat dan Waktu Penelitian ... 40
B. Alat dan Bahan ... 40
C. Prosedur Penelitian ... 42
1. Persiapan Isolasi Plasmid ... 42
2. Isolasi DNA Plasmid IsolatE.coli ... 42
3. Isolasi DNA Kromosom IsolatE.coli... 46
4. Uji PCR ... 51
5. Elektroforesis ... 53
6. Visualisasi Hasil PCR ... 55
D. Analisis Hasil ... 55
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN... 57
A. Isolat pada Media LB Broth .... ... 57
B. Isolat DNA Plasmid... 58
C. Isolat DNA Kromosom ... 62
D. Isolasi Fragmen Gen PMQR ... 64
1. Fragmen Gen qnr ... 64
2. Fragmen Gen oqxAB (oqxA dan oqxB) ... 66
E. Isolasi Fragmen Gen QRDR di dalam Kromosom ... 71
1. Fragmen Gen parC ... 71
2. Fragmen Gen gyrA ... 71
V. SIMPULAN DAN SARAN... 76
A. Simpulan ... 76
B. Saran ... 76
DAFTAR PUSTAKA ... 78
DAFTAR TABEL
Tabel Halaman
1. Spektrum antibiotika kuinolon atau fluorokuinolon dari setiap generasi ... 17
2. Mutasi akibat resistensi kuinolon di dalam gen gyrA dari
E.coliKL16 ... 29 3. Mutasi di dalam gen gyrA dan parC ... 30 4. Substitusi asam amino di dalamQRDRisolatE.coliresisten
fluorokuinolon ... 31 5. Hubungan nilai MIC ciprofloxacin dengan substitusi asam amino
yang menyebabkan mutasi di dalam gen gyrA dan parC ... 33 6. Hubungan jumlah antibiotik yang digunakan dengan keberadaan gen
DAFTAR GAMBAR
Gambar Halaman
1. Saluran kemih atas dan bawah ... 6
2. Struktur sel prokariotE.coli... 10
3. Pewarnaan Gram pada kumanEscherichia coli.... 13
4. KoloniEscherichia coliyang tumbuh di dalam media differensialMac Conceyagar ... 14
5. Perbaikan farmakologi pada cincin kuinolon dasar dengan penambahan fluorin di posisi C6 dan piperazynil atau cincin terikat pada posisi C7 menghasilkan fluorokuinolon ... 16
6. Mekanisme kerja fluorokuinolon ... 18
7. Distribusi isolat klinisE. Coli... 24
8. Struktur dari pompa efflux OqxAB sebagai pompa efflux RND ... 26
9. Dua bentuk superkoil DNA ... 26
10. Dimer gyrase A dari heterotetramer DNA gyrase ... 28
11. Prinsip kerjaPolymerase Chain Reaction... 35
12. Diagram sederhana mesin PCR konvensional ... 37
13. Ilustrasi pembacaan pada mesin real-time PCR ... 39
14. Skema isolasi DNA plasmid ... 46
15. Skema isolasi DNA kromosom ... 50
16. Diagram alir penelitian ... 56
17. Pertumbuhan kuman di dalam media LB Broth ... 57
18. Gambar ilustrasi hasil isolasi DNA plasmid ... 58
19. Foto hasil isolasi DNA plasmid ... 58
20. Gambar ilustrasi hasil isolasi DNA kromosom ... 62
21. Foto hasil isolasi DNA kromosom ... 62
22. Visualisasi hasil PCR fragmen gen qnr ... 65
23. Visualisasi hasil PCR fragmen gen oqxA ... 67
24. Visualisasi hasil PCR fragmen gen oqxB ... 68
I. PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Escherichia coli merupakan bakteri flora normal usus, Gram-negatif dan berbentuk batang. Strain tertentu dari E.colidapat menyebabkan infeksi usus atau di luar usus pada manusia atau hewan tertentu (Hopkin et al., 2005). E.coli juga dapat menyebabkan infeksi saluran kemih (ISK) yang merupakan penyebab utama infeksi nosokomial di rumah sakit (Karlowskyet al.,2002).
pengobatan (Karczmarczyk et al., 2011; Gagliotti et al., 2008; Hopkins et al., 2005).
Resistensi E.coli terhadap antibiotik florokuinolon umumnya disebabkan mutasi kromosom pada gen gyr A dan par C (Pereira et al.,2007; Karczmarczyk et al.,2011; Liuet al.,2012). Tetapi baru-baru ini penelitian menunjukkan bahwa resistensi tingkat rendah dapat juga dimediasi oleh plasmid, melalui akuisisi gen qnr yang diperantarai oleh plasmid pMG252 (Pereira et al., 2007). Plasmid didefinisikan sebagai molekul DNA sirkular, beruntai ganda (double-stranded), terletak di luar kromosom (ekstra-kromosomal) dan mampu bereplikasi otonom serta memiliki peran penting dalam penyebaran gen resistensi seperti extended-spectrum beta-laktamase (ESBL) dan gen PMQR. Penemuan resistensi di Enterobacteriaceae ini telah dilaporkan di seluruh dunia dan mengkhawatirkan karena gen ESBL menyebabkan resisten terhadap generasi ketiga cefalosporins, sedangkan PMQR menyebabkan resistensi tingkat rendah fluorokuinolon. Padahal antibiotika ini berada di baris pertama pilihan untuk beberapa penyakit menular , misalnya ISK dan pneumonia (Kocsis, 2012). Saputri (2015) mengatakan bahwa analisis plasmid dapat digunakan sebagai sarana memberikan informasi tambahan dalam mendeteksi dan mengevaluasi penyebaranmultidrug resistance(MDR)
(n=32) isolat E.col resisten ciprofloxacin diantara 155 isolat klinik E.coli di Pakistan. Mandalet al(2012) menemukan 73,04% (n=1951) isolatE.col resisten ciprofloxacin diantara 2671 isolat positif E.coli dari pasien ISK di India. Thiraviamet al(2014) menemukan masing-masing 16,1% dan 13,3% isolatE.coli resisten ciprofloxacin dari pasien DM dan non-DM diantara 50 isolat positifE.coli dari pasien ISK di Ethiopia. Manikandan et al (2014) melaporkan sebanyak 31,0% (n=110) isolatE.coliresisten ciprofloxacin diantara 355 isolat positifE.coli dari pasien ISK di Tamil Nadu– India. Setahun kemudian Gururaju et al(2015), menemukan 46% (n=130) isolat E.coli resisten ciprofloxacin diantara 278 isolat positif E.coli dari pasien ISK di India. Reis et al (2016) melaporkan sebanyak 22,4% isolat E.coli resisten ciprofloxacin diantara 1089 isolat positif E.coli dari pasien ISK di Brazil.
Sementara di Indonesia, Samirah dkk., (2006) menemukan 48% isolat E.coli resisten ciprofloxacin diantara 39 isolat positif E.coli dari pasien ISK di Makassar. Endriani dkk (2010) melaporkan sebanyak 45,45% isolatE.coliresisten ciprofloxacin diantara 14 isolat positif E.coli dari pasien ISK di Pekanbaru. Prabowo dkk (2012) menemukan 55,56% isolat E.coli resisten ciprofloxacin diantara 18 isolat positifE.colipada pasien ISK di Yogyakarta. Syafada dan Fenty (2013) menemukan sebanyak 55,4% (n=31) isolat bakteri Gram-negatif resisten ciprofloxacin (paling banyak E.coli) diantara 56 isolat positif bakteri Gram-negatif penyebab ISK di Yogyakarta.
kepekaan antibiotik terhadap 30 isolat E.coli menemukan sebanyak 73,3% E.coli resisten ciprofloxacin, selanjutnya isolasi plasmid dari isolat tersebut menemukan sebagian besar isolat (n=18) mempunyai plasmid dan pola resisten MDR (multidrugs resistance) terhadap ≥ 2 (dua) antibiotika. Berdasarkan hasil penelitian Saputri dkk (2015) tersebut disimpulkan bahwa ada korelasi antara pola resistensi MDR antibiotik dengan adanya profil plasmid E.coli. Meskipun demikian identifikasi gen resistensi ciprofloxacin yang diperantarai oleh plasmid dari isolatE.coliMDR tersebut belum diteliti lebih lanjut.
Berdasarkan uraian latar belakang di atas, maka penulis melakukan penelitian lanjutan ini untuk mengidentifikasi adanya gen resistensi ciprofloxacin yakni gen PMQR (plasmid-mediated quinolone resistance) yang diperantarai oleh plasmid dan gen QRDR (quinolone resistance determining regions) di dalam isolat E.coli MDR yang diisolasi dari penderita ISK di RSUDAM Provinsi Lampung.
B. Tujuan Penelitian 1) Tujuan Umum
Mengetahui adanya gen resistensi ciprofloxacin di dalam isolatE.coliMDR.
2) Tujuan Khusus
a) Mengetahui keberadaan fragmen gen PMQR yang terletak di dalam plasmid pada isolatE.coliMDR.
C. Manfaat Penelitian 1) Manfaat Teoritis
Memberikan wawasan keilmuan mengenai keberadaan gen resisten ciprofloxacin yakni gen PMQR (gen resisten yang diperantarai oleh plasmid) dan gen QRDR (gen resisten yang terletak di dalam kromosom) pada isolat E.coliMDR.
2) Manfaat Praktis
II. TINJAUAN PUSTAKA
A. Infeksi Saluran Kemih (ISK)
Saluran kemih adalah sistem tubuh untuk menghilangkan limbah dan kelebihan air (NIH, 2014). Terdiri dari kandung kemih, ginjal, ureter dan uretra. Ginjal menyaring darah dan membuang sampah dan kelebihan air untuk membentuk urin, yang kemudian bergerak ke bawah ureter dan disimpan di dalam kandung kemih sampai siap untuk melewati uretra (buang air kecil). Saluran kemih dapat dibagi ke dalam saluran kemih bagian atas dan saluran kemih bagian bawah. Saluran kemih bagian atas terdiri dari ginjal dan ureter, dan saluran kemih bagian bawah terdiri dari kandung kemih dan uretra.
Infeksi saluran kemih dapat memiliki nama yang berbeda mengacu pada tempat yang terinfeksi dari saluran kemih (NIH, 2014) :
a) Infeksi kandung kemih =Cystitis. b) Infeksi saluran kencing =Urethritis. c) Infeksi ginjal =Pyelonephritis.
d) Ureter sangat jarang sebagai tempat infeksi.
1. Definisi
Infeksi ini merupakan infeksi urutan ke-2 yang paling umum dijumpai dalam tubuh dan diperkirakan ada sekitar 8,1 juta pasien berobat setiap tahunnya (NIH, 2014). Lebih dari 50% wanita akan mengalami setidaknya sekali ISK selama hidupnya, dengan 20-30% mengalami ISK berulang (Wang et al., 2015). Wanita lebih berisiko terkena ISK daripada laki-laki, karena perbedaan anatomi uretra wanita lebih pendek dibandingkan pria, dan lebih dekat dengan anus, sehingga memungkinkan bakteri ditransfer ke kandung kemih (Penunjukan Gambar 1).
Meskipun kebanyakan ISK tidak berbahaya, tetapi beberapa dapat menyebabkan masalah serius, terutama untuk ISK bagian atas, berulang atau infeksi ginjal kronis, dapat menyebabkan kerusakan permanen; dan beberapa infeksi ginjal akut dapat mengancam jiwa, terutama jika terjadi septikemia. Infeksi ini juga dapat meningkatkan risiko wanita yang melahirkan bayi dengan berat badan lahir rendah atau bayi prematur (Mayo Clinic, 2014).
2. Penyebab ISK
Kebanyakan ISK disebabkan oleh bakteri yang hidup dalam usus. Bakteri Escherichia coli menyebabkan sebagian besar ISK. Chlamydia dan Mycoplasma dapat menular lewat hubungan seksual dan menginfeksi uretra dan sistem reproduksi tetapi tidak kandung kemih (NIH, 2014). Dalam kebanyakan kasus, bakteri dari usus masuk ke saluran kemih melalui uretra. Hal ini dapat terjadi ketika menyeka bawah atau berhubungan seks, misalnya, tetapi sering tidak jelas mengapa hal itu terjadi. Berikut ini dapat meningkatkan risiko terkena ISK (NIH, 2014; MedlinePlus, 2014; Mayo Clinic, 2014) :
a) Hubungan seksual yang sering dan intens dengan lebih dari satu pasangan seks. b) Diabetes.
c) Kebersihan pribadi yang buruk
d) Kondisi yang menghambat saluran kemih, seperti batu ginjal. e) Kesulitan mengosongkan kandung kemih sepenuhnya. f) Kateterisasi kemih.
g) Inkontinensia usus.
h) Menggunakan kontrasepsi atau kondom berlapisi bahan spermisida. i) Menopause
j) Sistem kekebalan tubuh yang lemah, misalnya sehabis dari kemoterapi atau HIV.
k) Pembesaran kelenjar prostat.
3. Gejala Klinis
Gejala infeksi saluran kemih tergantung dari usia, jenis kelamin, adanya kateter dan bagian mana dari saluran kemih yang terinfeksi. Gejala umum dari infeksi saluran kemih meliputi (NIH, 2014; MedlinePlus, 2014; Mayo Clinic, 2014) :
a) Sering BAK.
b) Urin berwarna keruh, berdarah dan berbau busuk. c) Rasa nyeri atau seperti terbakar saat BAK.
d) Mual dan muntah
e) Nyeri otot dan nyeri perut.
f) Pada pasien dengan kateterisasi mungkin hanya mengalami gejala demam sehingga sering menyulitkan diagnosis.
g) Pielonefritis akut : jika seseorang memiliki infeksi ginjal, mereka juga bisa mengalami nyeri punggung bagian sisi dan atas, demam tinggi, gemetar, menggigil, kelelahan dan perubahan mental.
h) Sistitis : jika seseorang memiliki infeksi kandung kemih, mereka juga bisa mengalami demam dan tekanan / kram di perut dan punggung bawah.
B. Bakteri Gram NegatifEscherichia coli
kandung empedu, saluran kemih, selaput otak, paru dan saluran cerna (Madappa et al.,2016).
1. Bakteri
Bakteri adalah organisme prokariot, tidak ada pembagian ruang (inti dan sitoplasma) sehingga tidak memiliki membran inti, mitokondria, retikulum endoplasma, badan Golgi, fagosom dan lisosom. Prokariot memiliki kromosom tunggal sirkuler yang terikat pada tempat khusus di membran yang disebut mesosom. Prokariot adalah organisme unisel yang relatif simpel bila dibanding eukariot. Seluruh fungsi seluler dikemas dalam satu unit dengan 5 (lima) komponen penting yaitu : genom (DNA), ribosom, membran sel, dinding sel dan lapisan permukaan (surface layer). Semua reaksi enzimatik atau aktivitas metabolism apapun dan keragaman spesies berhubungan dengan makromolekul penyusun kelima komponen tersebut seperti DNA, RNA, fosfolipid, protein dan polisakarida (Juwono, 2012).
2. Identifikasi Bakteri Gram Negatif
Kriteria yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri secara mikroskopis didasarkan pada bentuk, ukuran, kelompok, motilitas dan reaksi pengecatan Gram. Observasi mikroskopik dikombinasi dengan data natural environment sangat penting untuk mengidentifikasi bakteri. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology merupakan panduan untuk mengidentifikasi bakteri berdasarkan karakter mikroskopik dan fisiologik. Identifikasi dengan tes biokimia digunakan untuk membedakan genus dari famili dan spesies dari genus. Galur (strain) dalam single species dibedakan dengan cara genetik atau imunologik. Seseorang yang dicurigai terinfeksi bakteri dapat diambil spesimen kliniknya untuk dibiakkan dan disolasi serta diidentifikasi berdasarkan prinsip taksonomi. Tes harus mudah dilakukan, biaya rendah dan hasilnya cepat. Metode klasik diagnostik didasarkan atas ciri morfologi dan metabolisme sedangkan saat ini
telah lazim digunakan teknik biologi molekuler. Taksonomi modern merupakan metode yang kompleks mencakup analisa molekuler dan kimiawi (Juwono, 2012). Berdasarkan pewarnaan Gram, bakteri dibedakan menjadi 2 yaitu Gram positif dan negatif. Prosedur pewarnaan Gram dimulai dengan pemberian pewarna basa, kristal violet. Larutan iodin kemudian ditambahkan; semua bakteri akan terwarnai biru pada fase ini. Sediaan kemudian diberi alkohol. Sel Gram positif akan tetap mengikat senyawa kristal violet-iodine sehingga bewarna biru, sedangkan Gram negatif akan hilang warnanya oleh alkohol. Sebagai langkah terakhir, counterstain (misalnya safranin yang berwarna merah) ditambahkan sehingga sel Gram negatif yang tidak berwarna akan mengambil warna kontras; sedangkan sel Gram positif terlihat dalam warna biru keunguan (Brooks et al., 2004). Perbedaan ini terjadi karena perbedaan susunan peptidoglikan pada struktur dinding selnya.
lipopolisakarida (Brooks et al., 2004). Terdapat ruang antara membran dalam dengan membran luar yang disebut ruang periplasma, terdiri dari lapisan murein dan larutan protein mirip gel (protein pengikat substrat tertentu, enzim hidrolitik, dan enzim detoksifikasi (Goeringet al.,2005).
Lipopolisakarida (LPS) dari dinding selnya terdiri dari lipid kompleks yang disebut lipid A, tempat melekatnya polisakarida dan antigen O. Lipopolisakarida terikat pada membran luar dengan ikatan hidrofobik dan disintesis pada membran sitoplasma serta berfungsi sebagai antigen dan toxin (Goering et al., 2005). Komponen lipidnya terdiri dari diglyseride thioether yang terikat pada sistein terminal (Brooks et al., 2004). Selain itu, terdapat saluran khusus terbuat dari protein yang disebutporinsyang berfungsi sebagai tempat masuknya komponen hidrofilik seperti gula dan asam amino yang penting untuk kebutuhan nutrisi bakteri (Brookset al., 2004).
3. Escherichia coli
Gambar 3. Kuman Escherichia coli dapat diwarnai dengan pewarnaanGram, hasilnya Gram (-). Isolat dapat dipilih dari koloniE. coli yang tumbuh dalam kultur
Mac Conceyagar (Juwono, 2012).
Gambar 4. Koloni Escherichia coli yang tumbuh di dalam media differensial Mac Concey agar yang mengandung substrat dan bahan-bahan media yang hanya dapat ditumbuhi oleh kuman enterik Gram-negatif (Maddapa et al,.
2016).
C. Antibiotika Golongan Fluorokuinolon
Antibiotik adalah senyawa kimia yang digunakan untuk menghambat pertumbuhan atau membunuh bakteri. Mekanisme kerja antibiotik dikelompokkan dalam 5 kelompok utama, yaitu (Setiabudi, 2007) :
1) Kuinolon
Kelompok ini tidak mempunyai manfaat klinik untuk pengobatan infeksi sistemik karena kadarnya dalam darah terlalu rendah. Selain itu, daya anti-bakterinya lemah dan resistensi juga cepat timbul. Indikasi kliniknya terbatas sebagai antiseptik saluran kemih. Yang termasuk kelompok ini ialah asam nalidiksat dan asam pipemidat.
2) Fluorokuinolon
Kelompok ini disebut demikian karena adanya atom fluor pada posisi 6 dalam struktur molekulnya (Penunjukan Gambar 5). Daya antibakteri florokuinolon jauh lebih kuat dibandingkan kelompok kuinolon lama. Selain itu kelompok obat ini diserap dengan baik pada pemberian oral, dan beberapa derivatnya juga tersedia dalam bentuk parenteral sehingga dapat digunakan untuk penanggulangan infeksi berat khususnya yang disebabkan oleh kuman Gram negatif. Daya antibakterinya terhadap kuman Gram positif relatif lemah. Yang terrmasuk golongan ini ialah siprofloksasin, pefloksasin, ofloksasin, norfloksasin, enoksasin, levofloksasin, fleroksasin, dan lain-lain.
Perbedaan
Gambar 5. Perbaikan farmakologi pada cincin kuinolon dasar dengan penambahan fluorin di posisi C6 dan piperazynil atau cincin terikat pada posisi C7 menghasilkan florokuinolon (Kocsis, 2012).
1. Ciprofloxacin
Gram negatif dan Gram positif. Suhu penyimpanan 2 – 8 °C, di dalam wadah kedap udara, terlindung dari cahaya. Sifat bakterisida dari ciprofloxacin menghasilkan penghambatan enzim topoisomerase II (DNA gyrase) dan topoisomerase IV, yang diperlukan untuk replikasi DNA bakteri, transkripsi, perbaikan dan rekombinasi (TOKU-E., 2010). Ciprofloxacin telah digunakan untuk mengobati berbagai macam infeksi, termasuk infeksi saluran kemih, aliran darah, usus atau saluran pernafasan (Jaktaji et al., 2010). Pada tabel 1 diberikan contoh antibiotika kuinolon / florokuinolon dari generasi ke generasi dan spektrumnya.
Tabel 1. Spektrum Antibiotika Kuinolon / Fluorokuinolon dari Setiap Generasi
GENERASI NAMA OBAT SPEKTRUM
1st Nalidixic acid, cinoxacin Gram-negatif, kecuali Pseudomonas sp. 2nd Norfloxacin, ciprofloxacin,
enoxacin, ofloxacin
Gram-negatif (termasuk
Pseudomonas sp), beberapa Gram-positif (S. aureus) dan beberapa bakteri atipik. 4th Trovafloxacin Sama seperti generasi ke-3,
dengan cakupan luas untuk bakteri anaerob
(Sumber : Jaktajiet al,. 2010)
2. Mekanisame Kerja Fluorokuinolon
DNA bakteri; enzim DNA girase melemaskan peregangan superkoil positif DNA sedangkan topoisomerase IV membatalkan tautan DNA berikut replikasinya. Akibatnya terbentuk ikatan kompleks fluorokuinolon-DNA gyrase dan kompleks fluorokuinolon-DNA topoisomerase IV, menyebabkan replikasi DNA dihambat, akhirnya kematian sel (Kocsis, 2012).
Bagi bakteri Enterobacteriaceae Gram-positif, enzim topoisomerase IV adalah target utama, sedangkan bagi Gram-negatif, enzim DNA girase adalah target utamanya. DNA gyrase dikode oleh gen gyr A dan gyrB, sedang topoisomerase IV dikode oleh gen parC dan parE. Mutasi pada DNA gyrase dan topoisomerase IV dapat memberikan resistensi terhadap obat ini (Pomeri, 2011) (Penunjukan Gambar 6).
Gambar 6. Mekanisme kerja florokuinolon : a) memblokir sintesis DNA bakteri dengan menghambat DNA gyrase dan topoisomerase IV; b) penghambatan DNA girase II dapat mencegah peregangan (relaxation) DNA superkoil positif yang diperlukan untuk transkripsi normal dan replikasi; c) penghambatan topoisomerase IV mengganggu pemisahan dari replikasi kromosom DNA ke dalam tiap-tiap sel anak selama pembelahan sel (Pomeri, 2011).
3. Mekanisme Resistensi Fluorokuinolon
Sampai saat ini, 2 (dua) mekanisme telah ditemukan untuk menentukan resistensi terhadap fluorokuinolon / kuinolon, karena dalam hampir semua kasus organisme yang resisten terhadap fluorokuinolon juga resisten terhadap kuinolon. Yang paling penting dari mekanisme ini di Enterobacteriaceae adalah mutasi pada enzim bakteri yang ditargetkan oleh fluorokuinolon : DNA girase dan DNA topoisomerase IV. Kuinolon / fluorokuinolon mengikat enzim tersebut dan menstabilkan kompleks enzim – antibiotika (akibatnya DNA tidak dapat bereplikasi) sehingga menyebabkan kematian sel akibat patahnya untai ganda DNA yang menumpuk dan tak dapat diperbaiki. Setiap enzim target yang dikode gen (gyrA dan gyrB untuk DNA gyrase, dan parC dan parE untuk topoisomerase IV) memiliki daerah penentu resistensi kuinolon (QRDRs), yaitu bagian permukaan pengikatan DNA dari enzim di mana substitusi asam amino dapat mengurangi pengikatan kuinolon. Umumnya, beberapa mutasi diperlukan untuk mencapai resistensi yang penting secara klinis di dalam Enterobacteriaceae; kuman yang resisten kuinolon hampir selalu ditemukan memiliki satu atau lebih
mutasi(Kocsis, 2012).
sel bakteri. Resistensi terhadap florokuinolon juga dapat berkembang karena pengembangan mekanisme resistensi pompa efflux (Kohanskiet al.,2010).
Pada bakteri Enterobacteriaceae mekanisme resistensi florokuinolon meliputi satu atau dua dari mekanisme berikut :
1) Perubahan pada Enzim Target
Mekanisme ini berhubungan dengan mutasi kromosom yang menyebabkan perubahan gen baik di gyrA maupun gyrB yang merupakan target utama dari antibiotik di dalam bakteri. Di dalam mutan yang resisten terhadap florokuinolon, kedua mutasi pada gen gyrA dan gyrB adalah penyebabnya (Jaktaji et al., 2012). Florokuinolon menghambat sintesis DNA dengan menargetkan 2 topoisomerase type II, yaitu : DNA girase (Topo II) dan topoisomerase IV (Topo IV). Interaksi florokuinolon dengan kompleks DNA girase atau topoisomerase IV dapat menghambat sintesis DNA (dengan menstabilkan pembelahan DNA bakteri selama proses replikasi DNA) dan berakibat pada kematian sel. Topoisomerase II berfungsi menimbulkan relaksasi pada DNA yang mengalami positive supercoiling (pilinan positif yang berlebihan) pada waktu transkipsi dalam proses replikasi DNA. Topoisomerase IV berfungsi untuk memisahkan DNA yang baru terbentuk setelah proses replikasi DNA bakteri selesai (Bourque, 2010; McDowall, 2006).
lebih tinggi dapat terjadi melalui langkah mutasi kedua, dimana perubahan asam amino terjadi pada enzim target sekunder. Mutasi lebih lanjut mengakibatkan tambahan perubahan asam amino di salah satu enzim (Setiabudi, 2007).
2) Perubahan pada Penetrasi Obat
Di antara bakteri patogen, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus dan Streptococcus pneumoniae merupakan yang paling banyak dipelajari dalam hal sistem efluks yang menyebabkan resistensi florokuinolon (Jacoby, 2005).
3) Mekanisme Resistensi Lainnya
hidup. Tak satu pun dari mekanisme yang disebutkan di atas mentransfer unsur genetiknya (Kocsis, 2012).
Resistensi florokuinolon yang diperantarai plasmid pernah dilaporkan pada isolat klinis Klebsiella pneumoniae, yang dapat ditransfer pada E.coli di laboratorium (Nordmann et al., 2005; Robicsek et al., 2006). Beberapa mekanisme lain juga berpengaruh terhadap resistensi florokuinolon misalnya penurunan penyerapan obat karena hilangnya porin yang terikat membran, ekstrusi obat melalui pompa efflux (beberapa obat mungkin memiliki spesifisitas substrat yang luas), atau penelitian yang baru-baru ini menggambarkan mekanisme gen resistensi kuinolon yang diperantarai plasmid (plasmid mediated quinolone-resistance),disingkat gen PMQR (Karczmarczyk et al.,2012; Hopkinset al., 2005).
D. Gen-gen Plasmid
Keberadaan gen PMQR misalnya qnrA, qnrB, qnrS, qnrC, qnrD, oqxA, oqxB qepA dan aac(6’)-Ib-cr hanya memberikan resistensi level rendah terhadap florokuinolon, tetapi mereka dapat menyebarkan secara horizontal di antara bakteri enterik lainnya dan memfasilitasi seleksi mutan resisten setelah paparan ciprofloxacin (Karczmarczyk et al., 2012; Robicsek et al., 2006). Penelitian lain juga menyatakan bahwa resistensi florokuinolon tingkat rendah dapat juga diperantarai plasmid (pMG252) yang menyandi gen qnr di dalam plasmid E.coli (Pereira et al., 2007). Pengertian resistensi level rendah dapat dijelaskan dalam grafik di bawah ini (Penunjukan Gambar 7).
Dari grafik di atas dapat dilihat bahwa breakpoint klinis dari resistensi Gambar 7. Distribusi isolat klinisE. colidi dalam rentang nilai MIC Ciprofloxacin yang
ciprofloxacin untukE.coli adalah S≤ 0,5 mg/L (garis biru) dan R 1 mg/L (garis merah). Distribusi E.coli didalam nilai MIC ciprofloxacin berbeda-beda dan resistansi tingkat rendah adalah dari 0,06 – 0,5 µg/ml (dilingkari). Gen qnr ini dapat meningkatkan frekuensi mutasi pada populasi heterogen E.coli yang tidak selalu memiliki substitusi asam amino di dalam enzim DNA gyrase atau topoisomerase IV, dan akan memfasilitasi pemilihan resistensi tingkat tinggi diantara kuman lainnya (Kocsis, 2012). Jadi jika ditemukan ada gen qnr ini di dalam kuman E.coli, meskipun kuman itu terpapar oleh dosis rendah antibiotika ciprofloxacin, maka kumanE.colitersebut akan menjadi resisten.
Protein OqxAB (Penunjukan Gambar 8) termasuk keluarga RND (resistance-nodulasi division) adalah salah satu gen plasmid pertama yang ditularkan melalui pompa efflux. Gen oqxA mengkode untuk protein fusi membran (AcrA), sedangkan oqxB mengkode untuk protein OqxB yang mengandung 12-transmembran α-heliks untuk pompa inner-membrane (AcrB). Sistem ini membutuhkan proteinouter-membran(TolC) untuk fungsi sepenuhnya. Ini adalah mekanisme resistensi genetik yang teridentifikasi pertama kali terhadap olaquindox, suatu agen yang digunakan sebagai penambah pertumbuhan pada babi. Gen ini dapat dideteksi pada kuman Enterobacteriaceae yang resisten terhadap kloramfenikol, asam nalidixat, norfloksasin dan ciprofloxacin (Kocsis, 2012).
E. Gen-gen Kromosom
Di dalam sel terdapat enzim yang berperan untuk membuat DNA menjadi rileks atau superkoil yaitu enzim DNA topoisomerase. Superkoil DNA ini mirip dengan gulungan kabel telefon. Keadaan dimana DNA double helix menggulung pada sumbunya disebut superkoil DNA sedangkan jika tidak menggulung disebut DNA rileks. Bentuk DNA dalam keadaan rileks atau dalam keadaan superkoil ini disebut topoisomer (Penunjukan Gambar 9).
Gambar 9.
Peran enzim topoisomerase sangat penting pada replikasi, transkripsi dan rekombinasi DNA dengan cara memotong dan menyambungkan untai tunggal atau untai ganda DNA (Bourque, 2010). Topoisomerase DNA ini dapat ditemukan dimana-mana, di dalam semua jenis sel, mulai dari virus sampai kepada manusia dan dapat dibagi menjadi 2 kelompok yaitu (McDowall, 2006) :
a) Topoisomerase tipe I :
Terdiri dari topoisomerase I, III dan V.
Terutama bertanggung jawab untuk mengendurkan (merelaksasi) superkoil positif (belitan di atas) dan / atau superkoil negatif (belitan di bawah) dari DNA, sedangkan girase sebaliknya dapat memasukkan superkoil positif ke dalam DNA.
Memainkan peran penting dalam replikasi DNA dan transkripsi (topoisomerase I), dan rekombinasi (topoisomerase III).
b) Topoisomerase tipe II :
Terdiri dari topoisomerase II (dikode oleh gen gyrA dan gyrB), topoisomerase IV (dikode oleh gen parC dan parE) dan topoisomerase VI.
Bertanggung jawab untuk mengendurkan spiral DNA (topoisomerase IV), serta mengadakan superkoil negatif dan positif (topoisomerase II).
Berperan penting dalam kondensasi kromosom (topoisomerase II) dan pemisahan kromosom anak selama pembelahan sel (topoisomerase IV).
oleh gen gyrB, 90 kDa) (Jaktaji and Mohiti, 2010). Enzim DNA gyrase adalah salah satu dari enzim topoisomerase tipe II yang pertama diisolasi dari E. coli. Enzim ini mempunyai fungsi dalam pengubahan topologi DNA melalui breaking and rejoining (pematahan dan penggabungan kembali) untai ganda DNA. Enzim DNA gyrase memiliki kemampuan untuk memotong kedua untai ganda DNA (double-stranded), melewati bagian lain dari potongan untai DNA tersebut dan menyambung kembali potongan tersebut dengan memanfaatkan ATP (Lodish et al.,2000).
Gambar 10. Dimer gyrase A dari heterotetramer DNA gyrase (Saíz-Urraaet al.,2011).
Di dalam isolat yang menunjukkan resistensi florokuinolon, DNA gyrase (topoisomerase II) yaitu target utama di dalam bakteri Gram-negatif, umumnya menunjukkan substitusi asam amino pada posisi Ser 83 dan/atau Asp 87 dari sub-unit gyrA, sedangkan substitusi pada residu Ser 80 dan Glu 84 umumnya teridentifikasi di dalam sub-unit parC dari topoisomerase IV (Karczmarczyket al., 2012; Heisig, 1996; Oramet al.,1991; Yoshida, 1990) (Lihat Tabel 2 dan ).
Tabel 2. Mutasi Akibat Resistensi Kuinolon di dalam Gen gyrA dariE.coliKL16
STRAIN E.colia
MIC (µg/ml)b
MUTASI
NA PPA NFLX ENX OFLX CPFX
KL16 3,13 1,56 0,05 0,1 0,05 0,0125 Wild type
N-112 400 25 0,78 1,56 0,78 0,39 Ser-83 (TCG)Leu (UTG)
(Sumber : Yoshidaet al.,1990)
Keterangan : a
N-112, N-118, N-119, N-51, N-113, N-97 dan N-89 diuji dengan antibiotik asam nalidiksat; P-18, P-5 dan P-10 diuji dengan antibiotik asam pipemidat.
b
Tabel 3. Mutasi di dalam Gen gyrA dan parC
3204917 248 TCGTGG S83W 233 GGCGAC G78D
MIII,
mengkode topoisomerase II (gyrA dan gyrB) dan IV (parC dan parE) (Zayed et al.,2015).
Resistensi terhadap florokuinolon muncul sebagai akibat dari mutasi missense di wilayah tertentu yang dinamakan the quinolone resistance determining region (QRDR) dari sub-unit enzim target. Substitusi asam amino dalam QRDR yang terlibat dalam pengembangan resistensi florokuinolon di E. colidijelaskan dalam Tabel 4 berikut.
Tabel 4. Substitusi Asam Amino di dalam QRDR Isolat E.coli Resisten Fluorokuinolon
426 Asp Asn 445 Leu His
447 Lys Glu 458 Ser Pro, Trp
Mutasi pada posisi 83 atau 87 untuk subunit gyrA dari DNA gyrase dan posisi 78, 80 atau 84 untuk subunit ParC dari topoisomerase IV secara khusus menyebabkan kompleks enzim-DNA dari mutan memiliki afinitas rendah terhadap antibiotik florokuinolon tersebut. Menurut Zayed et al (2015), mutasi ketiga yang baru terletak di luar QRDR konvensional dari subunit gyrA; R237H hanya ditemukan di isolatE. coli yang sangat resisten dengan MIC≥ 16 mg / ml. Mutasi ini berhubungan kuat dengan fenotip resistensi yang tinggi (P=0,007). Mutasi baru, bersama dengan acrR-V29G (mutasi baru dalam protein AcrR), memerlukan penelitian lebih lanjut untuk mengungkap peran mereka yang mungkin dalam resistensi. Mutasi-mutasi ini berhubungan dengan isolat E.coli yang sangat resisten dan dapat meningkatkan kemampuan tingkat resistensi (Zayedet al.,2015).
Tabel 5. Hubungan Nilai MIC Ciprofloxacin dengan Substitusi Asam Amino yang Menyebabkan Mutasi di dalam Gen gyrA dan parC.
(Sumber : Kocsis, 2012)
F. Polymerase Chain Reaction(PCR)
reaksi rantai karena template DNA diperbanyak secara eksponensial di setiap siklusnya (WHO, 2011).
Metode PCR telah dimodifikasi dan digunakan di berbagai bidang ilmu. Setiap pemeriksaan bakteri atau virus dengan menggunakan PCR memiliki protokol tersendiri, protokol ini berisi prosedur dalam melakukan reaksi dan parameter yang perlu diatur pada sampel (suhu, jumlah dan jenis reagen serta durasi suhu). Real-timePCR merupakan modifikasi terbaru yang menggabungkan deteksi fluoresence dengan metode PCR konvensional. Real-time PCR memungkinkan deteksi dan penghitungan jumlah molekul dari target DNA yang telah dihasilkan. Modifikasi ini telah diterima secara luas karena risiko kontaminasinya yang rendah; serta memiliki sensitivitas dan kecepatan proses yang tinggi. Oleh karena itu Real-time PCR diakui sebagai gold standar untuk diagnosis beberapa penyakit yang disebabkan oleh bakteri, virus dan menghitung jumlah virus pada sampel klinis (Wicaksono, 2015).
1. Tiga Tahap Proses Penggandaan DNA
Proses sintesis dan penggandaan DNA menggunakan PCR terdiri dari 3 tahap (Penunjukan Gambar 11), yaitu : denaturasi,annealingdan eexstensi. Setiap tahap tersebut diatur pada kondisi suhu yang berbeda. Berikut ini adalah 3 tahap tersebut (Loet al.,2006; PCR Virtual Lab, 2012) :
a) Tahap denaturasi, merupakan tahap pemisahan sebuah untai ganda DNA agar terpisah menjadi 2 buah untai tunggal DNA yang dilakukan pada suhu 94oC. b) Tahap annealing (penempelan), merupakan tahap awal sintesis DNA secara
dari komposisi dan panjang basa serta konsentrasi primer. Umumnya, untuk primer dengan panjang 18–30 pasang basa digunakan suhu 55oC selama 1– 2 menit. Turunnya suhu menjadi 55 oC mengakibatkan untai tunggal DNA cenderung akan bergabung dengan untai tunggal yang lain tetapi karena adanya primer, untai tunggal DNA tersebut dihambat untuk berpasangan kembali.
c) Tahap ekstensi (pemanjangan), biasanya dilakukan pada suhu 72 oC. Tahap ini merupakan proses pemanjangan primer oleh DNA polymerase. Enzim ini menjadi aktif karena adanya perubahan suhu menjadi 72oC.
Tiga tahap tersebut (siklus replikasi) dilakukan berulang-ulang sampai mendapatkan hasil yang diinginkan. Dengan menggunakan perhitungan sederhana, jumlah penggandaan yang dihasilkan adalah 2n, dengan n adalah jumlah siklus replikasi yang dilakukan (Principle of the PCR, 1999). Jumlah siklus yang optimum tergantung pada konsentrasi awal template DNA, biasanya adalah 25 – 35 siklus. Siklus yang terlalu sedikit akan memberikan hasil yang sedikit, sebaliknya bila terlalu banyak akan meningkatkan jumlah dan kompleksitas produk non-spesifik, sehingga menimbulkan efek plateau (Sulistyaningsih, 2007).
2. Prinsip Kerja Mesin PCR
Untuk melakukan otomasi pada teknik PCR, maka dibuat sebuah alat yang disebut mesin PCR. Mesin PCR sering disebut juga sebagai thermocyler. Pada prinsipnya mesin PCR melakukan pengontrolan suhu pada 3 tahap proses sintesis dan penggandaan DNA (denaturation, annealing dan extention) (Wicaksono, 2015).
Saat ini ada beberapa tipe mesin PCR, yakni (PCR Virtual Lab, 2012) : a) Mesin PCR konvensional. Digunakan untuk mendeteksi dan menggandakan
DNA.
b) Real-time PCR : mendeteksi, menggandakan dan menghitung jumlah salinan awal DNA.
d) Nested-PCR : mendeteksi dan menggandakan DNA primer dengan eksternal dan internal.
e) Reverse Transcription (RT)-PCR : digunakan untuk mendeteksi dan menggandakan RNA (bukan DNA).
a) Mesin PCR Konvensional
Prinsip kerja mesin PCR konvensional terdiri dari 5 buah komponen dasar, yaitu tempat sampel, sensor suhu, komponen pemanas, komponen pendingin dan pusat kontrol (controller) (Penunjukan Gambar 12).
Gambar 12.Diagram sederhana mesin PCR konvensional (Wicaksono, 2015).
Controller digunakan untuk mengatur protokol yang akan dijalankan oleh mesin PCR, yaitu untuk mengatur jumlah siklus, suhu dan durasi waktu setiap tahap serta suhu di akhir proses.Controllerterdiri dari komputer dan sensor suhu. Syarat sensor suhu adalah mampu mendeteksi suhu pada rentang 4– 99oC. Beberapa merk yang digunakan untuk sensor suhu adalah thermocouple type K dan NTC thermistor. Komponen pemanas dan pendingin diatur oleh controller untuk mengatur suhu pada setiap tahap. Kedua komponen ini biasanya suatu thermoelectric (disebut Peltier device karena menggunakan efek Peltier). Untuk mempercepat pendinginan, komponen thermoelectric ini ditempelkan pada heat
SENSOR SUHU
KOMPONEN PENDINGIN
KOMPONEN PEMANAS
sink dan kipas. Tempat sampel digunakan untuk menempatkan tube berisi sampel DNA yang telah dicampur dengan enzim, primer dan bahan lain, yang akan digandakan. Tempat sampel biasanya berupa blok aluminium karena aluminium merupakan penghantar panas yang baik (Coffe Cup–PCR, 2009).
b) MesinReal-time PCR
Mesin real-time PCR biasa disebut quantitative real-time PCR atau kinetik PCR (disingkat q-PCR / Q-PCR) untuk membedakannya denganReverse Transcription PCR(disingkat RT-PCR).
Pada mesin PCR konvensional deteksi hasil penggandaan DNA dilakukan dengan analisisend-point. Analisis ini dilakukan dengan menggunakan gel agarosa setelah siklus PCR selesai. Sedangkan dengan real-time PCR, hasil penggandaan dapat dihitung dan diukur saat siklus PCR sedang berlangsung, karena itu dinamakanreal-time, sebab analisisnya dapat dilakukan secara simultan (Biorad, 2006). Deteksi secara simultan ini dapat dilakukan karena ditambahkan molekul fluoresens, sinyal dari fluoresens semakin meningkat jika hasil penggandaan DNA juga meningkat. Cara kerja real-time PCR sama seperti prinsip umum reaksi PCR, DNA yang telah diamplifikasi dihitung setelah diakumulasikan dalam reaksi secara real-time setiap selesai siklus penggandaan (Real-time PCR, 2003) (Penunjukan Gambar 13).
Ada 2 metode kuantifikasi yang digunakan, yaitu (Wicaksono, 2015) : 1) Memakai zat pewarna, misalnya SyBr Green.
misalnya probe FRET (hibridisasi) dan probe TaqMan. Dalam setiap pengamatan proses PCR, sinyal fluoresensi yang dipancarkan akan meningkat secara proporsional pada setiap siklus PCR yang telah dilakukan dan sebanding dengan bertambahnya produk DNA (hasil amplifikasi).
Gambar 13.Ilustrasi pembacaan pada mesin real-time PCR (Wicaksono, 2015).
III. METODOLOGI PENELITIAN
A. Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan pada bulan September – Desember 2016 di Laboratorium Biomolekuler FK Unsri Palembang, Laboratorium Biokimia Jurusan Kimia FMIPA Unila dan Laboratorium Mikrobiologi RSUDAM Provinsi Lampung.
B. Alat dan Bahan 1) Alat
Alat-alat penelitian yang digunakan dalam penelitian ini yaitu mikropipet (0,5-10 µl, 5-20 µl, 10-100 µl, 100-500 µl dan 100-1000 µl), 1 set microtip putih, kuning dan biru, shaker, shaker orbital incubator, otoklaf, inkubator, tabung eppendorf 1,5 ml dan 2,0 ml; rak tabung eppendorf, 1 set PCR tube 0,2 ml,rak tabungPCR tube, vortex shaker, mikrosentrifuga, labu ukur 50 ml dan 100 ml, beaker glass 50 ml, 100 ml dan 500 ml, neraca analitik, tabung reaksi 5 ml bertutup ulir, freezer, kulkas, waterbath, microwave, alat PCR alat T100TM Thermal Cycler, alat elektroforesis BIO-RADTM PowerPac, seperangkat alat UVBIO-RADTMUVITEC.
2) Bahan
a) Sampel 18 isolat E.coli MDR ciprofloxacin dari hasil penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Saputri dkk.(2015).
b) PrestoTMMini Plasmid Kit, 100 preps/kit (GENEAID).
c) WizardGenomic DNA Purification Kit,100 Isolations(PROMEGA).
d) Sepasang primer spesifik gen qnr (PROMEGA) untuk amplifikasi dan sequencing DNA(Jacobyet al.,2003; Pereiraet al.,2007) yaitu :
(1) Primer QP1:5’- GAT AAA GTT TTT CAG CAA GAG G -3’ (2) Primer QP2:5’- ATC CAG ATC GGC AAA GGT TA -3’.
e) Sepasang primer spesifik gen oqxA (PROMEGA) untuk amplifikasi dan sequencing DNA(Liuet al.,2011; Liuet al.,2012) yaitu :
(1) PrimerOqxA-F:5’- CTT GCA CTT AGT TAA GCG CC -3’
(2) Primer OqxA-R:5’- GAG GTT TTG ATA GTG GAG GTA GG -3’. f) Sepasang primer spesifik gen oqxB (PROMEGA) untuk amplifikasi dan
sequencing DNA(Liuet al.,2011; Liuet al.,2012) yaitu : (1) Primer OqxB-F:5’- GCG GTG CTG TCG ATT TTA -3’ (2) Primer OqxB-R :5’- TAC CGG AAC CCA TCT CGA T -3’.
g) Sepasang primer spesifik gen gyrA (PROMEGA) untuk amplifikasi dan sequencing DNA pada 191 bp (Everettet al.,1996; Liuet al.,2012) yaitu :
(1) Primer gyrA–F :5’- ACG TAC TAG GCA ATG ACT GG - 3’ (2) Primer gyrA–R :5’- AGA AGT CGC CGT CGA TAG AA - 3’
h) Sepasang primer spesifik gen parC (PROMEGA) untuk amplifikasi dan sequencing DNA pada 264 bp (Everett,et al.,1996; Liuet al.,2012) yaitu :
i) Bahan-bahan lain yang dibutuhkan :
(1) MediaLuria Berthani Broth(LB Broth)
(2) Green GoTaqMaster Mix Kit(untuk 100 tes). (3) Agarose.
(4) TBE Buffer 10X. (5) Isopropanol. (6) Alkohol absolut. (7) Alkohol 70%
C. Prosedur Penelitian
Tahapan penelitian yang akan dilakukan adalah : 1) Persiapan Isolasi Plasmid
Kultivasi pada mediaLB Brothdilakukan dengan cara :
Diambil 50 µL suspensi bakteri dari kultur stok dengan mikropipet, masukkan ke dalam LB Brothr 5 ml dalam tabung reaksi yang mengandung ciprofloxacin 10 µg/ml, kemudian diinkubasi pada shaker orbital incubator 37oC selama 16–24 jam (overnight). Suspensi bakteri siap dilakukan isolasi plasmid.
2) Isolasi DNA Plasmid IsolatE.coli
a) Pemanenan
1) Pipet 1,5 ml kultur sel bakteri di dalam mediaLB broth, masukkan ke dalam sebuah tabung mikrosentrifuga 1,5 ml.
2) Sentrifugasi dengan kecepatan 14 – 16.000 x g selama 1 menit pada suhu kamar untuk membentuk pelet sel.
3) Buang supernatan yang mengandung sisa media.
4) Ulangi lagi prosedur 1 – 3, sampai kultur sel di dalam media Luria Berthanihabis. Lalu akan didapatkan pelet sel.
b) Resuspensi Sel
1) Campurkan 200 µl reagen PD1 buffer (pastikan Rnase A telah ditambahkan dalam reagen PD1 buffer tadi) dan 2 µL Trueblue lysis buffer ke dalam tabung mikrosentrifuga 1,5 ml yang baru, lalu kocok dengan pelan-pelan.
2) Pipet campuran tadi ke dalam tabung mikrosentrifuga yang mengandung pelet sel, lalu vortex sampai larut.
c) Pemecahan / Pelisisan Sel
1) Tambahkan 200 ml reagen PD2 buffer untuk campuran yang telah diresuspensi tadi, lalu aduk dengan membolak-balik tabung sebanyak 10 kali. Jangan divortex untuk menghindari geseran DNA genom. 2) Diamkan pada suhu kamar selama minimal 2 menit untuk memastikan
lisat yang homogen. Tidak melebihi 5 menit.
masih sedikit warna birunya atau kecoklat-coklatan, lakukan terus pencampuran sampai suspensi benar-benar biru.
3) Tutup segera botol PD2 Buffer setelah digunakan untuk menghindari pengasaman CO2.
1) Tambahkan 300 µl reagenPD3 bufferlalu bolak-balik dengan cepat 4 –6 kali (jangan divortex). Setelah menambahkanPD3 buffer, suspensi menjadi tidak berwarna.
2) Sentrifugasi 14–16.000 x g selama 3 menit di suhu kamar.
Pencampuran belum cukup
1) Pipet supernatan tadi lalu masukkan ke dalam tabungPD column. 2) Sentrifugasi 14 – 16.000 x g selama 30 detik – 1 menit pada suhu
3) Lalu buang larutan di dalamCollection tube2 ml.
4) Letakkan kembaliPD columnke dalamCollection tube2 ml.
f) Pencucian
1) Tambahkan 400 µl W1 buffer ke dalam tabung PD column. Sentrifugasi pada 14–16.000 x g. Lalu buang larutan di dalam tabung Collection tube 2 ml. Letakkan kembali tabung PD column didalam tabungCollection tube 2 ml.
2) Tambahkan 600 µl Wash buffer (pastikan etanol absolut telah ditambahkan di dalam botol Wash buffer) ke dalam tabung PD column.
3) Sentrifugasi pada 14 – 16.000 x g selama 30 detik – 1 menit. Lalu buang larutan di dalam tabungCollection tube 2 ml. Letakkan kembali tabungPD columndidalam tabungCollection tube 2 ml.
4) Sentrifugasi lagi pada 14 – 16.000 x g selama 3 menit untuk mengeringkan matriks PD column (tujuannya untuk menghilangkan residuWash buffer).
5) Pindahkan tabung PD column yang telah kering ke dalam tabung mikrosentrifuga 1,5 ml yang baru.
g) Proses Elusi
1) Tambahkan 50 µL reagenElution buffer ke tengah-tengah matriksPD Column.
3) Sentrifugasi 14 – 16.000 x g selama 2 menit. Hasil isolasi DNA plasmid (eluen) di dalam tabung mikrosentrifuga 1,5 ml siap diperiksa dengan teknik PCR dan elektroforesis. Skematik isolasi DNA plasmid dari bakteri dapat dilihat pada Gambar 14.
Pemanenan kultur sel bakteri dengan cara sentrifugasi untuk membentuk pelet sel, diikuti oleh resuspensi
Pelisisan sel bakteri (opsional : indikator warna akan menyala biru ketika lisis berhasil)
Netralisasi suspensi (opsional : indikator warna akan menjadi terang ketika netralisasi berhasil)
Pengikatan DNA kepada membran sementara kontaminan tetap disuspensikan
Pencucian (penghilangan kontaminan, sementara DNA tetap terikat ke membran)
Elusi DNA plasmid murni yang siap dipakai untuk uji / reaksi selanjutnya
Gambar 14.Skema isolasi DNA plasmid.
3) Isolasi DNA Kromosom IsolatE.coli
a) Tahap Penyiapan Pelet Sel
1) Tambahkan 1 ml kultur bakteri semalam (overnight) ke dalam tabung mikrosentrifus 1,5 ml.
2) Sentrifugasi di kecepatan 13 – 16.000 x g selama 2 menit untuk membuat pelet sel. Buang supernatan.
i) Untuk bakteri Gram Positif, lanjutkan ke Langkah 3. ii) Untuk bakteri Gram Negatif, langsung ke Langkah 6.
3) Suspensikan kembali pelet sel secara menyeluruh di dalam 480 µl EDTA (ethylene diamine tetrachloride) 50 mM.
4) Tambahkan enzim litik yang sesuai kepada pelet sel yang di-resuspensikan tadi dalam volume total 120 μ l, dan pipet dengan
pelan-pelan untuk mencampur. Tujuan dari pre-treatment ini adalah untuk melemahkan dinding sel sehingga pelisisan sel dapat terjadi secara efisien. Catatan : Untuk spesies Staphylococcus tertentu, campuran 60 μ l dari 10 mg/ml lisozim dan 60 μ l dari 10 mg/ml
lysostaphin diperlukan untuk pelisisan yang efisien. Namun, banyak strain bakteri Gram Positif (misalnya, Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Nocardia otitidiscaviarum, Rhodococcus rhodochrous, dan Brevibacterium albidium), pelisisannya hanya menggunakan lisozim saja.
b) Tahap Pelisisan Sel
6) Tambahkan 600 μ l reagen Nuclei lysis solution. Resuspensi dengan mikropipet pelan-pelan sampai sel tersuspensi kembali.
7) Inkubasi pada suhu 80 °C di dalam waterbathselama 5 menit untuk melisiskan sel; kemudian dinginkan pada suhu kamar.
8) Tambahkan 3 μ l reagen RNase solution ke dalam lisat sel. Bolak balikkan tabung pelan-pelan sebanyak 2–5 kali untuk mencampur. 9) Inkubasi pada suhu 37 °C di dalamwaterbath selama 15–60 menit.
Dinginkan sampel pada suhu kamar.
c) Tahap Pengendapan Protein
10) Tambahkan 200 μ l reagen Protein presipitation solution ke dalam lisat sel yang telah ditambahRNase. Vortex dengan kecepatan tinggi selama 20 detik.
11) Inkubasi sampel pada es (di dalamfrezeerkulkas) selama 5 menit. 12) Sentrifugasi pada 13–16.000 x g selama 3 menit.
d) Rehidrasi dan Presipitasi DNA
14) Campur pelan-pelan dengan membolak balik tabung sampai untai DNA yang seperti benang membentuk massa yang dapat dilihat. 15) Sentrifugasi pada kecepatan 13–16.000 x g selama 2 menit.
16) Dengan hati-hati tuangkan supernatan dan kuras / tiriskan tabung di atas kertas tisu bersih. Tambahkan 600 μ l etanol 70% suhu kamar dan bolak balikkan pelan-pelan tabung beberapa kali untuk mencuci pelet DNA.
17) Sentrifugasi pada kecepatan 13–16.000 x g selama 2 menit. Dengan hati-hati sedot / isap etanol.
18) Kuras / tiriskan tabung di atas kertas tisu bersih, sehingga memungkinkan pelet mendapat udara kering selama 10–15 menit. 19) Tambahkan 100 μ l dari reagen DNA rehydration solution ke dalam
tabung dan rehidrasi DNA dengan menginkubasi pada 65 °C di dalam waterbath selama 1 jam. Campur larutan secara periodik dengan pelan-pelan menekan tabung. Atau cara lain, rehidrasi DNA dengan menginkubasi larutan campuran selama semalam pada suhu kamar atau pada suhu 4 °C.
Pelet sel bakteri Gram(+)
Pelet sel bakteri Gram(-) Suspensikan di dalam EDTA.
Tambahkan enzim litik yang sesuai.
Tambahkan larutan pelisis sel.
Inkubasi pada suhu 80 °C selama 5 menit, lalu tambahkan larutan RNAse dan inkubasi.
Tambahkan larutan pengendap protein
Sentrifugasi13 16.000 x g
Pindahkan supernatan ke dalam tabung mikrosentrifuga baru yang mengandung isopropanol
Sentrifugasi13 16.000 x g
Buang supernatan.
Tambahkan etanol.
Sentrifugasi13 16.000 x g
Sedot etanol.
Keringkan / tiriskan pelet.
4) Uji PCR
a) Deteksi PCR untuk Gen qnr
(1) Gen diamplifikasi dengan menggunakan Primer QP1 : 5’- GAT AAA GTT TTT CAG CAA GAG G -3’dan PrimerQP2 :5’- ATC CAG ATC GGC AAA GGT TA - 3’ untuk menghasilkan pita 593 bp (Jacobyet al.,2003; Pereiraet al.,2007).
(2) Program :
(a) Denaturasi awal 94oC selama 5 menit.
(b) Siklus amplifikasi diulang 30 kali terdiri dari : (i) Denaturasi 94oC, 60 detik (1 menit). (ii) Annealing57oC, 30 detik.
(iii) Ekstensi 72oC, 60 detik (1 menit).
(c) Perpanjangan langkah terakhir (ekstensi final) 72oC, 5 menit.
b) Deteksi PCR untuk gen oqxA:
(1) Gen diamplifikasi dengan menggunakan Primer OqxA-F : 5’ -CTT GCA -CTT AGT TAA GCG CC -3’ dan PrimerOqxA-R :5’ -GAG GTT TTG ATA GTG -GAG GTA GG -3’untuk menghasilkan pita 866 bp (Liuet al.,2011; Liuet al.,2012).
(2) Program :
(a) Denaturasi awal 95oC, 5 menit.
(b) Siklus amplifikasi diulang 34 kali terdiri dari : (i) Denaturasi 94oC, 45 detik.
(ii) Annealing64oC, 45 detik.
(c) Perpanjangan langkah terakhir (ekstensi final) 72oC, 5 menit.
c) Deteksi PCR untuk gen oqxB:
(1) Gen diamplifikasi dengan menggunakan Primer OqxB-F : 5’ -GCG GTG CTG TCG ATT TTA -3’ danPrimerOqxB-R :5’- TAC CGG AAC CCA TCT CGA T -3’ untuk menghasilkan pita 781 bp (Liuet al.,2011; Liuet al.,2012).
(2) Program :
(a) Denaturasi awal 95oC, 5 menit.
(b) Siklus amplifikasi diulang 34 kali terdiri dari : (i) Denaturasi 94oC, 45 detik.
(ii) Annealing64oC, 45 detik.
(iii)Ekstensi 72oC, 60 detik (1 menit).
(c) Perpanjangan langkah terakhir (ekstensi final) 72oC, 5 menit.
d)Deteksi PCR untuk Gen gyrA :
(1) Gen diamplifikasi dengan menggunakan primer gyrA (F) : 5’ -ACG TAC TAG GCA ATG ACT GG - 3’dan primer gyrA(R) :5’ -AGA AGT CGC CGT CGA TAG AA - 3’untuk menghasilkan pita 191 bp (Everettet al.,1996; Liuet al.,2012).
(2) Program :
(a) Denaturasi awal 94oC selama 5 menit.
