STUDI SITOTOKSITAS KOMPONEN INTRA DAN EKSTRASELULER
Lactobacillus plantarum IIA-1A5 DAN Lactobacillus acidophilus IIA-2B4
TERHADAP SEL HeLa
WENY DWI NINGTIYAS
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Studi Sitotoksitas Komponen Intra dan Ekstraseluler Lactobacillus plantarum IIA-1A5 dan Lactobacillus acidophilus IIA-2B4 terhadap Sel HeLa adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.
Bogor, November 2016
RINGKASAN
WENY DWI NINGTIYAS. Studi Sitotoksitas Komponen Intra dan Ekstraseluler Lactobacillus plantarum IIA-1A5 dan Lactobacillus acidophilus IIA-2B4 terhadap Sel HeLa. Dibimbing oleh IRMA ISNAFIA ARIEF, CAHYO BUDIMAN dan AHMAD RUSDAN H UTOMO
Bakteri asam laktat khususnya Lactobacillus diketahui berperan dalam mencegah beberapa penyakit yang diakibatkan oleh sel kanker. Tujuan dari penelitian ini adalah menganalisis sifat sitoksisitas dari bakteri asam laktat dengan menggunakan sel HeLa sebagai model sel kanker. Parameter yang diamati dalam penelitian ini yaitu kadar protein dan profil protein menngunakan SDS-PAGE, aktivitas BAL dengan menggunakan metode sitotoksik MTT assay, nilai IC50, dan
morfologi sel hela yang telah diberi perlakuan dengan ekstrak bakter asam laktat. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak intraseluler L. acidophilus IIA-2B4 mempunyai nilai penghambatan terbesar (74.16%) sedangkan ekstrak L. plantarum IIA-1A5 mempunyai nilai penghambatan kurang dari 50% Ektrak secara intraseluler menunjukkan adanya fenomena dose dependent response. Kesimpulan dari hasil penelitian ini yaitu Ekstrak intraseluler L. plantarum IIA-1A5 dan L. acidophilus IIA-2B4 dapat menghambat proliferasi sel kanker serviks HeLa sebesar ±70% dengan konsentrasi 200 µg/mL. Ekstrak L. acidophilus IIA-2B4 memiliki aktivitas sitoksisitas terbaik dengan nilai IC50 sebesar 120 μg/mL
SUMMARY
WENY DWI NINGTIYAS. Study of Cytotoxic Effect Intra and Extracellular from Lactobacillus plantarum IIA-1A5 and Lactobacillus acidophilus against HeLa Cells IIA-2B4. Supervised by IRMA ISNAFIA ARIEF, CAHYO BUDIMAN and AHMAD RUSDAN H UTOMO.
Some of lactic acid bacteria (LAB) which mostly belongs to Lactobacillus genus, have been reported to demonstrate ability in prevention of several cancer cell lines progression. This study aims to cytotoxic of LAB locally isolated from Indonesia cattle (L. plantarum IIA-1A5 and L. acidophilus IIA -2B4) using HeLa cells as a model of cancer cells. The parameters investigated were protein levels and protein profiling using SDS-PAGE, LAB activity in HeLa cell extracts with MTT (Microculture Tetrazolium Technique) cytotoxicity test, IC50 value and
morphology of HeLa cells that had been treated with extract lactic acid bacteria. Result showed that intacelluler extract L. acidophilus IIA-2B4 display the highest inhibitory activity (74.16%), meanwhile the extract from L. plantarum IIA-1A5 was less than 50%. The intracellularly extraxt were found to inhibit the growth of HeLa cancer cells in a dose-dependent response as detected by the MTT. The conclusion, intracellular extract L. plantarum IIA-1A5 and L. acidophilus IIA-2B4 can inhibit the proliferation of cervical cancer HeLa cells by ± 74.16% at a concentration of 200 µg/mL. Extract L. acidophilus IIA-2B4 has the better anticancer activity with IC50 value of 120 µg/mL which can be classified into
quite toxic category
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains
pada
Program Studi Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan
STUDI SITOTOKSITAS KOMPONEN INTRA DAN EKSTRASELULER
Lactobacillus plantarum IIA-1A5 DAN Lactobacillus acidophilus IIA-2B4
TERHADAP SEL HeLa
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR 2016
Judul Tesis : Studi Sitotoksitas Komponen Intra dan Ekstraseluler Lactobacillus plantarum IIA-1A5 dan Lactobacillus acidophilus IIA-2B4 terhadap Sel HeLa
Nama : Weny Dwi Ningtiyas
NIM : D151140331
Disetujui oleh Komisi Pembimbing
Dr Irma Isnafia Arief, SPt MSi Ketua
Dr Cahyo Budiman, SPt MEng Anggota
Ahmad Rusdan H Utomo, PhD Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi
Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan
Dr Ir Salundik, MSi
Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas segala karunia-Nya sehingga penulisan tesis ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang telah dilaksanakan pada bulan Januari-Mei 2016 ini ialah Studi Sitotoksitas Komponen Intra dan Ekstraseluler Lactobacillus plantarum IIA-1A5 dan Lactobacillus acidophilus IIA-2B4 terhadap Sel HeLa. Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr Irma Isnafia Arief, SPt MSi, Cahyo Budiman, SPt MEng dan Ahmad Rusdan Handoyo Utomo, Ph.D selaku dosen pembimbing yang telah memberikan banyak saran, masukan, dan nasehat selama penelitian.
Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada ibu Dr Irmanida Batubara, SSi Msi, selaku penguji dalam ujian sidang dan ibu Dr Ir Niken Ulupi MS, selaku panitia yang telah banyak memberi saran hasil penelitian. Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi yang telah membantu penulis selama studi melalui Beasiswa BPPDN Fresh Graduate. Terima kasih dan penghargaan penulis sampaikan kepada seluruh dosen ITP atas ilmu dan pengalaman yang telah diberikan, rekan-rekan Pascasarjana ITP khususnya angkatan 2014, teman-teman selama penelitian di laboratorium terpadu peternakan terkhusus kepada kak Dwi Febrianti, kepada Ibu Silmi Mariya, SSi, MSi dan mba iin yang telah membantu mengerjakan dan membimbing dalam pelaksanaan uji MTT di PSSP, staf administrasi Pascasarjana ITP atas dukungan dan kerjasamanya selama penulis menyesaikan studi serta pihak-pihak lain yang tidak dapat disebutkan satu persatu. Ungkapan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada kedua orang tua penulis Bayu Nugroho dan St. Hartati, serta kepada Yuyun Wulandari, Samsu Alam Rab, Listian Ruslim dan Andi Mutmainna, serta seluruh keluarga besar penulis atas segala doa dan perhatian yang diberikan kepada penulis.
Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat khususnya untuk diri pribadi penulis dan umumnya untuk pembaca. Demi kesempurnaan penelitian di tahap selanjutnya, kritik dan saran yang membangun sangat penulis harapkan.
Bogor, November 2016
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL vi
DAFTAR GAMBAR vi
DAFTAR LAMPIRAN vi
1 PENDAHULUAN 1
Latar Belakang 1
Tujuan Penelitian 2
Manfaat Penelitian 2
Ruang Lingkup Penelitian 2
2 METODE 3
Waktu dan Tempat Penelitian 4
Materi Penelitian 4
Prosedur dan Analisis Data 4
Rancangan Percobaan 6
3 HASIL DAN PEMBAHASAN 7
Kadar Protein dan Profil Protein (SDS-PAGE) 7
Aktivitas Sitotoksitas Ekstrak BAL 8
Nilai Median Inhibition Concentration (IC50) 12
Morfologi Sel HeLa 12
4 SIMPULAN DAN SARAN 14
Simpulan 14
Saran 14
DAFTAR PUSTAKA 15
LAMPIRAN 19
DAFTAR TABEL
1 Analisis kadar protein ekstrak BAL 7
2 Rata-rata nilai absorbansi sel HeLa pada berbagai konsentrasi ekstrak
BAL 9
3 Nilai IC50 ekstrak BAL 12
DAFTAR GAMBAR
1 Tahapan penelitian 3
2 Elektroforegram kadar protein menggunakan SDS-PAGE 8 3 Persentase penghambatan ekstrak BAL terhadap sel HeLa 10
4 Morfologi sel HeLa 13
DAFTAR LAMPIRAN
1 Perhitungan konsentrasi protein BAL 20
1
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Kanker atau tumor ganas adalah salah satu penyakit paling mematikan di dunia. Angka kematian akibat kanker secara global diperkirakan akan meningkat sebesar 45% dari 11.3 juta kasus pada tahun 2007 menjadi 15.5 juta kasus pada tahun 2030 (WHO 2010). Salah satu kanker yang banyak menyebabkan kematian di seluruh dunia yaitu kanker serviks (mulut rahim). Setidaknya 500.000 wanita yang menderita kanker serviks di seluruh dunia setiap tahun, yang sebagian besar terjadi di negara-negara berkembang menyebabkan kematian sebanyak 250.000 wanita (Wilson et al. 2004; Aggarwal 2014). Kanker serviks sering dikaitkan dengan infeksi virus (Jess et al. 2007). Penyebab dari kanker serviks adalah infeksi oleh human papilloma virus (HPV) (Phongsavan et al. 2012). Penelitian menunjukkan bahwa terdapat lebih dari 12.000 kasus kanker serviks di Amerika Serikat pada tahun 2012 (Siegel et al. 2012). Pengobatan yang biasa dilakukan umumnya dengan operasi, radioterapi, dan kemoterapi (Hahn & Payne 2003). Pengobatan dengan radiasi memiliki efek samping (NCI 2012) dan bahkan dapat memicu resiko kanker lainnya (ACS 2012). Kemoterapi umumnya dilakukan dengan obat-obatan untuk menghilangkan sel-sel kanker. Doxorubicin merupakan salah satu obat yang umumnya digunakan dalam kemoterapi, namun memiliki masalah dalam spesifitas sehingga menyebabkan distribusi dan terapi efek yang buruk serta efek samping yang tidak diinginkan (Kenneth et al. 2005). Kemoterapi dapat menghambat pertumbuhan sel kanker, tetapi juga dapat membahayakan sel-sel normal lainnya (NCI 2012).
2
Beberapa penelitian telah mengungkapkan keuntungan dari L. plantarum IIA-1A5, seperti mempunyai antibakteri terhadap E. coli, Staphylococcus aureus, dan Salmonella typhimurium (Arief et al. 2010), menghambat pertumbuhan bakteri patogen dan memiliki toleransi yang tinggi terhadap pH yang rendah (Arief et al. 2012; Arief et al. 2013; Kia et al. 2016). L. acidophilus IIA-2B4 juga telah menunjukkan kemampuan sebagai probiotik dan kemampuan dalam mencegah diare pada tikus yang terinfeksi oleh E. coli dan mempunyai efek imunomodulator dengan meningkatkan jumlah sel limfosit (Arief et al. 2010; Astawan et al. 2011). Namun keterkaitan kedua bakteri tersebut dalam penghambatan proliferasi sel kanker belum diteliti. Beberapa strain BAL telah dilaporkan memiliki sifat anti-kanker dan antitumor (Kim et al. 2002; Kato et al. 1994.). Penelitian yang dilakukan oleh (Nami et al. 2014b) menunjukkan bahwa Lactobacillus acidophilus mempunyai sifat probiotik terkenal, aktivitas antimikroba yang baik, sebagai antibiotik dan ketahanan terhadap garam, asam dan empedu, hasil penilaian bioaktivitas menunjukkan efek sitoksisitas. Data dari studi epidemiologi dan eksperimental juga menunjukkan bahwa mengonsumsi strain BAL tertentu, atau produk susu fermentasi, bisa meringankan resiko kanker dan menghambat pertumbuhan tumor (Pala et al. 2011).
Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis efek sitotoksik dari bakteri asam laktat dengan menggunakan sel HeLa sebagai model sel kanker.
Manfaat
Penelitian ini diharapkan memberikan informasi dan pembuktian ilmiah mengenai efek sitoksisitas pada isolat bakteri L. plantarum IIA-1A5 dan L. acidophilus IIA-2B4 yang berasal dari daging sapi lokal. Hasil yang diperoleh dari penelitian ini juga diharapkan dapat memberikan aset dan kontribusi besar terhadap penemuan senyawa sitoksisitas baru yang berasal dari Indonesia dengan sifat yang lebih baik.
Ruang Lingkup Penelitian
3
2 METODE
Penelitian ini terdiri atas beberapa tahap. Tahapan kerja penelitian disajikan pada Gambar 1.
Gambar 1. Tahapan penelitian Kultivasi Bakteri L. plantarum
IIA-1A5 dan L. acidophilus IIA-2B4
Ekstraksi
Uji Sitotoksik dengan MTT Assay Analisis Kadar Protein
dan Profil Protein (SDS-PAGE) Komponen
Intraseluler
4
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari 2016 sampai Mei 2016, di Laboratorium Terpadu, Bagian Teknologi Hasil Ternak, Fakultas Peternakan dan Pusat Penelitian dan Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi, Institut Pertanian Bogor Selain itu juga dilakukan di Laboratorium Bagian Mikrobiologi dan Imunologi Pusat Studi Satwa Primata, Bogor.
Materi Penelitian
Bahan baku utama yang digunakan dalam penelitian ini yaitu bakteri asam laktat (L. plantarum IIA-1A5 dan L. acidophilus IIA-2B4) yang diperoleh dari daging sapi, media MRSA, methylene blue, kristal violet, lugol, alcohol, safranin, media de Man Rogosa Sharp Broth (MRSB), NaOH 1N, EDTA (Etilen Diamin Tetraasetat Acid), membran dialisis, enzim lisozim, aquabidest, HeLa cell line (American Type Culture Collection® Catalog No.CCL-2TM), Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), fetal calf bovine serum (FBS), Phosphate Buffered Saline (PBS), penisilin-steptomisin, dan garam tetrazolium 3-(4,5-dimetiltiazol- 2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromide.
Alat-alat yang digunakan adalah cawan petri, tabung reaksi, tabung eppendorf besar dan kecil, pipet pasteur, tip, tube shaker, centrifuge, erlemenyer, gelas kimia, incubator CO2, spektrofotometer, waterbath shaker, flask dan
microplate reader.
Prosedur Penelitian
Persiapan Bakteri L. plantarum IIA-1A5 dan L. acidophilus IIA-2B4
Bakteri yang digunakan dalam penelitian ini adalah L. plantarum IIA-1A5 dan L. acidophilus IIA-2B4. Sebelum digunakan, BAL disegarkan dari stock culture untuk mengaktifkan kembali kultur bakteri yang akan digunakan L. plantarum IIA-1A5 dan L. acidophilus IIA-2B4 disegarkan ke dalam media MRSB. Penyegaran bakteri dilakukan berdasarkan Waluyo (2008) dengan menumbuhkan masing-masing 1 ml sampel di dalam media MRSB 9 ml. Bakteri starter diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Proses penyegaran ini dilakukan sebanyak 3 kali. Final kultur yang diperoleh dari hasil penyegaran ini digunakan untuk tahapan penelitian selanjutnya.
Peubah yang Diamati
Ekstraksi Protein
5 diinkubasi pada waterbath shaker selama 1 jam pada suhu 37oC. Suspensi kemudian disentrifuge kembali (14.000 g selama 3 menit pada suhu 25oC) supernatan kemudian dipindahkan dalam tabung eppendorf 1,5 ml dan siap digunakan dalam tahap penelitian selanjutnya (Abed 2013).
Komponen Ekstraseluler. BAL yang telah ditumbuhkan pada media MRSB dan telah diinkubasi selama 24 jam, kemudian diambil sebanyak 5 ml dan disentrifugasi pada kecepatan 14.000 g selama 3 menit pada suhu 25oC kemudian supernatannya di collect untuk dilanjutkan pada tahap dialysis. Tahap dialysis dilakukan selama 24 jam dengan merendam membran dialysis yang berisi supernatan ke dalam 50 mM EDTA sebanyak 100 mL. Hasil dialysis kemudian dipindahkan dalam tabung eppendorf untuk digunakan pada tahap penelitian selanjutnya (Abed 2013).
Analisis Kadar Protein
Penetapan kadar protein metode Lowry et al. (1951) sebagai berikut: 1 ml suspensi protein membran dalam mitokondria dimasukkan ke dalam kuvet dan ditambah 1 ml larutan Na2CO3 2% (w/v) dalam NaOH 0.1 N, Na K tartrate 2%
(w/v), dan CuSO4 1% (w/v) dengan perbandingan 10:0.5:0.5. 3 ml Folin-ciocalteu
ditambahkan ke dalam kuvet. Setelah diinkubasi selama 10 menit, absorban dibaca pada A 600 nm. Untuk kurva standar, digunakan BSA dengan konsentrasi 0; 0.1; 0.2; 0.4; 0.6, 0.8 dan 1.0 mg ml-1.
Pengujian Sitotoksitas
Pembuatan Media Sel Kanker. Media DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) bubuk dimasukkan ke dalam botol steril dan ditambahkan 3.7 gram NaHCO3, antibiotik penisilinstreptomisin 1%, dan 10% FBS (Fetal calf Bovine
Serum), kemudian dihomogenisasi dan ditambahkan akuabides sampai larutan media menjadi 1000 mL.
Kultur Sel HeLa. Sel HeLa ditumbuhkan dalam flask yang berisi media DMEM. Setelah sel tumbuh (menempel pada dinding flask), medianya dibuang dan sel HeLa dalam flask dibilas dengan larutan PBS. Setelah itu, dimasukkan enzim tripsin sebanyak 5 mL, lalu dinkubasikan selama 5 menit, dan kemudian ditambahkan media DMEM. Campuran tersebut disentrifus pada kecepatan 1500 g selama 5 menit. Supernatan yang diperoleh dibuang dan pellet (sel HeLa) yang diperoleh ditambah dengan 5 mL DMEM. Setelah itu, dilakukan perhitungan jumlah sel HeLa. Jumlah sel dihitung hingga masing-masing sumur terisi 5.000 unit sel dari 100 μL kultur sel HeLa, dan dimasukkan ke dalam tiap sumur sebanyak 96 sumur. Kultur sel tersebut diinkubasi selama 24 jam dalam inkubator CO2 (Li et al. 2011).
6
Masing-masing larutan ekstrak kemudian diencerkan dengan menambahkan DMEM dan Buffer untuk mendapatkan konsentrasi akhir pada microplate. Ke dalam tiap sumur microplate yang berisi sel HeLa dari tahap sebelumnya (kultur sel HeLa), ditambahkan 100 μL larutan ekstrak uji diatas sebagai perlakuan, dan ditambahkan 100 μL DMEM sebagai untreated control. Campuran dalam microplate tersebut diinkubasi selama 48 jam dalam inkubator CO2.
Uji Sitotoksisitas dengan MTT. Setelah sel HeLa diinkubasi 48 jam, dimasukkan garam tetrazolium sebanyak 10 μL tiap sumur. Warna campuran menjadi kuning. Setelah itu, diinkubasi selama 4 jam pada inkubator CO2. Setelah
diinkubasi dan telah terbentuk kristal formazan, larutan ekstrak dibuang. Kristal formazan yang terbentuk dilarutkan dengan 100 μL etanol 96% pada tiap sumur. Warna larutan menjadi ungu. Nilai absorban dari formazan yang terbentuk diukur dengan microplate reader pada panjang gelombang 595 nm. Semua perlakuan dilakukan triplo (CCRC 2000)
Elektroforesis SDS-PAGE
Elektroforesis dilakukan untuk mengkonfirmasi profil protein, fraksi yang dipilih dikumpulkan dan dianalisis dengan SDS-Page (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) (Laemmli 1970) menggunakan 15% gel poliakrilamid, di ikuti dengan pewarnaan silver staining (Sigma, St.Louis, MO, USA).
Analisis Data
Data yang diperoleh dari uji sitotoksisitas dengan MTT berupa nilai absorban tiap sumur, kemudian nilai absorban tersebut dikonversi menjadi % penghambatan dengan menggunakan rumus (Zhang et al. 2005):
Absorbansi Kontrol – Absorbansi Sampel
% Penghambatan = x 100%
Absorbansi Kontrol
Nilai Inhibition concentration 50% (IC50) ditentukan melalui persamaan
regresi linear dari log konsentrasi yang digunakan dengan nilai % sel hidup (CCRC 2000).
Rancangan Percobaan
7 Pi = Pengaruh perlakuan ke-i dari 4 taraf kadar protein yang berbeda (ekstrak L. plantarum IIA-1A5 dan L. acidophilus IIA-2B4) pada taraf ke-i
εij = Pengaruh galat percobaan ke-I dan ulangan ke-j
Rancangan acak lengkap (RAL) pola faktorial, dalam menganalisis rata-rata nilai absorbansi penghambatan, dengan model rancangan sebagai berikut:
Yijk = μ + Ci + Pj + CPij + εijk
Keterangan :
Yijk = Variabel respon akibat perlakuan (i= perlakuan penambahan
ekstraksi dengan konsentrasi yang berbeda) pada ulangan ke-j µ = Nilai rata-rata persentase penghambatan
Ci = Pengaruh konsentrasi ke-i (L. plantarum IIA-1A5 dan L. acidophilus IIA-2B4) terhadap sel HeLa
Pj = Pengaruh metabolit ke-i (L. plantarum IIA-1A5 dan L.
acidophilus IIA-2B4) terhadap sel HeLa
CPij = Pengaruh interaksi antara metabolit ke-i (L. plantarum IIA-1A5 dan L. acidophilus IIA-2B4) dan konsentrasi ke-j (µg/mL). εijk = Pengaruh galat percoban ke-i (L. plantarum IIA-1A5 dan L.
acidophilus IIA-2B4) dan konsentrasi ke-j (µg/mL).pada ulangan ke-j (1, 2, 3)
Data yang diperoleh dianalisis dengan analisis ragam dan apabila hasil yang diperoleh adalah nyata akan dilanjutkan dengan Uji Tukey (Gaspersz 1991). Analisis data lainnya menggunakan analisis deskriptif, pengolahan data secara deskriptif ini perlu dilakukan guna memperjelas pembahasan terhadap hasil yang telah diperoleh.
3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Kadar Protein dan Profil Protein (SDS-PAGE)
Analisis kadar protein menggunakan metode lowry dilakukan untuk mengetahui konsentrasi protein yang terdapat dalam ekstrak bakteri asam laktat (BAL) yang dihasilkan oleh isolat bakteri ekstrak intraseluler dan ekstraseluler L. plantarum IIA-1A5 dan L. acidophilus IIA-2B4 dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Analisis kadar protein ekstrak BAL
8
Hasil identifikasi menunjukkan bahwa ekstrak intraseluler dan ekstraseluler L. plantarum IIA-1A5 masing-masing memiliki jumlah protein 2559 µg/mL dan 166 µg/mL, sedangkan ekstrak intraseluler dan ekstraseluler L. acidophilus IIA-2B4 masing-masing memiliki konsentrasi protein 2859 µg/mL dan 192 µg/mL. Identifikasi kandungan protein merupakan langkah awal yang biasa dilakukan dalam menentukan konsentrasi sekaligus menjadi tolak ukur dalam tahap penelitian selanjutnya. Selain itu dapat dilihat bahwa ekstrak intraseluler L. plantarum IIA-1A5 mempunyai kadar protein yang lebih tinggi dibandingkan dengan ekstraseluler. Hal ini disebabkan adanya penambahan enzim lisozim dalam melisis dinding sel. Perbedaan yang lebih jelas dapat dilihat dari analisis profil protein menggunakan SDS-PAGE dapat dilihat pada Gambar 2. yang menunjukkan jumlah pita yang lebih sedikit pada ekstraseluler dibandingkan dengan intraseluler. Kadar protein dalam intraseluler lebih besar dibandingkan dengan yang disekresikan keluar (ekstraseluler). Pada intraseluler sebaran pita dari yang tinggi hingga terendah terlihat lebih jelas sedangkan untuk ekstraseluler sebaran pita yang terlihat terdapat diatas 45 kDa dibawah 45 kDa tidak terlihat jelas yang menunjukkan sedikitnya protein yang terdapat di ekstraseluler.
Gambar 2. Elektroforegram kadar protein menggunakan SDS-PAGE. M : Marker; E1A5-I1A5 (Ekstraseluler dan Intraseluler L. plantarum IIA-1A5), E2B4-I2B4 (Ekstraseluler dan Intraseluler L. acidophilus IIA-2B4).
Aktivitas Sitotoksitas Ekstrak BAL
9 absorbansi pada Tabel 2. yang selanjutnya dihitung persentase penghambatan sel HeLa.
Tabel 2. Rata-rata nilai absorbansi sel HeLa pada berbagai konsentrasi ekstrak BAL
Hasil menunjukkan nilai absorbansi sebanding dengan jumlah sel yang hidup, sehingga semakin tinggi nilai absorbansi berarti semakin banyak juga jumlah sel lestari HeLa yang hidup. Pengukuran untuk melihat aktivitas sitoksisitas bakteri asam laktat terhadap sel lestari HeLa diukur menggunakan metode MTT. Prinsip dari metode MTT adalah sel-sel kanker yang masih hidup akan mengubah MTT yang berwarna kuning menjadi kristal formazan yang melalui kerja enzim mitokondria reduktase.
Aktivitas sitoksisitas ekstrak BAL terhadap sel HeLa dapat dilihat dari persentase penghambatan yang terdapat pada Gambar 3. Hasil pengujian efek sitotoksik yang diberi perlakuan mulai dari konsentrasi ekstrak 3 μg/mL hingga 200 μg/mL terhadap sel lestari HeLa pada ekstrak intraseluler L. plantarum IIA-1A5 menunjukkan adanya fenomena dose dependent response, dimana efek toksisitas meningkat seiring dengan meningkatnya konsentrasi ekstrak yang diberikan.
10
Gambar 3. Persentase penghambatan ekstrak (A) L. plantarum IIA-1A5 dan (B) L. acidophilus IIA-2B4 terhadap sel HeLa
Ekstrak ekstraseluler L. plantarum IIA-1A5 dan L. acidophilus IIA-2B4 persen penghambatannya tidak bergantung pada tingkat konsentrasi yang diberikan. Ekstrak ekstraseluler L .plantarum IIA-1A5 yang menyebabkan kematian sel HeLa tertinggi sebesar 15.63% terdapat pada konsentrasi 50 μg/mL sedangkan untuk L. acidophilus IIA-2B4 terdapat pada konsentrasi 200 μg/mL sebesar 18.13 %. Pada konsentrasi sekitar 3 sampai 50 μg/mL ekstrak ekstraseluler L. plantarum IIA-1A5 menunjukkan peningkatan persen penghambatan, namun setelah penambahan ekstrak sebesar 75 sampai 200 μg/mL terjadi penurunan persen penghambatan. Hal ini menunjukkan bahwa tidak semua ekstrak bakteri asam laktat memiliki kenaikan aktivitas penghambatan seiring dengan pemberian konsentrasi, malah sebaliknya pada konsentrasi tertentu ekstrak bakteri asam laktat dapat memicu perkembangan sel kanker
Aktivitas penghambatan sebesar 74.16% pada intraseluler L. acidophilus IIA-1A5 merupakan aktivitas penghambatan proliferasi yang tertinggi terhadap sel HeLa. Beberapa penelitian sebelumnya juga mengemukakan BAL seperti Lactobacillus mempunyai efek sitoksisitas (Lee et al. 2004; Kim et al. 2002). Lactobacilli dan Bifidobacteria adalah bakteri yang paling menonjol yg digunakan sebagai bakteri probiotik, dan telah diterima untuk meningkatkan perhatian penelitian tentang pencegahan kanker (Wang et al. 2014). Beberapa komponen bakteri yang mempunyai efek sitoksisitas dihasilkan oleh peptidoglikan, dan komponen membran dari dinding sel bakteri asam laktat seperti Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, dan Bifidobacterium (Fichera & Giese 1994; Kim et al. 2002).
11 terhadap sel kanker. L. acidophilus 606 menunjukkan hasil yang lebih efektif menghambat sel kanker HeLa dibandingkan dengan L. casei ATCC 393. Hasil-hasil penelitian terhadap penghambatan proliferasi sel lestari HeLa dilaporkan oleh Sadeghi-Aliabadi et al. (2014) menunjukkan hasil bahwa ekstrak ekstraseluler pada L. plantarum strain A7 mempunyai efek penghambatan sebesar 91.4% dengan konsentrasi 10000 µg/ml terhadap beberapa jenis sel kanker. Hal ini menunjukkan bahwa hasil penelitian yang telah dilakukan lebih tinggi dengan persen penghambatan sebesar 18,13 % dengan konsentrasi 200µg/ml. Kemudian Nandhini & Palanisamy (2013) juga melaporkan bahwa susu yang telah difermentasi dengan bakteri L. plantarum JQ255472 dan L. paracasei JQ255473 mempunyai persen penghambatan sebesar 90% dengan konsentrasi 240 µg/ml.
Persentase penghambatan sel lestari HeLa terhadap ekstrak intraseluler L. plantarum dan L. acidophilus jauh lebih tinggi dibanding dengan metabolit ekstraseluler dapat disebabkan akibat penambahan lisozim dalam melisis dinding sel. Kovacs-Nolan et al. (2005) selain memiliki kemampuan dalam menghambat antimikroba yang dapat digunakan sebagai pengawet makanan lisozim juga dapat bertindak sebagai immunomodulator dan memiliki kemampuan dalam menekan sel tumor. Oleh karena itu, lisozim dapat digunakan sebagai agen sitoksisitas.
Suatu senyawa dapat bersifat toksik pada sel kanker dengan beberapa mekanisme yang berbeda, yaitu melalui efek antiproliferasi, penghambatan siklus sel, penghambatan angiogenesis, pengrusakan sel secara langsung yang menyebabkan nekrosis, serta induksi apoptosis. Semua proses ini merupakan efek toksik yang pada akhirnya menimbulkan kematian pada sel kanker (Ren et al. 2003). Hasil penelitian ini menunjukkan kemampuan zat uji sebagai anti kanker yang ditunjukan dengan sifat sitotoksik yang kuat, mampu menghambat proliferasi sel dan kemungkinan mampu memacu apoptosis.
Kemampuan tersebut kemungkinan dikarenakan adanya senyawa aktif yang terkandung dalam zat uji. Ghan et al. (2014) mengemukakan senyawa eksopolisakarida yang dihasilkan oleh L. acidophilus memiliki aktivitas antitumor. Komponen polisakarida terlarut yang terdapat pada bakteri strain Lactobacillus menunjukkan aktivitas penghambatan di lini sel kanker dan dinding sel (peptidoglikan) juga memiliki aktivitas anti-kanker (Kim et al. 2015). Selain itu, telah dilaporkan bahwa fraksi polisakarida yang berasal dari Lactobacillus strain (Oda et al. 1983) dan glikoprotein yang ditemukan di supernatan Lactobacillus (Manjunath & Ranganathan 1989; Yeon 2002) memiliki efek yang sama
12
Nilai Median Inhibition Concentration (IC50)
Data uji aktivitas sitoksisitas menunjukkan bahwa ekstrak kasar metabolit tiap bakteri memiliki nilai IC50 yang berbeda-beda. Nilai IC50 ekstrak bakteri asam
laktat dapat dilihat pada Tabel 3. Tabel 3. Nilai IC50 ekstrak BAL
Jenis Bakteri Nilai IC50 (µg/mL)
Intraseluler Ekstraseluler
L. plantarum IIA-1A5 352.627 1341.3
L. acidophilus IIA-2B4 120.976 421.812
Aktivitas sitotoksitas ekstrak bakteri asam laktat terhadap kultur sel HeLa diketahui melalui nilai IC50 (Median Inhibition Concentration). Berdasarkan
hubungan dari kurva persentase kematian sel HeLa dan konsentrasi ekstrak diperoleh nilai IC50. Menurut National Cancer Institut (NCI) nilai IC50 adalah
konsentrasi ekstrak yang diperlukan untuk menghambat pertumbuhan sel kanker sebesar 50% (Boyd et al. 1992). Nilai IC50 ekstrak bakteri memiliki kisaran 1341
μg/mL hingga 120 μg/mL (Tabel 3). Klasifikasi aktivitas sitotoksik ekstrak terhadap sel kanker dapat digolongkan mejadi tiga, yaitu kategori sangat toksik jika nilai IC50 < 10 μg/mL, kategori toksik jika nilai IC50 10-100 μg/mL, dan
kategori cukup toksik jika nilai IC50 100-500 μg/mL (Weerapreeyakul et al. 2012).
Berdasarkan klasifikasi tersebut, ekstrak intraseluler L. acidophilus IIA-2B4 yang memiliki nilai 120 μg/mL mempunyai aktivitas sitotoksik yang tergolong cukup toksik terhadap sel lestrai HeLa. Menurut Bueno et al. (2013) suatu ekstrak yang memiliki nilai IC50 300 μg/mL berpotensi sebagai chemopreventif agent terhadap
sel kanker.
Nilai IC50 yang tinggi menunjukkan aktivitas sitoksisitas hasil ekstraksi
BAL sangat lemah terhadap sel HeLa, dikarenakan ekstrak dari bakteri asam laktat masih terdiri dari beberapa fraksi yang memiliki aktivitas yang berbeda-beda, proses fraksinasi yang dilakukan belum optimal dan belum menghasilkan senyawa tunggal, sehingga apabila ingin diperoleh nilai IC50 yang lebih rendah
perlu dilakukan permunian terhadap komponen bakteri asam laktat yang dihasilkan. Sel HeLa diduga mempunyai sifat resisten terhadap senyawa-senyawa bioaktif yang terdapat dalam protein bakteri asam laktat.
Morfologi Sel HeLa
13
(a) (b)
(c) (d)
(e)
Gambar 4. Morfologi sel HeLa terhadap efek sitotoksik ekstrak (a) intraseluler (b) ekstraseluler L. plantarum IIA-1A5 dan (c) intraseluler (d) ekstraseluler L. acidophilus IIA-2B4 dengan konsentrasi yang sama 200 μg/mL dan (e) kontrol perbesaran 100x
14
4 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Ekstrak intraseluler dan ekstraseluler L. plantarum IIA-1A5 dan L. acidophilus IIA-2B4 mempunyak efek sitotoksiktas terhadap sel kanker serviks HeLa. Persentase penghambatan terbesar terdapat pada ekstrak intraseluler L. acidophilus IIA-2B4 dengan konsentrasi 200 µg/mL yang dapat menghambat pertumbuhan sel HeLa sebesar 74.16%. Ekstrak L. acidophilus IIA-2B4 memiliki nilai IC50 sebesar 120.976 μg/mL yang dapat diklasifikasikan kedalam kategori
cukup toksik.
Saran
Perlu dilakukan pemurnian ekstrak BAL untuk mendapatkan senyawa yang lebih murni sehingga mendapatkan nilai IC50 yang lebih rendah dan
15
DAFTAR PUSTAKA
Abed TA. 2013. Evaluation of methods for the extraction and purification of DNA of cultured Lactobacillus colony isolated from dairy products. Int J of Applied Microbiology and Biotechnology Research. 1: 20-25.
ACS. 2012. Cancer Facts & Figures 2012. Atlanta (US): American Cancer Soc. Aggarwal P. 2014. Cervical cancer: Can it be prevented?. World J Clin Oncol. 5:
775–780.
Arief II, Jenie BSL, Astawan M, Witarto AB. 2010. The effectivities of probiotic Lactobacillus plantarum 2C12 and Lactobacillus acidophilus 2B4 as antidiarrhea on rats. Med Pet 33:137-143.
Arief II, Jenie BSL, Suryati T, Ayuningtyas G, Fuziawan A. 2012. Antimicrobial activity of bacteriocin from indigenous Lactobacillus plantarum 2C12 and its application on beef meatball as biopreservative. J Indonesian Trop Anim Agric. 37: 90-96.
Arief II, Jakaria, Suryati T, Wulandari Z, Andreas E. 2013. Isolation and characterization of plantaricin produced by Lactobacillus plantarum strains (IIA-1A5, IIA-1B1, IIA-2B2). Med Pet. 36: 91-100.
Arief II, Wulandari Z, Aditia EL, Baihaqi M, Noraimah, Hendrawan. 2014. Physicochemical and microbiological properties of fermented lamb sausages using probiotic Lactobacillus plantarum IIA-2C12 as starter culture. Proc Environ Sci. 20: 352-356.
Arief II, Jenie BSL, Astawan M, Fujiyama K, Witarto AB. 2015. Identification and probiotic characteristics of lactic acid bacteria isolated from Indonesian local beef. Asian J Anim Sci. 9: 25-36.
Astawan MT, Wresdiyati, Arief II, Febiyanti D. 2011. Potency of indigenous probiotic lactis acid bacteria as antidiarrheal agent and immunomodulator. J Technol Food Ind. 22: 11-16.
Basse B, Baguley BC, Marshall ES, Joseph WR, Van Brunt B, Wake G, Wall DJ. 2004. Modelling cell death in human tumor cell lines exposed to the anticancer drug paclitaxel. J Math Biol. 49: 329–357.
Boyd MR, Paull KD, Rubinstein LR. 1992. Cytotoxic Anticancer Drugs: Models and Concepts for Drug Discovery and Development. F. A. Vleriote, T. H. Corbett, L. H. Baker, editor. Hingham (US): Kluwer Academic.
Bueno PR, Buno CBM, Santos DLM, Santiago LA. 2013. Antioxidant activity of Ficus pseudopalma balnco and its cytitoxity effect on hepatocelullar carcinoma and peripheral blood mononuclear cell. Curr Res in Bio Pharma Sci. 2(2):14-21.
Cancer Chemoprevention Research Center [CCRC]. 2000. Prosedur Tetap Uji Sitotoksis Metode MTT. Yogyakarta (ID): Fakultas Farmasi, Universitas Gajah Mada.
Choi SS, Kim Y, Han KS, You S, Oh S, Kim SH. 2005. Effects of Lactobacillus strains on cancer cell proliferation and oxidative stress in vitro. Letters in Applied Microbiology. 42: 452-458.
16
Freshey IR, 2000. Culture of Animal Cells. 4th edition. A Manual Basic Technique. New York: John Wiley.
Fuller R. 1991. Probiotics in human medicine. Gut. 32: 439–442.
Gaspers V. 1991. Analysis Techniques in Experimental Research. Tarsito, Bandung
Ghan KAE, Elhafez EA, Hamouda RA. 2014. Evaluation of antioxidant and antitumor avtivities of Lactobacillus acidophilus bacteria isolated from Egyptian infants. Int J Pharm. 10: 282-288.
Haghshenas BY, Nami YN, Abdullah N, Radiah D, Rosli R, Khosroushahi AY. 2015. Anticancer impacts of potentially probiotic acetic acid bacteria isolated from traditional dairy microbiota. LWD-Food Sci Technol. 60: 690–697.
Hahn DB, Payne WA . 2003. Focus on Health. New York, Mc-Graw Hill.
Havsteen B. 1983. Flavonoid, a class of natural products of high pharmacological potency. Biochem Pharm. 32: 1141-1148.
Iwai K, Kishimoto N, Kakino Y, Mochida K, Fujita T. 2004. In vitro antioxidative effects and tyrosinase inhibitory activities of seven hydroxycinnamoyl derivatives in green coffee beans. J Agric Food Chem. 52: 4893–4898. Jess PR, Smith DD, Mazilu M, Dholakia K, Riches AC, Herrington CS. 2007.
Early detection of cervical neoplasia by Raman spectroscopy. Int J Cancer. 121: 2723-8.
Kannu KD, Rani KS, Jothi RA. 2014. In-vivo anticancer activity of red algae (Gelidiela acerosa and Acanthopora spicifera). Int J Pharm Sci Res. 2014 : 3347-3352.
Kato I, Endo K, Yokokura T. 1994. Effects of oral administration of Lactobacillus casei on antitumor responses induced by tumor resection in mice. Int J Immunopharmacol. 16: 29–36.
Kenneth FH, Annemette VT, Maxwell S, Peter BJ. 2005. Dexrazoxane protects against myelosuppression from the DNA cleavage-enhancing drugs etoposide and daunorubicin but not doxorubicin. Clin Cancer Res. 2005. 11: 3915–3924.
Kia KW, Arief II, Sumantri C, Budiman C. 2016. Plantaricin IIA-1A5 from L. plantarum IIA-1A5 retards pathogenic bacteria in beef meatball stored at room temperature. Am J Food Technol. 11: 37-43.
Kim JY, Woo HJ, Kim YS, Lee HJ. 2002. Screening for antiproliferative effects of cellular components from lactic acid bacteria against human cancer cell lines. Biotechnol Lett. 24: 1431–1436.
Kim SN, Lee WM, Park KS, Kim JB, Han DJ, Bae J. 2015. The effect of Lactobacillus casei extract on cervical cancer cell lines. Contemporary Oncol. 19(4): 306-312.
Kovacs-Nolan JKM, Phillips M, Mine Y. 2005. Advances in the value of eggs and egg components for human health. J Agric Food Chem. 53: 8421–8431. Laemmli UK. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the
head of bacteriophage T4. Nature. 227: 680-685.
17 Li K, Li Q, Zhang T, Han Z, Li J, Liu Z, Zheng F. 2011. Procyanidins from Pinus koraiensis bark inhibits HeLa cell growth by inducing apoptosis and reducing survivin protein expression. Afr J Biotechnol. 10(40):7766-7771. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farrar AL, Randall RJ. 1951. Protein measurement
with the folin phenol reagent. J Biol Chem. 193: 265-275.
Manjunath N, Ranganathan B. 1989. A cytotoxic substance produced by a wild culture of Lactobacillus casei D-34 against tumor cells. Indian J Exp Biol. 27: 141–145.
Nami YN, Abdullah, Haghshenas B, Radiah D, Rosli R, Khosroushahi AY. 2014a. Assessment of probiotic potential and anticancer activity of newly isolated vaginal bacterium Lactobacillus plantarum 5BL. Microbiol Immunol. 58:492–502.
Nami YN, Abdullah, Haghshenas B, Radiah D, Rosli R, Khosroushahi AY. 2014b. Probiotic potential and biotherapeutic effects of newly isolated vaginal Lactobacillus acidophilus 36YL strain on cancer cells. Anaerobe Microbiology. 2: 29-36.
Nandhini B, Palaniswamy MP. 2013. Anticancer effets of goat milk fermented by Lactobacillus plantarum and Lactobacillus paracasei. Int J of Pharmacy and Pharmaceutica Sci. 5(3): 898-901.
NCI. 2012. Cancer Treatment. National Cancer Institut. Downloaded from June 03, 2016 on http://www.cancer.gov/ cervix/page8.
Oda M, Hasegawa H, Komatsu S, Kambe M, Tsuchiya F. 1983. Antitumor polysaccharide from Lactobacillus sp. Agr Biol Chem. 47: 1623–1625. Pala V, Sieri S, Berrino F, Vineis P, Sacerdote C, Palli D, Masala G, Panico S,
Mattiello A, Tumino R, Giurdanella MC, Agnoli C, Grioni S, Krogh V. 2011. Yogurt consumption and risk of colorectal cancer in the italian european prospective investigation into cancer and nutrition cohort. Int J Cancer. 129: 2712–2719.
Phongsavan K, Gustavsson I, Marions L, Phengsavanh A, Wahlström R, Gyllensten U. 2012. Detection of human papillomavirus among women in Laos: feasibility of using filter paper card and prevalence of high-risk types. Int J Gynecol Cancer. 22: 1398-406.
Ren W, Qiao Z, Wang H, Zhu L, Zhang L. 2003. Flavonoid: promising anticancer agents. Med Res Rev. 23(4): 519-534.
Ringø E, Gatesoupe FJ. 1998. Lactic acid bacteria in fish: a review. Aquaculture. 160: 177-203.
Sadeghi-Aliabadi H, Mohammadi F, Fazeli H, Mirlohi M. 2014. Effects of Lactobacillus plantarum A7 with probiotic potential on colon cancer and normal cells proliferation in comparison with a commercial strain. Iranian J of Basic Medical Sci. 17: 10.
Siegel R, Naishadham D, Jemal A. 2012. Cancer statistics. Cancer J Clin. 62: 10-29.
Vamanu A, Vamanu E, Drugulescu M, Popa O, Campeanu G. 2006. Identification of a lactic bacterium strain used for obtaining a pollen-based probiotic product. Turk J Biol. 30: 75–80.
Waluyo L. 2008. Teknik Metode Dasar dalam Mikrobiologi. UMM Press, Malang. Wang SM, Zhang LW, Fan RB, Han X, Yi HX, Zhang LL, Xue CH, Li HB,
18
Lactobacilli isolated from fermented products. Res Microbiology. 165: 202–214.
Weerapreeyakul N, Nonpunya A, Barusrux S, Thitimetharoch T, Sripanidkulchai B. 2012. Evaluation of the anticancer potential of six herbs against a hepatoma cell line. Chinese Medicine. 7(15): 1-7.
WHO. 2010. Globocan Stats Section of Cancer Information. Cancer. WHO.
Downloaded from June 03, 2016 on
http://www.who.int/about/copyright/en/.
Wilson CM, Tobin S, Young RC. 2004. The exploding worldwide cancer burden: The impact of cancer on women. Int J Gynecol Cancer. 14: 1–11.
Yang CS, Landau JM, Huang MT, Newmark HL. 2001. Inhibition of carcinogenesis by dietary polyphenolic compounds. Annu Rev Nutr. 21: 381–406.
Yeon KJ, Woo HJ, Kim KH, Kim ER, Jung HK, Juhn HN, Lee HJ. 2002. Antitumor activity of Lactobacillus plantarum Cytoplasm in teratocarcinoma bearing mice. J Microbiology and Biotechnology. 12(6): 998-10001.
19
20
Lampiran 1. Perhitungan konsentrasi protein BAL
Sampel Absorban Intra 1A5 U1 0.1491 8.92 1 8.92 1783.73 2675.59 Intra 1A5 U2 0.1305 7.34 1 7.34 1467.80 2201.70 Intra 1A5 U3 0.1540 9.34 1 9.34 1867.12 2800.68
Rata-Rata 8.53 1706.22 2559.32 Intra 2B4 U1 0.1702 10.71 1 10.71 2141.02 3211.53 Intra 2B4 U2 0.1425 8.36 1 8.36 1671.36 2507.03
Rata-Rata 9.53 1906.19 2859.28 Extra 1A5 U1 0.0721 2.39 1 2.39 47.82 143.46 Extra 1A5 U2 0.0855 3.53 1 3.53 70.65 211.96 Extra 1A5 U3 0.0724 2.42 1 2.42 48.38 145.13
Rata-Rata 2.78 55.62 166.85 Extra 2B4 U1 0.0754 2.67 1 2.67 53.40 160.21 Extra 2B4 U2 0.0844 3.43 1 3.43 68.72 206.17 Extra 2B4 U3 0.0855 3.53 1 3.53 70.62 211.88
Rata-Rata 3.10 64.25 192.75
21
