TRANSFORMASI GENETIK KENTANG
(
Solanum tuberosum
L.) KULTIVAR KENNEBEC DENGAN
GEN
Hd3a
EKA MAULANI
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Transformasi Genetik Kentang (Solanum tuberosum L.) Kultivar Kennebec dengan Gen Hd3a adalah benar karya bersama saya dan komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.
Bogor, Pebruari 2015
Eka Maulani
ABSTRAK
Eka Maulani. Transformasi Genetik Kentang (Solanum tuberosum L.) Kultivar Kennebec dengan Gen Hd3a. Dibimbing oleh SUHARSONO dan UTUT WIDYASTUTI.
Kentang merupakan salah satu tanaman hortikultura yang ditanam secara luas di dunia. Kentang mengandung karbohidrat yang tinggi dan asam amino esensial yang baik untuk nutrisi manusia sehingga dapat digunakan sebagai salah satu bahan diversifikasi pangan. Pembungaan sangat penting untuk perakitan varietas baru melalui persilangan seksual. Hd3a dapat menginduksi pembungaan pada beberapa spesies dan menginduksi pembentukan umbi pada kentang kultivar Andigena. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk melakukan transformasi genetik kentang (Solanum tuberosum L.) kultivar Kennebec dengan gen Hd3a dibawah kendali promoter rolC. Transformasi genetik dilakukan melalui bantuan
Agrobacterium tumefaciens LBA4404 yang mengandung plasmid p2KI-Hd3a
dengan metode ko-kultivasi. Ruas tanaman digunakan sebagai eksplan. Seleksi terhadap kalus dan tunas transgenik putatif dilakukan dengan media MS 20 mg/L higromisin. Hasil penelitian menunjukkan bahwa transformasi terhadap kentang kultivar Kennebec menghasilkan efisiensi transformasi sebesar 20%, sedangkan efisiensi regenerasi sebesar 100%. Penelitian ini menghasilkan dua tunas transgenik putatif.
Kata kunci: Hd3a, kultivar Kennebec, Solanum tuberosum L., transformasi genetik
ABSTRACT
Eka Maulani. Genetical Transformation of Potato (Solanum tuberosum L.) Kennebec Cultivar with Hd3a Gene. Supervised by SUHARSONO and UTUT WIDYASTUTI.
Potato is one of the most important horticultural crops. This commodity is cultivated in many area in the world. It contains high carbohydrate and essential amino acid which are important nutrition for human, so it can be used for food diversification. Flowering has an important role in the creation of new varieties through sexual crossing. Hd3a induces flowering in several species and tuber formation of potato cultivar Andigena. The objective of this research was to transform genetically the potato (Solanum tuberosum L.) cultivar Kennebec with
Hd3a gene under the control of rolC promoter. Transformation of potato was done by using Agrobacterium tumefaciens LBA4404 containing p2KI-Hd3a
plasmid by co-cultivation method using internodes as explants. Putative transgenic calli and shoots were selected in the MS medium containing 20 mg/L of hygromycin. The efficiency of transformation was 20 % and the efficiency of regeneration of putative transgenic shoot was 100%. This research resulted two putative transgenic shoots.
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains
pada
Departemen Biologi
TRANSFORMASI GENETIK KENTANG
(
Solanum tuberosum
L.) KULTIVAR KENNEBEC DENGAN
GEN
Hd3a
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Penelitian ini berjudul Transformasi Genetik Kentang (Solanum tuberosum L.) Kultivar Kennebec dengan Gen Hd3a. Penelitian dilaksanakan sejak bulan Januari sampai dengan September 2014.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Prof Dr Ir Suharsono, DEA dan Dr Ir Utut Widyastuti, MSi selaku pembimbing atas bimbingan, saran, dan ilmu yang bermanfaat selama melaksanakan penelitian ini. Terima kasih kepada Dr Berry Juliandi, MSi selaku penguji atas saran dan masukan pada tulisan ini. Terima kasih kepada Kepala Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi LPPM IPB beserta seluruh staf dan jajarannya atas sarana, prasarana, dan bantuannya selama penulis melakukan penelitian di laboratorium BIORIN dan Biologi Molekuler Seluler Tanaman. Penulis juga menyampaikan terima kasih kepada Nia Dahniar SP, Pepi Elvavina, Abdul Mulya, Sairi, Yulianto, Sarah, Asep Saripudin atas bantuan dan masukannya. Terima kasih kepada rekan-rekan seperjuangan yaitu Bustomi, Ika, Ica, Lisa, Ina, Dwika, Aditya, Carin, Kak Isni, Mas Ari, Mas Baso, Mas Rudi, Kak Destik, Kak Effa, Kak Wiwin, Kak Fajri, dan Kak Tiwi atas ilmu, bimbingan, dan kerjasama yang diberikan. Terima kasih pula untuk seluruh teman-teman Biologi 47, OWA 13, rekan-rekan seperjuangan di Pondok Pink Muss (Rahma, Wulan dan Indah) atas segala masukan dan semangatnya. Ungkapan terima kasih yang tak terhingga penulis sampaikan kepada keluarga tercinta khususnya kepada ibunda dan ayahanda, Hoesni dan Nunung Kartini, adik-adikku yang tersayang Akhyat Maulana dan Akmal Firdausi atas segala do’a, dukungan dan kasih sayang yang telah diberikan.
Akhir kata, penulis berharap agar karya ilmiah ini dapat bermanfaat dan dapat memberikan sumbangan bagi perkembangan ilmu pengetahuan.
Bogor, Pebruari 2015
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL vi
DAFTAR GAMBAR vi
DAFTAR LAMPIRAN vi
PENDAHULUAN 1
Latar Belakang 1
Tujuan Penelitian 2
BAHAN DAN METODE 2
Waktu dan Tempat 2
Bahan 2
Metode 3
Perbanyakan tanaman in vitro 3
Perbanyakan Agrobacterium tumefaciens 3
Transformasi genetik kentang kultivar Kennebec 3
HASIL DAN PEMBAHASAN 4
Pembentukan kalus 4
Pembentukan tunas transgenik putatif 5
SIMPULAN DAN SARAN 8
Simpulan 8
Saran 8
UCAPAN TERIMA KASIH 8
DAFTAR PUSTAKA 8
LAMPIRAN 10
DAFTAR GAMBAR
1 Peta daerah T-DNA yang mengandung gen Hd3a dan gen hpt didalam
plasmid p2KI-Hd3a 3
2 Kalus kentang kultivar Kennebec yang terbentuk di media induksi kalus yang berumur 2 minggu setelah ko-kultivasi dengan A.
tumefaciens 5
3 Regenerasi tunas kentang kultivar Kennebec dari kalus transgenik
putatif yang berumur 3 minggu 5
4 Tunas kentang kultivar Kennebec yang diseleksi dengan media yang
mengandung 20 mg/L higromisin 6
5 Uji viabilitas tanaman kentang non-transgenik di media non selektif
dan media selektif 7
DAFTAR LAMPIRAN
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Hortikultura merupakan bagian dari sektor pertanian yang terdiri atas sayuran, buah-buahan, dan tanaman hias. Hortikultura menjadi sektor yang sangat penting bagi pertanian, karena mempunyai nilai ekonomi yang tinggi. Komoditas hortikultura, khususnya sayuran dan buah-buahan berperan penting dalam pemenuhan kebutuhan pangan manusia. Kentang merupakan salah satu komoditas hortikultura yang penting untuk pangan. Di Indonesia kentang termasuk kedalam 35 komoditas unggulan nasional yang mendapat prioritas pengembangan oleh pemerintah. Kentang merupakan tanaman sayuran musiman yang berbentuk semak dan perdu, serta berumur pendek (Andarwati 2011). Tanaman ini berasal dari Amerika Selatan (Peru, Chili, Bolivia, dan Argentina) dan beberapa daerah di Amerika Tengah (Hawkes 1990).
Kentang mengandung karbohidrat yang tinggi dan asam amino esensial yang baik untuk nutrisi manusia. Cuaca sangat berpengaruh terhadap tanaman kentang. Suhu rendah (15-20oC), kelembaban udara tinggi dan sinar matahari yang cukup, serta sedikit hujan merupakan syarat yang baik untuk pertumbuhan, pembungaan dan pembentukan umbi (Sahat 1991).
Bunga mempunyai peranan yang sangat penting dalam perakitan varietas baru melalui persilangan. Kentang kultivar Kennebec mempunyai karakteristik yang sangat cocok sebagai kentang olahan khususnya french fries, sehingga kultivar ini sangat potensial dijadikan sebagai sumber gen dan disilangkan dengan kultivar lainnya. Tanaman kentang kultivar Kennebec dikembangkan oleh Departemen Pertanian Amerika Serikat dan dilepas pada tahun 1948 dari persilangan USDA 127x96-56. Kentang kultivar Kennebec memiliki batang yang panjang dan lebar, serta daun yang berwarna hijau gelap dan umbi yang berbentuk lonjong (Smith 1968).
Pembungaan merupakan hasil transisi pucuk meristem tanaman dari fase vegetatif ke fase reproduktif. Pertumbuhan bunga suatu jenis tanaman sangat dipengaruhi oleh lama penyinaran yang diperoleh ditempat tumbuhnya. Untuk menghasilkan bunga, tanaman kentang memerlukan panjang hari sekitar 16-18 jam (Sahat 1991).
Gen Hd3a menyandi suatu protein yang menginduksi gen-gen pembungaan. Gen Hd3a pertama kali diidentifikasi sebagai quantitative trait locus (QTL) yang proteinnya menginduksi pembungaan padi dibawah kondisi hari pendek (Monna
et al. 2002). Ekspresi berlebihan (over expression) gen Hd3a dengan promoter konstitutif (Kojima et al. 2002) atau promoter spesifik (Tamaki et al. 2007) menghasilkan pembungaan dini. Supresi Hd3a dengan RNA interference (RNAi) menunda pembungaan (Komiya et al. 2008). Hal ini menunjukkan bahwa Hd3a
berperan penting dalam menginduksi pembungaan.
Penemuan gen pembungaan ini memungkinkan dilakukannya rekayasa genetik untuk berbagai keperluan. Tanaman transgenik yang mengandung gen
Hd3a sampai saat ini telah mampu untuk menginduksi pembungaan pada beberapa spesies seperti Saussurea involucrate (Li et al. 2011), Jatropha curcas
2
2013). Selain menginduksi pembentukan bunga, Hd3a juga menginduksi pembentukan umbi pada kentang kultivar Andigena (Navarro et al. 2011). Introduksi gen Hd3a kedalam kentang kultivar Baraka telah menghasilkan tanaman transgenik putatif yang berumbi lebih awal dari pada tanaman non- transgenik (Bustomi 2014). Pada penelitian ini, gen Hd3a dibawah kendali promoter rolC diintroduksikan kedalam genom kentang kultivar Kennebec.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk melakukan transformasi genetik kentang (Solanum tuberosum L.) kultivar Kennebec dengan gen Hd3a di bawah kendali promoter rolC.
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Januari sampai dengan September 2014 di Laboratorium Biotechnology Research Indonesia-The Netherlands
(BIORIN), dan Laboratorium Biologi Molekuler dan Seluler Tanaman (BMST) di Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB), Lembaga Penelitian dan Pengabdian kepada Masyarakat (LPPM), Institut Pertanian Bogor.
Bahan
Bahan yang digunakan berupa tanaman kentang kultivar Kennebec in vitro
yang digunakan sebagai bahan tanaman untuk transformasi genetik. Media tumbuh MS (Murashige and Skoog 1962) (Lampiran 1) digunakan sebagai media dasar kultur in vitro dan media MS yang mengandung higromisin sebagai media seleksi. Agrobacterium tumefaciens galur LBA4404 yang mengandung plasmid p2KI-Hd3a dan membawa gen Hd3a di bawah kendali promoter rolC (Tamaki et al. 2007), digunakan untuk melakukan transformasi genetik. Gen Hd3a berasal dari pemberian Prof. Ko Shimamoto (Nara Institute of Science & Technology,
3
Gambar 1 Peta daerah T-DNA yang mengandung gen Hd3a dan gen hpt di dalam plasmid p2K1-Hd3a. LB: left border, RB: right border, rolC: promoter dari Agrobacterium rhizogenes, Hd3a: gen heading date dari padi, GFP: gen penanda Green Fluorescent Protein, hpt: gen resistensi terhadap higromisin (Tamaki et al. 2007).
Metode
Perbanyakan tanaman in vitro. Tanaman kentang diperbanyak secara in vitro dengan menggunakan stek buku (node) tunggal yang terdiri dari satu mata tunas yang ditanam pada media MS (Murashige dan Skoog 1962) tanpa zat pengatur tumbuh (MS0) dan MS2 makro yaitu MS yang mengandung dua kali konsentrasi unsur hara makro ditambah 2 mg/L pantothenic acid selama 4 minggu. Eksplan ditumbuhkan di ruang kultur pada suhu 20 oC, dengan pencahayaan 2000-3000 lux dan fotoperiode 16 jam.
Perbanyakan Agrobacterium tumefaciens. Agrobacterium tumefaciens
strain LBA4404 yang mengandung plasmidp2KI-Hd3a (Tamaki et al. 2007) yang berasal dari stok gliserol dibiakkan di dalam media LB cair (1% tripton, 0,5%
yeast extract, 1% NaCl) yang mengandung 50 mg/L kanamisin dan 20 mg/L rifampisin, digoyang dengan kecepatan 150 rpm di dalam ruang gelap pada suhu 28 oC. Sebanyak 100 µ L dari biakan tersebut kemudian dibiakkan kembali di dalam 10 mL media LB cair dengan kondisi yang sama dengan sebelumnya hingga mencapai OD600=0.5-0.7.
Transformasi genetik kentang kultivar Kennebec. Transformasi dilakukan melalui metode ko-kultivasi dengan menggunakan bantuan A. tumefaciens. Sebelum ko-kultivasi, biakan A. tumefaciens disentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm selama 15 menit dan endapannya diresuspensi dengan media ko-kultivasi cair (media MS yang mengandung 0,5 mg/L BAP dan 0,1 mg/L IAA) hingga OD600 0.5-0.7. Eksplan ruas (internode) dengan ukuran 0.5 cm - 1 cm direndam dalam A. tumefaciens OD600 0.5-0.7, digoyang dengan kecepatan 100 rpm pada suhu ruang selama 10 menit. Eksplan dikering anginkan dengan tisu steril, kemudian eksplan ditanam di media ko-kultivasi selama 3 hari di ruang gelap pada suhu 25 oC. Setelah itu eksplan dicuci dengan air steril dan cefotaxime
100 mg/L, kemudian ditanam di media induksi kalus yaitu MS yang mengandung 1 mg/L BAP selama 2 minggu. Kalus yang terbentuk kemudian ditanam di media yang sama lalu ditambah dengan 20 mg/L higromisin sebagai agen seleksi selama 2 minggu. Kalus yang hidup ditanam di media regenerasi yaitu MS yang mengandung 0.1 mg/L BAP dan 20 mg/L higromisin. Eksplan yang menghasilkan kalus resisten higromisin dan kalus yang menghasilkan tunas transgenik putatif
4
dihitung untuk mengetahui efisiensi transformasi dan efisiensi regenerasinya. Efisiensi transformasi dan regenerasi dihitung berdasarkan rumus yang disajikan pada Lampiran 2.
Eksplan non-transgenik (kontrol) yang tidak ditransformasi dengan A. tumefaciens ditanam dalam media yang tidak mengandung agen seleksi dan media seleksi yang mengandung higromisin sebagai kontrol positif dan kontrol negatif.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pembentukan kalus
Eksplan ruas yang diko-kultivasi dengan A. tumefaciens LBA4404 yang mengandung plasmid p2K1-Hd3a mulai membentuk kalus pada minggu ke-2 (Gambar 2). Kalus terbentuk pada kedua ujung eksplan. Kalus yang ditanam di media seleksi sebanyak 10 eksplan dan diperoleh hanya 2 kalus yang dapat tumbuh karena resisten terhadap higromisin sehingga efisiensi transformasi pada penelitian ini adalah 20%. Kedua kalus tersebut disebut sebagai kalus transgenik putatif. Sedikitnya jumlah kalus yang ditanam di media seleksi ini karena sebagian eksplan ruas mengalami kontaminasi pada saat ditanam di media induksi kalus. Selain itu, kentang kultivar Kennebec sangat sulit untuk membentuk kalus, sehingga tidak semua eksplan ruas dapat membentuk kalus untuk diseleksi.
Efisiensi transformasi pada penelitian ini lebih besar dibandingkan dengan transformasi kentang kultivar Baraka dengan gen yang sama (Hd3a), yaitu 16.36% (Bustomi 2014) dan transformasi kentang kultivar Atlantik dengan gen penyandi lisozim yaitu 16.67% (Manguntungi 2014), tetapi lebih kecil dibandingkan dengan transformasi Jatropha curcas dengan gen Hd3a yaitu 26.67% (Sulistyaningsih 2012) dan Nicotiana benthamiana dengan gen Hd3a
yaitu 86% (Syafitri 2012). Perbedaan efisiensi transformasi ini disebabkan oleh beberapa faktor antara lain genotipe tanaman, keefektifan asetosiringon, dan kondisi pH media ko-kultivasi. Selain itu, persentase efisiensi transformasi juga tergantung dari jumlah eksplan yang ditransformasi. Asetosiringon merupakan senyawa kimia yang berfungsi sebagai inducer spesifik dari ekspresi gen vir. Secara alami, pelukaan dapat menyebabkan sel tanaman menjadi rentan terhadap
Agrobacterium. Selain asetosiringon, ekspresi gen-gen vir juga sangat dipengaruhi oleh pH. pH optimum untuk ekspresi gen-gen vir berkisar 5-5.8 (Wattimena 1992). Perlakuan fisik pada saat proses transformasi mulai dari pemotongan eksplan, inokulasi eksplan dengan A. tumefaciens, pembilasan untuk membuang
A. tumefaciens yang menempel pada eksplan, dan perlakuan antibiotik cefotaxime
5
Gambar 2 Kalus kentang kultivar Kennebec yang terbentuk di media induksi kalus yang berumur 2 minggu setelah ko-kultivasi dengan A. tumefaciens (tanda panah)
Pembentukan tunas transgenik putatif
Kalus yang resisten terhadap 20 mg/L higromisin beregenerasi untuk membentuk tunas mulai umur 3 minggu setelah ditanam di media regenerasi yang konsentrasi BAPnya diturunkan menjadi 0.1 mg/L. Penurunan konsentrasi BAP ini penting agar kalus tidak tumbuh terus, tetapi mengalami diferensiasi membentuk organ. Kedua kalus transgenik putatif ini menghasilkan dua tunas transgenik putatif (Gambar 3) sehingga efisiensi regenerasi pada penelitian ini 100%. Setiap kalus hanya menghasilkan satu tunas transgenik putatif, sehingga penelitian ini menghasilkan 2 tunas transgenik putatif yang merupakan galur transgenik yang berbeda (independent transgenic line). Kedua tunas tersebut
kemudian dinamakan StK Hd3a-1 dan StK Hd3a-2.
Gambar 3 Regenerasi tunas kentang kultivar Kennebec dari kalus transgenik putatif yang berumur 3 minggu (tanda panah)
Regenerasi tanaman merupakan tahapan yang penting dalam transformasi. Keberhasilan regenerasi tanaman secara in vitro dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor antara lain genotipe, media, lingkungan tumbuh dan fisiologi jaringan tanaman sebagai eksplan (Wattimena 1992). Pada umumnya famili Solanaceae mudah diregenerasikan walaupun memiliki daya regenerasi yang berbeda.
1 cm
6
Efisiensi regenerasi kentang kultivar Kennebec ini sama dengan regenerasi kentang kultivar Baraka yaitu sebesar 100% dari 19 kalus yang resisten higromisin (Bustomi 2014), tetapi berbeda dengan kentang kultivar Atlantik dari 20 kalus yang tahan higromisin hanya 4 eksplan yang beregenerasi sehingga didapatkan efisiensi regenerasi sebesar 20% (Manguntungi 2014).
Tunas transgenik putatif kentang kultivar Kennebec kemudian dipisahkan dari kalusnya dan ditumbuhkan di media MS2 makro untuk membentuk akar yang mengandung 20 mg/L higromisin sebagai agen seleksi. Kedua tunas transgenik putatif dapat tumbuh baik di media tersebut dengan membentuk akar. Tunas non-transgenik kentang kultivar Kennebec juga ditumbuhkan di media yang sama sebagai pembanding. Hasilnya, tunas non-transgenik tidak dapat tumbuh ditandai dengan daunnya yang mengering karena mengalami klorosis dan sulit membentuk akar (Gambar 4).
Gambar 4 Tunas kentang kultivar Kennebec yang diseleksi dengan media yang mengandung 20 mg/L higromisin. (A) tunas transgenik, (B) tunas non-transgenik yang daunnya mengalami klorosis (tanda panah) Uji viabilitas eksplan digunakan untuk mengetahui eksplan viable pada media seleksi yang mengandung 20 mg/L higromisin. Tunas kentang non-transgenik ditanam di media non-selektif yang tidak mengandung higromisin dan media selektif yang mengandung higromisin. Tunas kentang non-transgenik yang ditanam di media yang tidak mengandung higromisin tumbuh dengan baik dengan membentuk daun dan akar sedangkan yang ditanam di media seleksi tidak dapat membentuk daun dan akar setelah lima minggu (Gambar 5). Hal ini menunjukkan bahwa tunas kentang non-transgenik mempunyai viabilitas yang baik dan 20 mg/L higromisin dapat digunakan sebagai agen seleksi kentang transgenik kultivar Kennebec yang mengandung gen penanda seleksi hpt. Konsentrasi 20 mg/L higromisin juga digunakan untuk menyeleksi padi transgenik (Wardana 2014). Pada kentang kultivar Atlantik, 10 mg/L higromisin dapat digunakan untuk menyeleksi kentang transgenik (Manguntungi 2014), tetapi seleksi kentang kultivar Baraka transgenik dilakukan dengan menggunakan 40 mg/L higromisin (Bustomi 2014), dan seleksi Nicotiana benthamina transgenik dilakukan dengan menggunakan 30 mg/L higromisin (Syafitri 2012; Senjaya 2013).
1 cm 1 cm
7
Gambar 5 Uji viabilitas tanaman kentang non-transgenik di media non selektif dan media selektif. A= tunas di media non-selektif yang tidak mengandung 20 mg/L higromisin, B= tunas di media selektif yang mengandung 20 mg/L higromisin yang mengalami kematian yang ditandai dengan daunnya yang mengering (tanda panah)
Resistensi terhadap higromisin dapat digunakan untuk menyeleksi tanaman yang mengandung gen hpt. Penggunaan gen hpt sebagai gen penanda seleksi pada transformasi genetik sangat penting untuk menyeleksi atau mendeteksi sel transgenik, yang menandakan bahwa gen sudah berada di dalam sel tanaman. Tanaman kentang yang mampu tumbuh dengan baik pada media seleksi higromisin adalah tanaman transgenik yang mengandung gen hpt. Hal ini menunjukkan bahwa tanaman kentang kultivar Kennebec telah berhasil ditransformasi dengan gen hpt. Karena gen hpt pada plasmid p2KI-Hd3a terpaut dengan gen Hd3a, maka tanaman transgenik yang resisten terhadap higromisin juga mengandung gen Hd3a, sehingga transformasi tanaman kentang kultivar Kennebec dengan gen Hd3a telah berhasil dilakukan.
Walaupun pada kentang kultivar Baraka, gen Hd3a dan promoter rolC yang sama dapat menginduksi pembentukan umbi tanaman in vitro (Bustomi 2014) tetapi pada penelitian ini tanaman kentang kultivar Kennebec transgenik putatif in vitro belum sampai pada tahap pembungaan maupun pengumbian. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh belum cukup umur untuk berbunga dan berumbi serta genotipe yang berbeda. Genotipe tanaman juga sangat berpengaruh terhadap ekspresi suatu gen. Penelitian Navarro et al. (2011) menunjukkan bahwa gen
Hd3a dibawah kendali promoter rolC juga dapat menginduksi pembungaan dan pembentukan umbi pada kentang kultivar Andigena. Kentang kultivar Andigena dapat berbunga dan berumbi pada hari pendek tetapi tidak berbunga dan tidak berumbi di hari panjang. Ekspresi berlebih gen Hd3a, menyebabkan kentang Andigena dapat berbunga dan berumbi di hari panjang. Hal ini menunjukkan bahwa Hd3a menginduksi pembungaan dan pembentukan umbi.
1 cm 1 cm
8
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Transformasi genetik kentang kultivar Kennebec dengan gen Hd3a telah berhasil dilakukan dengan efisiensi transformasi 20% dan efisiensi regenerasi sebesar 100%. Transformasi kentang kultivar Kennebec menghasilkan dua tunas transgenik putatif yang tahan terhadap 20 mg/L higromisin. Karena gen hpt
dipautkan dengan gen Hd3a maka tanaman transgenik ini juga mengandung gen
Hd3a dibawah kendali promoter rolC. Saran
Tanaman transgenik putatif perlu dianalisis secara molekuler untuk mengetahui integrasi gen Hd3a. Tanaman transgenik perlu diaklimatisasi dan ditanam di pot atau polybag untuk mengetahui pengaruh gen Hd3a terhadap pembungaan dan pembentukan umbi.
UCAPAN TERIMA KASIH
Terima kasih disampaikan kepada Proyek Penelitian Desentralisasi Baru IPB yang berjudul “Rekayasa genetika tanaman dengan gen toleransi aluminium dan pembungaan” dengan kontrak no: 48/IT3.11/LT/2014 atas nama: Prof Dr Ir Suharsono, DEA yang telah membiayai penelitian ini.
DAFTAR PUSTAKA
Andarwati AU. 2011. Efisiensi teknis usaha tani kentang dan faktor yang mempengaruhi di Kecamatan Batur Kabupaten Banjarnegara [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Bustomi. 2014. Transformasi genetik kentang (Solanum tuberosum L.) kultivar Baraka dengan gen pembungaan Hd3a [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Hawkes JG. 1990. The potato, evolution, biodiversity, and genetic resources. London (GB): Balhaven Press.
Kojima et al. 2002. Hd3a, a rice ortholog of the arabidopsis FT gene, promotes transition to flowering downstream of Hd1 under short-day conditions. Plant Cell Physiol. 43:1096–1105.
Komiya R, Ikegami A, Tamaki S, Yokoi S, Shimamoto K. 2008. Hd3a and RFT1
are essential for flowering in rice. Development. 135:767-774.
Li M, Li H, Hu X. 2011. Genetic transformation and overexpression of a rice
Hd3a induces early flowering in Saussurea involucrata Kar.et Kir. ex Maxim.
9 Manguntungi B. 2014. Transformasi genetik kentang (Solanum tuberosum) kultivar Atlantik dengan gen penyandi lisozim melalui perantara
Agrobacterium tumefaciens [tesis]. Bogor (ID): Sekolah pascasarjana, IPB. Monna L, Lin H.X, Kojima S, Sasaki T, Yano M. 2002. Genetic dissection of a
genomic region for A quantitative trait locus, Hd3, into two loci, Hd3a and
Hd3b, controlling heading date in rice. Theor Appl Ganet. 104:772-778. Murashige T, Skoog F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays
with tobacco culture. Physiol Plantarum. 15:473-497.
Navarro C, Abelanda JA, Cruz EO, Carlos A, Tamaki S, Silva J, Shimamoto K, Prat S. 2011. Control of flowering and storage organ formation in potato by flowering locus T. Nature. 478: 119-123. doi: 10.1038/nature10431.
Sahat S. 1991. Pengaruh cara stimulasi perbungaan terhadap produksi bunga, buah, dan biji beberapa kultivar kentang (Solanum tuberosum L.). Bull Penel Hort. 20(4):105-111.
Senjaya SK. 2013. Pewarisan genetik transgen Hd3a pada tanaman Nicotiana benthamiana transgenik [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Smith O. 1968. Potatoes: production, storing, processing. London (GB): Avi
Publishing Company.
Sulistyaningsih YC. 2012. Rekayasa ekspresi gen pembungaan Hd3a pada tanaman jarak pagar (Jatropha curcas L.) [disertasi]. Bogor (ID): Sekolah Pascasarjana, IPB.
Syafitri LN. 2012. Transformasi genetik Nicotiana benthamiana dengan gen pembungaan Hd3a dari padi [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Tamaki S, Matsuo S, Wong H, Yokoi S, Shimamoto K. 2007. Hd3a protein is a
mobile flowering signal in rice. Science. 36:1033-1036.
Wardana R. 2014. Transformasi genetik padi (Oryza sativa L.) dengan gen PaCS
penyandi sitrat sintase menggunakan perantara Agrobacterium tumefaciens
[tesis]. Bogor (ID): Sekolah Pascasarjana, IPB.
10
Lampiran 1 Komposisi Media MS (Murashige dan Skoog 1962)
Bahan Konsentrasi
Senyawa dalam media (mg/L)
NH4NO3 1650
KNO3 1900
KH2PO4 170
H3BO3 6.2
Na2MoO4.2H2O 0.25 CoCl2.6H2O 0.025
KI 0.83
CaCl2.2H2O 440 MgSO4.7H2O 370 MnSO4.4H2O 22.3 ZnSO4.7H2O 8.6 CuSO4.5H2O 0.025
Na2EDTA 37.3
FeSO4.7H2O 27.8 Thiamine-HCl 0.1 Niacin (asam
nikotinat)
0.5 Pyridoxine-HCl 0.5
Glycine 2.0
Myo inositol 100 Gula pasir 30 g/L
11 Lampiran 2 Perhitungan persentase efisiensi transformasi dan efisiensi regenerasi
% efisiensi transformasi = ℎ ℎ
ℎ � X %
12
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 1 Juni 1992 dari ayah Hoesni dan ibu Nunung Kartini. Penulis merupakan anak pertama dari tiga bersaudara. Penulis lulus dari SMA Negeri 74 Jakarta pada tahun 2010. Pada tahun yang sama penulis lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI) dan diterima pada program studi Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA).
