POTENSI TEPUNG UMBI DIOSKOREA (
DIOSCOREA ALATA)
UNTUK MENCEGAH ATEROSKLEROSIS
PADA KELINCI PERCOBAAN
NELIS IMANNINGSIH
SEKOLAH PASCA SARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi berjudul Potensi Umbi Dioskorea (Dioscorea alata) untuk Mencegah Aterosklerosis pada Kelinci Percobaan, adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.
Bogor, Juli 2013
RINGKASAN
NELIS IMANNINGSIH. Potensi Tepung Umbi Dioskorea (Dioscorea alata)
untuk Mencegah Aterosklerosis pada Kelinci Percobaan. Dibimbing oleh DEDDY MUCHTADI, NURHENI SRI PALUPI, TUTIK WRESDIYATI, dan KOMARI
Penyakit kardiovaskuler saat ini merupakan salah satu penyebab kematian utama pada orang dewasa di dunia, termasuk Indonesia. Salah satu faktor risiko utama penyakit kardiovaskuler adalah hiperlipidemia. Kondisi hiperlipidemia yang berkepanjangan yang disertai oksidasi LDL merupakan tahap awal terjadinya proses aterosklerosis. Salah satu cara untuk mengurangi risiko terjadinya aterosklerosis adalah melalui pemilihan bahan makanan yang dikonsumsi.
Umbi Dioscorea alata (DA) berpotensi untuk mengurangi risiko kejadian aterosklerosis karena mengandung komponen-komponen fungsional antosianin, serat pangan, dan diosgenin. Komponen fungsional ini menurunkan risiko tersebut melalui mekanisme efek antioksidan, antihiperlipidemia, dan antiagregasi platelet. Tujuan utama penelitian ini adalah mempelajari pengaruh pemberian tepung umbi DA dalam pencegahan kejadian aterosklerosis pada kelinci percobaan. Tujuan khusus penelitian ini ada lima yaitu: 1) Menentukan perlakuan konsentrasi asam sitrat dan lama steam blanching yang menghasilkan tepung DA yang mengandung komponen bioaktif paling tinggi, 2) Mengukur kapasitas antioksidan dan antiagregasi platelet ekstrak tepung umbi DA secara in vitro, 3) Menguji pengaruh pemberian tepung umbi DA pada aktivitas enzim antioksidan pada plasma darah dan ginjal kelinci secara in vivo, 4) Menguji pengaruh pemberian tepung umbi DA pada profil lipida darah kelinci, dan 5) Menganalisis pembentukan lesi aterosklerosis pada aorta kelinci dan mengamati perubahan morfologi ginjal kelinci.
Hasil penelitian memperlihatkan bahwa perlakuan steam blanching selama 10 menit dan perendaman dengan 1% asam sitrat menghasilkan nilai retensi tertinggi antosianin sebesar 44.51% dengan kandungan 104.36 mg/100 g dan fenolat sebesar 62.58% dengan kandungan 198.52 mg ekuivalen asam gallat/100 g serta memiliki kapasitas antioksidan 1300 mg ekuivalen trolox/100 g. Blanching dengan menggunakan uap selama 5 atau 10 menit dapat menurunkan aktivitas enzim polifenol oksidase sehingga menahan proses oksidasi yang dapat mendegradasi senyawa fenolat. Perlakuan ini dijadikan proses untuk menghasilkan tepung DA untuk dijadikan ransum kelinci percobaan.
Ekstrak air dan tepung umbi DA) diberikan kepada kelinci jantan ras New Zealand White selama 60 hari dengan perlakuan ransum sebagai berikut: 1) ransum basal sebagai kontrol negatif (K0); 2) ransum basal ditambah kolesterol 0.5% sebagai kontrol positif (K1); 3) ransum basal ditambah kolesterol 0.5% dan ekstrak air DA sebanyak 1.8 g/100 g (KE1); 4) ransum basal ditambah kolesterol 0.5% dan ekstrak air DA sebanyak 3.6 g/100 g (KE2); 5) ransum basal dengan suplementasi 15% tepung DA ditambah kolesterol 0.5% (KT1); dan 6) ransum basal dengan suplemantasi 30% tepung DA ditambah kolesterol 0.5% (KT2).
secara bermakna dibandingkan dengan kelinci yang hanya diberikan ransum tinggi kolesterol. Pemberian tepung DA 30% dapat mempertahankan kadar superoksida dismutase (SOD) serum pada kadar yang sama dengan kelinci yang diberi ransum basal (kontrol negatif). Namun untuk parameter stres oksidatif lain, seperti malondialdehida (MDA) dan aktivitas glutation peroksidase (GSHPx), tidak terlihat perbedaan yang nyata antarperlakuan.
Pemberian ransum tinggi kolesterol meningkatkan kadar lipida darah kelinci 16 kali dibandingkan dengan pemberian ransum basal. Pemberian ransum kolesterol yang disertai tepung DA sebanyak 30% dapat memperbaiki profil lipida darah ke arah normal. Akan tetapi pemberian kolesterol yang disertai ekstrak air DA tidak dapat mempertahankan profil lipida darah normal. Pada aorta kelinci yang diberi kolesterol dan yang diberi ekstrak air bersamaan dengan kolesterol, ditemukan pembentukan plak aterosklerosis yang sedang dan berat. Pada aorta kelinci yang diberi tepung DA 15% dan 30% bersamaan dengan kolesterol tidak ditemui plak aterosklerosis. Area plak aterosklerosis pada kelinci yang diberi kolesterol menempati 24.4% dari total area potongan melintang aorta, sedangkan pada kelompok yang diberi ransum kolesterol yang disertai ekstrak KE1 dan KE2 area aterosklerosisnya berturut-turut adalah 23.93% dan 22.24%.
Perlakuan retensi komponen bioaktif umbi DA dapat dilakukan dengan menggunakan asam sitrat dengan konsentrasi 1% dikombinasikan dengan steam blanching selama 10 menit. Perlakuan ini menghasilkan tepung yang memiliki kandungan antosianin dan senyawa polifenolat yang tinggi. Secara in vitro, ekstrak tepung memiliki kapasitas antioksidan setara dengan 1300 mg trolox, dan dapat memiliki efek antiagregasi platelet pada konsentrasi 400 ppm. Pemberian tepung DA sebanyak 30% secara nyata dapat mempertahankan enzim SOD pada serum dan kadar Cu,Zn SOD pada sel-sel tubuli renalis kelinci percobaan. Tepung umbi DA juga memiliki efek anti-hiperlipidemia dengan menormalkan profil lipida darah kelinci. Suplementasi tepung DA dalam jangka waktu panjang dapat menghambat pertumbuhan plak aterosklerosis. Dengan potensinya ini tepung umbi DA dapat dikembangkan sebagai pangan fungsional yang bermanfaat untuk mencegah aterosklerosis.
SUMMARY
NELIS IMANNINGSIH. The Potency of Dioscorea (Dioscorea alata) Tuber Flour to Inhibit Atherosclerosis in Laboratory Rabbits. Supervised by DEDDY MUCHTADI, NURHENI SRI PALUPI, TUTIK WRESDIYATI, and KOMARI
Recently, cardiovascular disease is one of the main causes of adult mortality in the world including in Indonesia. One of major risk factors of cardiovascular disease is hyperlipidemia. Prolonged hyperlipidemia accompanied by LDL oxidation is the first step of the development of atherosclerosis. Selection of food consumed is one way to reduce the risk of the development of atherosclerosis.
Dioscorea alata (DA) tuber has potency to reduce the risk of atherosclerosis because it contains several functional compounds; anthocyanins, dietary fiber, and diosgenin. This contents lower the risk by antioxidation, antihyperlipidemia, and antiaggregation mechanisms. The objective of this research was to study the effect of administration of DA flour to inhibit atherosclerosis in laboratory rabbits. There were five specific objectives of the research ; (1) to determine the citric acid concentration and the duration of steam blanching which produce DA flour with the higest bioactive compounds, (2) to determine antioxidation and anti platelet aggregation effects of DA flour by in vitro test, (3) to examine the effects of DA flour administration on the activity of antioxidant enzymes in serum and kidney by in vivo test, 4) to examine the effect of DA flour administration on blood lipid profiles of the rabbits; and (5) to analyze the development of atherosclerosis plaques in aorta, and examine the morphologic change in rabbits kidney tissues.
The results showed that 1% citric acid soaking and 10 minutes blanching produced DA flour with the highest anthocyanins and polyphenolic retention as high as 44.51% or 104.36 mg/100 g flour and 62.58% or 198.52 mg equivalent gallic acid/100 g flour, respectively. The flour had antioxidant capacity equal to 1300 mg trolox/100 g. Five or ten minutes steam blanching could reduce the activity of polyphenol oxidase enzyme, therefore retarded the oxidation process that degraded polyphenolic compound. These treatments were applied to produce DA flour which later formulated into rabbits ration.
DA water extracts and flours were co-administrated with high cholesterol ration to 30 male New Zealand White rabbits for 60 days with the following ration groups; 1) basal ration as negative control (K0); 2) basal ration with 0.5% cholesterol as positive control (K1); 3) basal ration with 0.5% cholesterol and 1.8 g/100 g of freeze dried DA extract (KE1); 4) basal ration with 0.5% cholesterol and 3.6 g/100 g of freeze dried DA extract (KE2); 5) 15% DA flour in basal ration with 0.5% cholesterol (KT1); and 6) 30% DA flour in basal ration with 0.5% cholesterol (KT2).
ration. 30% DA flour substitution into the ration, significantly maintained the level of SOD serum equal to that of administrated with basal ration. The other stress oxidative parameters; malondialdehyde (MDA) and glutathione peroxidase (GSHPx) activities showed no differences between treatments.
The administration of high cholesterol ration increased total cholesterol 16 fold as compared to those administrated with basal ration, and increased cholesterol LDL, and triacylglycerol level significantly. Co-administration of 15% and 30% DA flour to the high cholesterol ration could improve lipid profile towards normal condition. However, co-administration of water extract could not maintain a normal lipid profile. In aorta of rabbits fed with cholesterol co-administrated with water extract, there were moderate and severe atherosclerotic plaque formation. However, in aorta of rabbits fed with cholesterol co-administrated with 15% and 30% DA flour, no plaques development was found. The area of atherosclerotic plaques in cholesterol group occupied 24,4% of total aortic transversal section, whereas, in group fed with cholesterol co-administrated with extract DA KE1 and KE2 the areas were 23,93% and 22,24% respectively.
The retention of bioactive compounds of DA could be done using citric acid at 1% concentration combined with a simple steam blanching process for 10 minutes. These treatments produced flour with high content of antocyanins and polyphenolic compound. In vitro experiment showed that the flour had antioxidant capacity equal to 1300 mg trolox, and also exhibited antiaggregation effect in concentration of 400 ppm. Co-administration of 30% DA flour to the high cholesterol ration could maintain the level of SOD serum and Cu,Zn SOD in kidney tissues of the rabbits. DA flour had also antihyperlipidemic effect by normalizing the blood lipid profil. Prolonged suplementation of the flour, could inhibit the formation of atherosclerosis plaques in rabbits aorta and improved the morphology of kidney tissues of the rabbits. Therefore, with this potency, the flour of DA tuber could be developed as a promising functional food to prevent the development of atherosclerotic plaques.
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2013
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB
POTENSI TEPUNG UMBI DIOSKOREA (
DIOSCOREA ALATA)
UNTUK MENCEGAH ATEROSKLEROSIS
PADA KELINCI PERCOBAAN
NELIS IMANNINGSIH
Disertasi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor
pada
Program Studi Ilmu Pangan
SEKOLAH PASCA SARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
Penguji pada Ujian Tertutup : Dr Rimbawan
Dr Ir Endang Prangdimurti, MS
Judul Disertasi : Potensi Tepung Umbi Dioskorea (Dioscorea alata) untuk Mencegah Aterosklerosis pada Kelinci Percobaan
Nama : Nelis Imanningsih
NIM : F261080061
Disetujui oleh
Komisi Pembimbing
Prof Dr Ir Deddy Muchtadi, MS Ketua
Dr Ir Nurheni Sri Palupi, MS Anggota
Prof Dr drh Tutik Wresdiyati, PA (Vet) Anggota
Prof (R) Dr Komari, MSc Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi Ilmu Pangan
Dr Ir Ratih Dewanti Hariyadi, MSc
Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr
PRAKATA
Penulis menghaturkan puji dan syukur ke hadirat Allah Subhanahu wa ta’ala atas limpahan rahmat dan karunia sehingga disertasi ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Januari 2011 ini adalah Potensi Tepung Umbi Dioskorea (Dioscorea alata) Untuk Mencegah Aterosklerosis pada Kelinci Percobaan.
Selesainya rangkaian penelitian hingga penulisan disertasi ini tidak terlepas dari bantuan berbagai pihak. Untuk itu dengan segala kerendahan hati, penulis mengucapkan terima kasih dan penghargaan setinggi-tingginya kepada:
1. Yth Bapak Prof Dr Deddy Muchtadi, MS selaku ketua komisi pembimbing; Ibu Dr Ir Nurheni Sri Palupi, MS, Prof Dr drh Tutik Wresdiyati PA(Vet), serta Prof (R) Komari, MSc APU, selaku anggota komisi pembimbing yang telah banyak memberikan curahan waktu untuk memberikan arahan, bimbingan, dan saran yang sangat berharga bagi penulis, selama penelitian hingga penulisan disertasi ini sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penyusunan disertasi ini dengan sebaik-baiknya.
2. Yth Bapak Dr Rimbawan dan Ibu Dr Ir Endang Prangdimurti, MS yang telah menjadi penguji luar komisi pada ujian kualifikasi Doktor dan ujian tertutup; serta Ibu Prof Dr dr Purwanti Astuti, MSc SpFK dan Bapak Prof Dr Ir Wasmen Manalu, yang telah menjadi penguji pada ujian terbuka, atas saran-saran berharga yang telah memperkaya dan bermanfaat untuk penyempurnaan disertasi ini
3. Yth Bapak Dr Ir Dahrul Syah, MscAgr, selaku Dekan Sekolah Pasca Sarjana Institut Pertanian Bogor; Bapak Dr Ir Sam Herodian, MS, selaku Dekan Fakultas Teknologi Pertanian; Bapak Dr Ir Feri Kusnandar, MSc selaku Ketua Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan Fakultas Teknologi Pertanian Institut Pertanian Bogor (Fateta IPB); serta Ibu Dr Ir Ratih Dewanti-Hariyadi, MSc selaku Ketua Program studi Ilmu Pangan dan jajarannya yang telah memberikan dukungan, fasilitas, dan kemudahan kepada penulis selama menuntut ilmu dan menyelesaikan studi pada Program Studi Ilmu Pangan. 4. Yth Bapak Kepala Badan Litbang Kesehatan yang telah mencanangkan
program beasiswa untuk para penelitinya melalui Program Akselerasi Doktor Indonesia dan biaya penelitian melalui dana DIPA Badan Litbang Kesehatan; Yth Ibu Kepala Pusat Biomedis dan Teknologi Dasar Kesehatan dan jajarannya yang telah memberikan izin untuk melanjutkan studi dan memberikan kelonggaran sementara dari tugas-tugas kantor; serta Kepala Pusat Teknologi Terapan Kesehatan dan Epidemiologi Klinik (dahulu Puslitbang Gizi dan Makanan) dan jajarannya yang telah memfasilitasi dan memberi bantuan kepada penulis di awal studi.
6. Yth seluruh staf pengajar pada Program Studi Ilmu Pangan IPB atas ilmu pengetahuan yang telah diberikan selama penulis menempuh pendidikan Doktor, sehingga penulis mendapatkan banyak bekal ilmu dan pembelajaran, khususnya pada bidang Ilmu Pangan
7. Yth seluruh staf Laboratorium Kimia Makanan dan Laboratorium Percobaan Hewan Pusat Biomedis dan Teknologi Dasar Kesehatan; staf Laboratorium Terpadu dan laboratorium pengolahan makanan Pusat Teknologi Terapan Kesehatan dan Epidemiologi Klinis yang telah membantu dalam analisis kimia, biokimia dan percobaan pengolahan tepung DA; staf Laboratorium Biokimia Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia atas bantuan analisis komponen stres oksidatif; staf laboratorium Patologi Klinis Fakultas Kedokteran UI atas bantuan analisis agregasi platelet; staf Unit Pilot Plan SEAFAST atas bantuan pengolahan tepung DA dalam skala besar; serta staf Laboratorium Histologi Fakultas Kedokteran Hewan IPB yang banyak membantu dalam preparasi jaringan kelinci
8. Yth seluruh teman-teman sejawat di Pusat Biomedis dan Teknologi Dasar Kesehatan Badan Litbang Kesehatan atas bantuan, diskusi, dan perhatian selama penulis menjalankan studi.
9. Sahabat-sahabat tersayang mahasiswa Program Doktor Ilmu Pangan angkatan 2008; Andi Early Febrinda, Rijanti Rahaju Maulani, Tutik Suryati, Mega Safithri, Rahmawati, Siti Nurmiah, Lula Nadia, Nur Wulandari, Mursalin, Rindy Tan Hidarto dan Ace Baehaki atas segala kebersamaan penuh persaudaraan dan semangat, dalam perjalanan panjang suka dan duka hampir 5 tahun di masa perkuliahan ataupun saat penelitian, yang meninggalkan kenangan tak terlupakan
10. Yang tercinta Ibunda Hj. Kunasih Rubaya dan Almarhum Bapak Obos Rubaya yang menjadi sebab terlahirnya penulis ke dunia ini, atas kasih sayang dan doa yang tidak putus-putusnya dipanjatkan untuk keberhasilan penulis. Mertua Ibunda Hj Tati Mulyati dan Almarhum Bapak Dwidjatmo, serta semua saudara kandung dan saudara ipar penulis yang telah memberikan kasih sayang, bantuan, dan doa yang tulus kepada penulis.
11. Yang tercinta suamiku Ir Agus Karyadi yang selalu memberikan kasih sayang, motivasi, bantuan moril dan materil, dan doa yang tulus untuk kesuksesan penulis.
12. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu, atas segala dukungan, motivasi, dan kontribusi yang diberikan kepada penulis baik secara langsung maupun tidak langsung sejak masa perkuliahan, penelitian sampai tersusunnya disertasi ini
Semoga Allah Subhanahu wata’ala membalas semua amal kebaikan dan budi baik yang telah diberikan dengan pahala yang setimpal. Amin Allahumma Amin. Penulis menyadari sepenuhnya bahwa karya tulis ini tidak terlepas dari segala kekurangan. Semoga karya ini dapat memberikan manfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan, khususnya di bidang ilmu pangan.
Bogor, Juli 2013
DAFTAR ISI
2 PENGARUH FAKTOR PENGOLAHAN PADA RETENSIKOMPONEN BIOAKTIF UMBI 5 3 STRES OKSIDATIF PADA KELINCI YANG DIBERI RANSUM
TINGGI KOLESTEROL BERSAMAAN DENGAN EKSTRAK
AIR ATAU TEPUNG UMBI DIOSCOREA ALATA 21 4 PROFIL LIPIDA DARAH DAN PERKEMBANGAN PLAK
ATEROSKLEROSIS PADA KELINCI YANG DIBERI PAKAN
DAFTAR TABEL
2.1 Komposisi proksimat umbi segar dan tepung DA dengan
perlakuan perendaman dalam beberapa konsentrasi asam sitrat dan waktu steam blanching
13
2.2 Total antosianin tepung DA dengan perlakuan perendaman dalam beberapa konsentrasi asam sitrat dan lama steam blanching
14
2.3 Total fenolat tepung DA dengan perlakuan perendaman dalam beberapa konsentrasi asam sitrat dan lama steam blanching
15
2.4 Total diosgenin tepung DA dengan perlakuan perendaman dalam beberapa konsentrasi asam sitrat dan lama steam blanching
18
2.5 Total serat pangan tepung DA dengan perlakuan perendaman dalam beberapa konsentrasi asam sitrat dan lama steam blanching
18
2.6 Nilai kapasitas antioksidan tepung DA menurut perlakuan 19
3.1 Komposisi bahan penyusun ransum kelinci 30
3.2 Hasil analisis proksimat ransum 30
3.3 Bobot badan, konsumsi ransum, konsumsi kolesterol, dan konsumsi antosianin pada setiap kelompok perlakuan
31
3.4 Perbedaan aktivitas SOD serum,GSH serum, dan homogenat hati antarkelompok perlakuan
32
3.5 Kadar total kolesterol, LDL kolesterol, dan triasilgliserol serum kelinci pada akhir penelitian
33
3.6 Perbedaan kadar MDA serum dan homogenat hati antarkelompok perlakuan
34
3.7 Persentase jumlah inti dan sitoplasma sel tubuli renalis kelinci yang memberikan reaksi positif kuat keberadaan Cu, Zn SOD
37
4.1 Komposisi bahan penyusun ransum kelinci 48
4.2 Hasil analisis proksimat ransum 49
4.3 Bobot badan, konsumsi ransum, konsumsi kolesterol, dan antosianin pada setiap kelompok perlakuan
50
4.4 Perubahan kadar total kolesterol serum kelinci 51 4.5 Perubahan kadar kolesterol-LDL serum kelinci 52 4.6 Perubahan kadar kolesterol-HDL serum kelinci 52 4.7 Perubahan kadar triasilgliserol serum kelinci 52 4.8 Tingkat perkembangan plak aterosklerosis pada setiap kelompok 55 4.9 Indeks aterogenik dan area ateroma pada aorta kelinci percobaan 56 5.1 Perbedaan asupan kolesterol, antosianin, serat pangan dan
diosgenin pada setiap kelompok selama penelitian
DAFTAR GAMBAR
1.1 Diagram proses penelitian dan luaran setiap tahapan 4
2.1 Diagram alir pembuatan tepung DA 9
2.2 Umbi Dioscorea alata dan tepung umbi 12
2.3 Penurunan aktivitas PPO dengan perlakuan perendaman asam sitrat (A) dan lama steam blanching (B)
16
2.4 Kadar total fenolat, antosianin, dan diosgenin serta
hubungannya dengan kapasitas antioksidan setara mg trolox,
asam askorbat, dan α-tokoferol 20
3.1 Skema percobaan hewan 26
3.2 Mikrofotografi jaringan ginjal kelinci dengan pewarnaan umum HE
36
3.3 Mikrofotografi jaringan ginjal kelinci dengan pewarnaan imunohistokimia Cu, Zn-SOD
39
4.1 Skema percobaan hewan 47
4.2 Kenaikan bobot badan kelinci pada setiap kelompok perlakuan
50
4.3 Kemampuan ekstrak air DA dalam menurunkan agregasi platelet plasma darah kelinci
54
4.4 Mikrofotografi potongan melintang aorta kelinci dengan pewarnaan Verhoeff-van Gieson
57
DAFTAR LAMPIRAN
1 Hasil analisis komposisi proksimat dan serat pangan 72
2 Hasil analisis antosianin 74
3 Hasil analisis total polifenolat 75
4 Hasil analisis diosgenin 76
5 Hasil analisis kapasitas antioksidan ekuivalen trolox, asam askorbat, dan α-tokoferol
77
6 Persetujuan etik penelitian 79
7 Perhitungan jumlah sampel 80
8 Hasil analisis total kolesterol dan uji ANOVA 81 9 Hasil analisis LDL kolesterol dan uji ANOVA 83 10 Hasil analisis HDL kolesterol dan uji ANOVA 85 11 Hasil analisis triasilgliserol dan uji ANOVA 87 12 Contoh grafik hasil pengukuran agregasi platelet 89 13 Hasil analisis aktivitas SOD serum, GSHPx homogenat,
GSHPx serum, MDA homogenat dan MDA serum dan uji ANOVA
1
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Penyakit kardiovaskuler saat ini merupakan salah satu penyebab kematian utama pada orang dewasa di dunia, termasuk Indonesia. Berdasarkan Riset Kesehatan Dasar tahun 2007, prevalensi penyakit kardiovaskuler di Indonesia adalah 7.2% (Balitbangkes 2008), dan angka ini diperkirakan akan terus meningkat seiring dengan perubahan gaya hidup, pola makan, dan tingkat stres yang ada. Kondisi yang menyebabkan penyakit kardiovaskuler adalah aterosklerosis pada pembuluh darah yang menuju ke jantung. Aterosklerosis merupakan suatu kondisi pengerasan dan penyempitan pembuluh darah akibat timbunan lemak, kolesterol, trombosit, makrofag, dan produk-produk seluler di dalam dinding pembuluh darah arteri. Jika aterosklerosis terjadi pada arteri koroner, ia akan menghambat aliran darah yang menuju jantung dan menyebabkan serangan jantung (AHA 2008).
Salah satu faktor risiko utama aterosklerosis adalah hiperlipidemia. Tingginya kadar lipida darah, terutama kolesterol low density lipoprotein (LDL) yang tinggi dan kolesterol high density lipoprotein (HDL) yang rendah berhubungan sangat kuat dengan perkembangan aterosklerosis (Choy et al. 2004). Kondisi hiperlipidemia yang berkepanjangan yang disertai oksidasi LDL merupakan tahap awal terjadinya proses aterosklerosis. Proses ini kemudian diikuti oleh adanya serangkaian proses yang kompleks, seperti deposit substansi lemak, kolesterol, produk sisa metabolisme seluler, kalsium, dan substansi lain di dalam pembuluh arteri ukuran besar dan menengah bagian dalam (Gropper 2005)
Salah satu cara untuk mengurangi risiko terjadinya aterosklerosis adalah melalui pemilihan bahan makanan yang dikonsumsi. Komposisi dan jumlah zat gizi makanan, seperti karbohidrat, protein, dan lemak merupakan komponen makro yang sangat penting di dalam makanan yang dapat mempengaruhi kondisi hiperlipidemia. Di samping itu, beberapa komponen bioaktif memiliki fungsi fisiologis untuk mengurangi faktor risiko terjadinya aterosklerosis dengan cara menurunkan total kolesterol di dalam darah, atau sebagai antioksidan yang mencegah oksidasi LDL.
Umbi Dioskorea alata (DA) berpontensi untuk mengurangi risiko kejadian aterosklerosis, karena mengandung komponen-komponen fungsional antosianin, diosgenin, dan serat pangan. Antosianin merupakan komponen bioaktif yang termasuk ke dalam kelompok fenolat. Antosianian merupakan antioksidan yang poten yang memiliki kapasitas membersihkan dan menangkap radikal bebas yang dapat merusak biomolekul (Mazza et al. 2007). Selain itu, antosianin juga
cara menghambat absorpsi kolesterol makanan oleh usus halus dan meningkatkan sek2resi kolesterol dari empedu. Serat pangan di dalam umbi DA dapat menurunkan total kolesterol serum, kadar triasilgliserol, dan LDL kolesterol (Hang 1994). Glikoprotein yang larut air dan serat pangan yang terdapat dalam musilase kental dapat mengatur metabolisme lipida dan dapat menurunkan total kolesterol serum dan kadar LDL-kolesterol secara konsisten pada tikus yang hiperlipidemia (Chen et al. 2003).
Aktivitas fisiologis senyawa-senyawa yang terdapat di dalam umbi DA sudah terbukti dapat berperan sebagai antioksidan ataupun menormalkan kondisi hiperlipidemia, akan tetapi belum ada penelitian yang mengujinya lebih lanjut untuk mencegah terjadinya aterosklerosis sebagai manifestasi kondisi berkelanjutan dari hiperlipidemia, yang merupakan faktor langsung dari kejadian penyakit kardiovaskuler. Sampai saat ini, umbi DA merupakan umbi minor yang telah lama dikonsumsi masyarakat, akan tetapi belum dimanfaatkan sebagai pangan fungsional yang lebih luas. Oleh karena itu, diperlukan suatu penelitian yang mempelajari kestabilan dan retensi zat bioaktif umbi DA dan kemudian mempelajari potensinya secara in vitro dan in vivo, dalam mencegah kejadian aterosklerosis pada hewan coba.
1.2 Perumusan Masalah
Pertanyaan penelitian yang akan dijawab pada penelitian ini adalah: 1) Faktor-faktor pengolahan apa yang harus diperhatikan agar retensi senyawa bioaktif umbi DA dapat optimal dan; 2) Apakah tepung umbi DA yang dihasilkan dapat mencegah kejadian aterosklerosis dengan cara menormalkan profil lipida darah, berperan sebagai antioksidan dan mencegah agregasi platelet pada kelinci percobaan.
1.3 Tujuan
Tujuan Umum
Mempelajari pengaruh pemberian tepung umbi dioskorea dalam pencegahan kejadian aterosklerosis pada kelinci percobaan.
Tujuan Khusus
1. Menentukan perlakuan konsentrasi asam sitrat dan lama steam blanching yang menghasilkan tepung DA yang mengandung komponen bioaktif paling tinggi. 2. Mengukur kapasitas antioksidan dan antiagregasi platelet ekstrak tepung umbi
DA secara in vitro.
3. Menguji pengaruh pemberian tepung umbi DA pada aktivitas enzim antioksidan pada plasma darah dan ginjal kelinci secara in vivo.
4. Menguji pengaruh pemberian tepung umbi DA pada profil lipida darah kelinci 5. Menganalisis pembentukan lesi aterosklerosis pada aorta kelinci dan
1.4 Hipotesis
Hipotesis yang diajukan dalam penelitian ini adalah:
1. Proses perendaman dalam asam sitrat dan lama steam blanching mempengaruhi retensi komponen bioaktif dan kapasitas antioksidan pada tepung DA.
2. Tepung umbi DA dengan kandungan senyawa bioaktifnya mampu memperbaiki kondisi hiperlipidemia dengan cara menurunkan kadar kolesterol total, LDL kolesterol dan triasilgliserol, serta menaikkan kadar HDL kolesterol darah kelinci percobaan.
3. Pemberian tepung umbi DA mampu mencegah oksidasi LDL dengan menurunkan produksi malondialdehida hati dan mempertahankan aktivitas enzim antioksidan pada serum darah dan ginjal kelinci percobaan.
4. Pemberian tepung umbi DA mampu mencegah pembentukan lesi aterosklerosis pada aorta dan kelainan histopatologis pada ginjal kelinci percobaan.
1.5 Manfaat
Hasil penelitian ini diharapkan:
1. Dapat memberikan nilai tambah pada umbi DA sebagai salah satu sumber daya alam Indonesia yang belum banyak dimanfaatkan.
2. Dapat menghasilkan proses pembuatan tepung umbi DA yang dapat mempertahankan komponen bioaktif untuk dikembangkan sebagai pangan fungsional.
3. Dapat memberikan informasi mekanisme penghambatan aterosklerosis oleh komponen bioaktif umbi dioskorea.
1.6 Ruang Lingkup
BAHAN PERLAKUAN VARIABEL TUJUAN aktivitas enzim antioksidan pada serum dan ginjal kelinci lesi aterosklerosis pada aorta kelinci dan mengamati
2 PENGARUH FAKTOR PENGOLAHAN PADA RETENSI
KOMPONEN BIOAKTIF UMBI
DIOSCOREA ALATA
The Effect of Processing on the Retention of Bioactive Compounds of Dioscorea alata Tuber
Abstract
Dioscorea alata (DA) tuber had health benefit due to its bioactive compounds anthocyanins, which belongs to polyphenolic compound of plants. However these compounds undergo significant degradation when the tuber was processed because of native enzyme activities. To optimize its use, the tuber should be processed into flour with taking into account pre-treaments processing of citric acid soaking and steam blanching in order to preserve the bioactive compounds. This research investigated factors that could retain anthocyanins, phenolic contents and antioxidant capacity. There were four levels of citric acid; 0, 0.25, 0.5, and 1% and two levels of blanching time; 5 and 10 minutes that were examined to know their effect in inhibiting polyphenol oxidase (PPO) activities. 1% citric acid soaking of DA tuber slices and ten minutes blanching resulted in the highest value of total anthocyanins 104.36 mg/100 g of DA flour and phenolic content, 198.52 mg equivalent gallic acid /100 g of DA flour, and had antioxidant capacity equal to 1300 mg trolox/100 g flour. Steam blanching for 5 or 10 minutes could reduce the activity of PPO, so it retarded the oxidaton process that destroyed the phenolic compounds. This study showed that the retention of bioactive compounds of DA tuber through soaking the tuber slices in low cost chemicals like citric acid at low concentrations, combined with 10 minutes of steam blanching resulted flour that contained total anthocyanins and phenolic content as high as 44.51% and 62.58% of fresh tuber. The flour yielded had a good axtioxidant capacity which could enhance the potential of such flour in the development of functional food.
Keywords: Dioscorea, citric acid, blanching, anthocyanins, phenolic
Abstrak
dan steam blanching terhadap umbi DA selama 10 menit menghasilkan nilai retensi tertinggi antosianin yaitu 104.36 mg /100 g tepung, dan total fenolat setara 198.52 mg asam galat/100 g tepung, serta kapasitas antioksidan setara dengan 1300 mg trolox/100 g tepung. Steam blanching selama 5 atau 10 menit dapat menurunkan aktivitas enzim PPO sehingga menahan proses oksidasi yang dapat mendegradasi senyawa fenolat. Penelitian ini menunjukkan bahwa upaya retensi komponen bioaktif pada umbi DA melalui perendaman pada bahan yang tidak mahal, seperti asam sitrat, yang dikombinasikan dengan steam blanching dapat menghasilkan tepung yang memiliki kandungan antosianin dan senyawa fenolat sebesar 44.51% dan 62.58% dari yang terdapat pada umbi segar. Tepung yang dihasilkan memiliki kapasitas antioksidan yang baik yang dapat meningkatkan potensi tepung ini sebagai pangan fungsional.
Kata Kunci: Dioscorea alata, asam sitrat, blanching, antosianin, fenolat
2.1 Pendahuluan
Umbi Dioscorea alata (DA) sering disebut sebagai greater yam, dikelompokkan sebagai salah satu makanan pokok di negara-negara tropis karena mengandung karbohidrat yang tinggi. Umbi ini memiliki keunggulan gizi jika dibandingkan dengan tanaman umbi tropis lainnya. Komposisi umbi yang utama adalah pati, yaitu sebesar 75–84% basis kering dengan sejumlah protein, lemak, dan vitamin, serta mineral yang sangat lengkap (Chow et al. 2006). Di negara-negara Asia, beberapa jenis DA digunakan sebagai obat untuk mencegah diare, menurunkan lipida darah, dan memiliki aktivitas antioksidan dan antihipertensi (Nagai et al. 2006).
Beberapa komponen fungsional dari umbi ini adalah antosianin, diosgenin, dan serat pangan. Antosianin merupakan komponen fenolat yang memiliki aktivitas antioksidan dengan kemampuan untuk menangkap radikal bebas (Chaovanalikit dan Wrolstad 2004), dan meningkatkan enzim antioksidan glutation peroksidase (Xia et al. 2006). Selain itu antosianin memiliki manfaat fisiologi pada pembuluh darah sebagai antiinflamasi, merelaksasi pembuluh darah, dan menstabilkan dinding pembuluh darah (Hassellund et al. 2012), serta dapat membantu memperbaiki profil lipida darah dengan meningkatkan HDL dan menurunkan LDL plasma (Qin et al. 2009). Komponen fungsional berikutnya adalah diosgenin yang merupakan saponin steroid yang memiliki efek antihiperkolesterolemia dengan cara menekan absorpsi kolesterol, meningkatkan sekresi kolesterol melalui asam empedu (Thewles et al. 1993), dan meningkatkan eksresinya pada feses (Temel et al. 2009). Selain itu, diosgenin dapat menurunkan total kolesterol, LDL-kolesterol, dan trigliserida pada serum (Son et al. 2007). Komponen fungsional yang ketiga adalah musilase yang merupakan serat pangan dan glikoprotein larut air. Musilase memiliki efek antihiperkolesterolemia dan mempunyai efek penghambatan terhadap Angiostensin Converting Enzyme yang merupakan enzim yang berperan dalam meningkatkan tekanan darah (Chen et al. 2003).
pengolahan sederhana, seperti perebusan dan pengukusan. Dengan pengolahan sederhana ini, umbi hanya dikonsumsi dalam bentuk asli saja. Selain itu, kehilangan komponen bioaktif belum diukur dengan baik. Jika umbi diolah menjadi tepung, maka akan memperluas penggunaannya ke dalam makanan lain, karena tepung dapat digunakan sebagai bahan baku berbagai jenis makanan. Dengan pengolahan yang tepat yang dapat mempertahankan komponen bioaktifnya, umbi DA memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai makanan fungsional. Akan tetapi, data tentang bagaimana komponen bioaktif dapat dipertahankan selama pembuatan tepung, masih sangat terbatas.
Dari ketiga bahan aktif di dalam umbi, yang paling rentan terhadap faktor-faktor pengolahan adalah antosianin dan komponen fenolat sehingga antosianin dan komponen fenolat merupakan parameter kritis yang harus diperhatikan. Kestabilan antosianin sangat dipengaruhi oleh suhu, pH, dan cahaya. Peningkatan suhu dan pH dapat meningkatkan kerusakan antosianin (Laleh et al. 2006). Wang et al. (2010) melaporkankan bahwa antosianin lebih stabil pada pH yang rendah, yaitu di bawah 5, dibandingkan dengan pH basa di atas 7, dan suhu pengolahan di atas 80ºC juga dapat mendegradasi antosianin. Aramwit et al. (2010) juga mempelajari pengaruh cahaya dan suhu selama pengolahan pada kestabilan antosianin. Pada kondisi terpapar cahaya atau suhu tinggi yang cukup lama (70ºC selama 10 jam) antosiani akan rusak sehingga akan menurunkan kapasitas antioksidannya. Khrisnan et al. (2010) melaporkan efek perlakuan perendaman dengan asam askorbat, asam sitrat, asam asetat, dan sodium metabisulfit pada berbagai konsentrasi mempengaruhi nilai indeks pencokelatan yang merupakan parameter kerusakan komponen fenolat akibat oksidasi. Nilai indeks pencokelatan tepung yang paling rendah dihasilkan pada tepung yang direndam di dalam asam sitrat 0.25 %.
Terdapat beberapa faktor pengolahan yang mempengaruhi retensi komponen fenolat dan kapasitas antioksidannya. Meningkatnya suhu pengolahan akan mendegradasi total fenolat dan menurunkan jumlahnya sehingga kemampuan untuk menangkap radikal bebas akan menurun (Hsu et al. 2003). Akan tetapi, pemanasan dengan waktu singkat dapat menurunkan aktivitas enzim peroksidase, sementara pengeringan dapat menurunkan aktivitas PPO. Enzim-enzim ini berperan dalam mengoksidasi komponen fenolat (Akissoe et al. 2003). Komponen fenolat akan menghasilkan warna kecokelatan apabila teroksidasi, Akissoe (2003) menemukan hubungan aktivitas enzim peroksidase dengan indeks pencokelatan pada bahan-bahan yang mengandung fenolat. Dimana, dengan tingginya aktivitas enzim peroksidase, indeks pencokelatan akan semakin tinggi .
Pengaruh perlakuan pengolahan pada saponin steroid dilakukan oleh Yang et al. (2009). Pada penelitian ini ditemukan bahwa pengeringan dengan menggunakan udara panas ataupun cahaya tidak mempengaruhi kestabilan saponin selama pengeringan. Akan tetapi, perlakuan steam blanching akan meningkatkan kestabilan saponin steroid karena terjadi inaktivasi enzim glukosidase endogen yang berperan dalam perubahan struktur saponin.
2.2 Metode Penelitian
Bahan dan Peralatan Penelitian
Sediaan umbi DA diperoleh dari pedagang pengumpul di daerah Bogor. Spesies tanaman dibawa ke Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) untuk dikonfirmasi kebenaran spesiesnya. Bibit umbi kemudian ditanam di Bogor pada bulan Juni-April, dengan kelembapan udara dan curah hujan rata-rata 70% RH dan 1700 mm/tahun. Umbi dipanen pada usia tepat 10 bulan sehingga memiliki ukuran dan bobot yang seragam. Bahan-bahan untuk pengolahan tepung adalah asam sitrat, metanol, asam klorida, kalium klorida, pereaksi folin-ciocalteu, kalium fosfat, natrium karbonat, kalium fosfat, natrium karbonat, dan ethylenediaminetetraacetic acid diperoleh dari E-Merck. Sementara itu, Dietary Fiber assay kit (TDF 100A), radikal 1,1-diphenyl-picrylhydrazyl (D913-2), trolox; 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethyl-chroman-2-carboxylic acid 97% (23,881-3), asam galat (G8647), L-3,4-Dihydroxyphenylalanine/L-DOPA (D-9628), L-Ascorbic Acid (A7631), standar diosgenin (D1634) dan p-anisaldehyde/4-methoxybenzaldehyde(A-88107) diperoleh dari Sigma-Aldrich. Peralatan yang digunakan adalah slicer, steamer, pengering kabinet, grinder, sieves, rotary evaporator, shaker, sentrifuse, dan UV-VIS spektrofotometer Bio-rad.
Pengolahan Umbi DA Menjadi Tepung
Umbi diproses menjadi tepung dengan menggunakan perlakuan perendaman asam sitrat pada konsentrasi 0, 0.25, 0.5 dan 1% dan steam blanching selama 5 dan 10 menit. Diagram alir proses pengolahan umbi menjadi tepung dapat dilihat pada Gambar 2.1.
Analisis Proksimat dan Serat Pangan
Analisis proksimat (kadar air, abu, lemak, protein, dan karbohidrat) dilakukan menggunakan metode AOAC (2007). Analisis serat pangan dilakukan menggunakan dietary fiber assay Kit (Sigma-Aldrich) yang merupakan kombinasi metode enzimatik dan gravimetrik. Terdapat 3 jenis enzim yang digunakan untuk mencerna karbohidrat dan protein pada sampel, yaitu α-amilase, protease, dan amiloglukosidase. Satu gram sampel kering yang sudah bebas lemak, berturut-turut dicerna menggunakan 0.1 mL α-amilase, 0.1 mL protease, dan 0.1 mL amiloglukosidase untuk menghilangkan protein dan pati. Serat pangan kemudian dipresipitasi dengan menggunakan etanol, difiltrasi, dicuci dengan alkohol dan aseton, dikeringkan, dan ditentukan kadar protein dan abu pada residu. Persentase total serat pangan dihitung sebagai bobot residu dikurangi dengan bobot protein dan bobot abu per bobot sampel dikalikan 100.
[ )
Keterangan:
TDF = Total Dietary Fiber (Total serat pangan) R = Bobot residu (mg)
Steam blanching (100° C) 1. 5 menit
2. 10 menit
Dikeringkan dalam Pengering
Kabinet 50°C Selama 24 jam
Dihaluskan dengan grinder
Diayak pada 160 µm/100
mesh
Tepung Umbi DA Dicuci, dikupas, dan
diiris dengan ketebalan 0.5 cm
Direndam selama 30 menit dalam
asam sitrat konsentrasi 1. 0% 2. 0.25%
3. 0.5 % 4. 1 % Umbi DA
Gambar 2.1 Diagram alir pembuatan tepung DA
Ekstraksi dan Analisis Total Antosianin
Ekstraksi antosianin dilakukan menggunakan metanol yang mengandung asam klorida 0.1% (Longo dan Vasapollo 2006). Lima gram tepung dari setiap perlakuan ditimbang, dan ditambah dengan 100 mL metanol yang mengandung 1% HCl (nisbah 1:20). Tepung dimaserasi pada suhu 5ºC selama 12 jam. Residu disaring, dan diekstrak kembali sampai tepung berwarna pucat. Filtrat disatukan, kemudian dievaporasi menggunakan rotary evaporator pada suhu 40ºC. Ekstrak ditepatkan sampai mencapai 5 mL dan disimpan beku pada suhu -20ºC sampai dilakukan analisis.
hingga didapatkan nilai absorbansi dibawah 1. Ekstrak sampel kemudian dilarutkan dalam buffer asetat pH 4.5, dengan pengenceran yang sama. Sampel yang dilarutkan pada buffer pH 4.5 dibiarkan selama 5 menit, sebelum diukur absorbansinya. Absorbansi dari kedua larutan diukur pada panjang gelombang 510 dan 700 nm dengan buffer pH 1.0 dan 4.5 sebagai blanko. Absorbansi untuk masing-masing ekstrak pada panjang gelombang 510 dan 700 nm, dihitung
%b/b = Kandungan antosianin (dalam %)
= Koefisien ekstingsi molar sianidin-3-rutinosida = 28.800 L cm-1 L = Lebar kuvet
MW = Bobot molekul sianidin-3-rutinosida = 445.2 g mol-1 DF = Faktor pengenceran
V = Volume akhir/volume ekstrak pigmen (L) Wt = Bobot sampel (g)
Ekstraksi dan Analisis Komponen Total Fenolat
Analisis kadar total fenolat pada tepung umbi dilakukan dengan menggunakan metode kolorimetri (Chaovanalikit dan Worldstat 2004). Tepung umbi diekstrak menggunakan metanol dengan nisbah 1:20. Tepung dimaserasi pada suhu 5ºC selama 12 jam. Residu disaring, dan diekstrak kembali sampai tepung berwarna pucat. Filtrat disatukan, kemudian dievaporasi menggunakan rotary evaporator pada suhu 40ºC. Ekstrak ditepatkan sampai mencapai 5 mL, kemudian disimpan beku pada suhu -20ºC sampai dilakukan analisis. Kurva standar asam galat diperoleh dengan mengukur panjang gelombang berbagai konsentrasi asam galat di dalam air deionisasi (0, 40, 80, 120, 160, dan 200 ppm) yang direaksikan dengan 0.5 mL reagen Folin-Ciocalteu 50%. Campuran diinkubasi pada suhu ruang selama 10 menit dan ditambahkan dengan 1.5 mL sodium karbonat 2%, kemudian dipanaskan di dalam penangas air pada suhu 40ºC selama 20 menit agar warna terbentuk, dan segera didinginkan. Absorbansi dari larutan diukur pada panjang gelombang 755 nm. Absorbansi dan konsentrasi asam galat dihubungkan pada grafik, dan dihitung persamaan garisnya. Sampel diperlakukan sama dengan standar, dan diukur absorbansinya. Absorbansi sampel kemudian dimasukkan ke persamaan garis, dan konsentrasi total fenolat dihitung sebagai mg ekuivalen asam galat per 100 g tepung DA.
Ektraksi dan Analisis Kandungan Diosgenin
(4-methoxybenzaldehyde) disiapkan. Kandungan diosgenin ditentukan berdasarkan reaksi warna dengan dua pereaksi pembentuk warna yaitu : (A) 0.5 ml p-anisaldehid dan 99.5 mL etil asetat, dan (B) 50 mL asam sulfat pekat dan 50 mL etil asetat. 200 μL ekstrak metanol ditempatkan pada tabung, dan metanol dievaporasi dengan gas nitrogen. Residu ini kemudian dilarutkan dalam 2 mL etil asetat; dan ditambahkan masing-masing 1 mL reagen A dan B. Sampel ditempatkan pada penangas air pada suhu 60ºC selama 10 menit agar warna terbentuk, kemudian didinginkan selama 10 menit pada suhu 25ºC. Selanjutnya absorbansi diukur pada panjang gelombang 430 nm dengan menggunakan spektrofotometer. Etil asetat digunakan sebagai kontrol blanko. Untuk pembuatan kurva standar, 2-40 μg standar diosgenin dilarutkan dalam 2 mL etil asetat dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang yang sama.
Analisis Kapasitas Antioksidan
Uji kapasitas antioksidan dilakukan dengan mengunakan metode Chaovanalikit dan Worldstat (2004). Prinsip dari metode ini adalah dengan mengukur efek pembersihan radikal DPPH (1,1-diphenyl-picrylhydraziyl) oleh ekstrak sampel. Sebagai standar digunakan trolox (,6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethyl-chroman-2-carboxylic acid 97 ), α-tocoferol, dan ascorbic acid. Metanol, buffer asetat, standar atau sampel dan larutan DPPH dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Sebagai blanko digunakan methanol dan DPPH. Campuran diinkubasi kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang 517 nm. Nilai kapasitas antioksidan merupakan selisih antara nilai absorbansi DPPH dengan nilai absorbansi sampel. Kurva standar trolox, vitamin E, dan vitamin C dibuat dengan cara menghubungkan nilai konsentrasi standar dengan nilai kapasitas antioksidan. Nilai kapasitas antioksidan sampel diperoleh dengan memasukkan nilai kapasitas antioksidan sampel ke dalam persamaan kurva standar sehingga diperoleh nilai kapasitas antioksidan dengan satuan mL ekuivalen trolox/α-tokoferol/asam askorbat /100 g tepung DA.
Pengujian Aktivitas Enzim Polifenol Oxidase (PPO)
Disain Penelitian dan Analisis Data
Disain penelitian ini adalah rancangan acak kelompok dengan tiga ulangan. Data dianalisis menggunakan uji T, analisis varian (ANOVA) dan uji lanjut beda nyata terkecil (BNT), untuk mengetahui perbedaan antarperlakuan. Data dikatakan berbeda secara nyata jika nilai P lebih kecil dari 0.05. Semua data disajikan dalam bentuk rata-rata ± standar deviasi.
2.3 Hasil dan Pembahasan
Tepung Umbi dan Komposisi Proksimat
Umbi DA yang digunakan dalam penelitian ini berwarna ungu. Umbi memiliki ukuran yang bervariasi dengan diameter antara 30–40 cm dengan bobot rata-rata 2−3 kg per umbi (Gambar 2.2). Kulit umbi DA cukup tebal, bobotnya sekitar sepertiga dari total bobot umbi. Daging umbi berwarna putih dengan banyak bintik-bintik ungu yang menyebar. Mendekati kulit, daging umbi berwarna ungu kehitaman. Saat daging umbi dipotong, warnanya berubah menjadi kecokelatan tanda bahwa terjadi oksidasi terhadap komponen fenolat dengan adanya enzim PPO endogen. Untuk mencegah oksidasi, daging umbi tidak dapat terbuka lama di udara, segera setelah dipotong, umbi harus segera dipreparasi dengan menggunakan perendaman di dalam asam sitrat.
Gambar 2.2 Umbi Dioscorea alata dan tepung umbi
Pembuatan tepung umbi menghasilkan rendemen sebesar 34.5%. Rendeman ini dihitung berdasarkan rasio bobot tepung terhadap bobot umbi yang telah dikupas. Tepung yang diproduksi berwarna ungu (Gambar 2.2), akan tetapi perlakuan dengan perendaman asam sitrat 0% menghasilkan tepung yang berwarna kecokelatan. Tepung yang dihasilkan segera dikemas dalam aluminium foil, dan disimpan di dalam lemari pembeku pada -20ºC sampai dilakukan analisis.
lama konsentrasi
Tepung umbi yang dihasilkan memiliki komposisi proksimat yang berbeda dari umbi segar. Komponen yang berubah drastis akibat proses pengeringan, adalah kadar air dan kadar karbohidrat. Kadar air mengalami penurunan dari 77.16% menjadi antara 8.36–9.05%. Penurunan ini menyebabkan proporsi total padatan dan komponennya meningkat. Pengolahan tepung dengan perlakuan perendaman pada konsentrasi asam sitrat dan lama steam blanching yang berbeda tidak menyebabkan perbedaan yang nyata terhadap komposisi proksimat tepung yang dihasilkan, kecuali pada kadar lemak (p ≤ 0.05) (Lampiran 1).
Tabel 2.1 Komposisi proksimat umbi segar dan tepung DA dengan perlakuan perendaman dalam beberapa konsentrasi asam sitrat dan lama steam blanching
*Nilai yang diikuti dengan huruf yang berbeda pada kolom yang sama
menunjukkan per edaan yang nyata (p ≤ 0.05)
Penurunan kadar air menjadi di bawah 10% meningkatkan stabilitas pangan karena terbatasnya air yang tersedia untuk pertumbuhan mikrob atau reaksi biologis. Penurunan kadar air dapat menstabilkan senyawa bioaktif yang terdapat di dalam umbi. Kadar air merupakan hal penting untuk menghambat oksidasi komponen bioaktif, dimana oksidasi komponen bioaktif akan lebih intensif terjadi pada kadar air yang lebih tinggi (Stratil et al. 2006). Akan tetapi, proses pengeringan itu sendiri juga merupakan hal penting yang harus dikontrol, karena suhu pengolahan dapat menurunkan total fenolat, sehingga akan menurunkan aktivitas penangkapan radikal dan menurunkan kapasitas antioksidannya (Chung et al. 2008).
Total Antosianin, Fenolat, Diosgenin, dan Serat Pangan
Retensi
perbedaan pH. Total antosianin dihitung menggunakan koefisien molar ekstingsi dari cyanidin-3-rutinosida, yaitu 28.800 L cm-1 mol-1 dengan bobot molekul 445.2 mol-1. Pada pH 1, antosianin membentuk kation flavilium yang berwarna merah, sedangkan pada pH 4.5 antosianin pada umumnya ditemukan dalam bentuk hemiketal yang tidak berwarna.
Tabel 2.2 menunjukkan bahwa tepung yang dihasilkan dengan perendaman di dalam asam sitrat 1% memiliki total antosianin yang paling tinggi pada setiap level lama blanching (P ≤ 0.05, Lampiran 2). Peningkatan konsentrasi asam sitrat sebesar 0.5 % meningkatkan total antosianin secara nyata (P ≤ 0.05). Perendaman umbi DA di dalam asam sitrat ditujukan untuk menstabilkan kandungan antosianin dengan cara menurunkan pH larutan. Pada konsentrasi asam sitrat 0%, 0.25%, 0.5% dan 1%, pH larutan berturut-turut adalah 6.0, 5.4, 4.8, dan 4.3.
Tabel 2.2 Total antosianin tepung DA dengan perlakuan perendaman dalam beberapa konsentrasi asam sitrat dan lama steam blanching
*Nilai yang diikuti dengan huruf yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan per edaan yang nyata (p ≤ 0.05)
Retensi
Tepung yang dihasilkan dengan perlakuan steam blanching selama 10 menit menghasilkan kadar total antosianin yang lebih tinggi secara bermakna pada setiap level asam sitrat (p ≤ 0.05) (Tabel 2.2). Steam blanching ditujukan untuk menginaktivasi enzim PPO yang berperan sebagai katalis dalam oksidasi komponen fenolat. Enzim PPO merupakan katalis yang sangat efektif, karena memiliki kemampuan untuk menurunkan energi aktivasi dari sebuah reaksi oksidasi sehingga lebih mudah terjadi (Knowles 1991). Dengan kecukupan blanching, aktivitas enzim PPO menurun sehingga degradasi antosianin karena oksidasi juga dapat dihambat.
Hasil analisis kandungan total fenolat sesuai dengan kandungan total antosianin. Perlakuan perendaman asam sitrat mempengaruhi kandungan total fenolat secara nyata (p ≤ 0.05) (Lampiran 3). Perendaman potongan umbi di dalam larutan 1% asam sitrat menghasilkan kandungan total fenolat yang paling tinggi pada setiap level lama blanching (p ≤ 0.05) (Tabel 2.3). Pengaruh perendaman menggunakan asam dilakukan oleh Khrisnan et al. (2010), menunjukkan bahwa indeks pencokelatan sering digunakan sebagai tingkat oksidasi oleh fenolat, di mana warna yang lebih cerah mengindikasikan rendahnya oksidasi komponen fenolat. Pada penelitian tersebut ditemukan bahwa indeks pencokelatan yang paling rendah, yang mengindikasikan tingginya kadar fenolat, terdapat pada perlakuan yang direndam di dalam asam sitrat.
Tabel 2.3. Total fenolat tepung DA dengan perlakuan perendaman dalam beberapa konsentrasi asam sitrat dan lama steam blanching
*Nilai yang diikuti dengan huruf yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan per edaan yang nyata (p≤0.05)
bertujuan untuk menginaktivasi enzim PPO yang dapat mendegradasi antosianin dan komponen fenolat pada umumnya. Cara blanching dengan menggunakan steam (uap) telah digunakan untuk menstabilkan antosianin pada buah ceri. Dimana, ceri yang diblanching dengan cara ini memiliki kandungan total antosianin yang lebih banyak dibandingkan yang tidak diblanching. Dengan steam blanching, enzim PPO diinaktivasi secara total, sehingga antosianin tidak terdegradasi (Lee et al. 2002).
Kandungan total antosianin dan fenolat sejalan dengan pengukuran aktivitas enzim PPO, dimana pada perlakuan yang menghasilkan kandungan fenolat yang tinggi, ternyata perlakuan itu dapat mengurangi aktivitas enzim PPO). Perlakuan perendaman asam sitrat pada konsentrasi 0.25% dapat menurunkan aktivitas enzim PPO menjadi setengah dari aktivitas awal, dan peningkatan konsentrasi menjadi 0.5% menurunkan aktivitas enzim ini secara bermakna (p ≤ 0.05) (Gam ar 2.3).
Gambar 2.3 Penurunan aktivitas PPO dengan perlakuan perendaman asam sitrat (A) dan lama steam blanching (B).
Secara umum enzim tidak stabil di semua tingkat pH sehingga sangat penting mengetahui kisaran pH pada saat enzim dalam keadaan stabil. PPO memiliki aktivitas yang optimal pada pH antara 6.0-6.5, dengan sedikit aktivitas pada pH di bawah pH 4.5 (Whitaker 1994). Perendaman di dalam 1% asam sitrat akan menurunkan pH jaringan umbi DA ke pH 4.3. Penggunaan zat pengasam ini dapat menurunkan aktivitas enzim PPO. Pada pH yang rendah, aktivitas enzim dapat diperoleh pada pH di bawah 3 (Richardson dan Hyslop 1985).
Enzim polifenol oksidase (PPO) merupakan enzim yang mengandung Cu, dapat mengkatalisis oksidasi komponen o-difenol menjadi o-quinone. Kuinon ini sangat reaktif dan secara cepat mengalami oksidasi, polimerisasi, dan bereaksi dengan molekul kuinon lainnya dengan komponen fenolik atau dengan amino grup dari protein. Polimerisasi ini membentuk pigmen berwarna cokelat yang disebut melanin. Aktivitas PPO sangat dipengaruhi oleh keberadaan oksigen, adanya substansi pereduksi, ion metal, pH, dan suhu (Carbonaro et al. 2001). Keberadaan Cu pada PPO sangat penting sehingga keberadaan agen pengkelat yang dapat membentuk kompleks dengan Cu dapat menjadi inhibitor aktivitas enzim ini. Asam sitrat merupakan senyawa yang memiliki kemampuan mengkelat Cu dan membentuk senyawa kompleks. Dengan dikelatnya Cu, kemampuan PPO dalam mengkatalisis reaksi oksidasi senyawa fenolat menjadi berkurang. Dalam hal ini, efek penghambatan asam sitrat terhadap aktivitas PPO adalah melalui dua mekanisme, yaitu sebagai asidulan yang menurunkan pH dan agen pengkelat (Pilizota dan Subaric 1998)
Interaksi antara perendaman asam sitrat konsentrasi 1% dan 10 menit steam blanching menghasilkan nilai antosianin dan total fenolat yang paling tinggi, yaitu antosianin sebesar 104.6 mg/100 g tepung dan total fenolat 198.52 mg ekuvalen asam galat/100 g tepung. Efek penurunan pH dari perlakuan perendaman dalam 1% asam sitrat yang dikombinasikan dengan kecukupan perlakuan panas selama 10 menit dengan steam blanching ini, berhasil mempertahankan antosianin dan komponen fenolat di dalam tepung DA berturut-turut sebanyak 44.51% (Tabel 2.2) dan 62.58% (Tabel 2.3) dari yang terdapat pada umbi segar.
Perlakuan perendaman di dalam asam sitrat terutama pada 0.5% dan 1% mempengaruhi kadar diosgenin (p≤0.05) (Lampiran 4), akan tetapi blanching tidak mempengaruhi kadar diosgenin pada tepung yang dihasilkan (p=0.9171) (Tabel 2.4). Diosgenin merupakan aglikon dari saponin steroid yang terdapat pada umbi DA. Penelitian oleh Yang et al. (2009) menemukan bahwa diosgenin bersifat stabil terhadap perlakuan blanching dan pengeringan. Konsentrasi asam sitrat 0.5% dan 1% pada setiap taraf steam blanching menghasilkan kadar diosgenin yang paling tinggi, dengan retensi paling tinggi sebesar 88%.
Lama Konsentrasi blanching mempengaruhi kandungan serat pangan (Tabel 2.5) (Lampiran 1).
Tabel 2.4 Total diosgenin tepung DA dengan perlakuan perendaman dalam beberapa konsentrasi asam sitrat dan lama steam blanching
*Nilai yang diikuti dengan huruf yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan per edaan yang nyata (p ≤ 0.05)
Tabel 2.5 Total serat pangan tepung DA dengan perlakuan perendaman dalam beberapa konsentrasi asam sitrat dan waktu steam blanching
Waktu Konsentrasi
Nilai kapasitas antioksidan pada penelitian ini dinyatakan sebagai mg ekuivalen trolox, asam askorbat, dan α-tokoferol sebagai standar. Nilai kurva standar trolox, asam askorbat, dan α-tokoferol diperoleh dengan menghubungkan beberapa tingkat konsentrasi standar-standar ini (dari 250 sampai 2000 ppm) (sebagai axis X) dengan selisih nilai absorbansi antara larutan radikal bebas DPPH dengan absorbansi larutan setelah penambahan standar, yang diukur pada panjang gelombang 517 nm (sebagai axis Y). Perbedaan nilai absorbansi ini disebut kapasitas antioksidan. Korelasi antara kedua variabel ini digunakan untuk membuat persamaan garis. Semakin tinggi korelasi maka semakin akurat prediksi yang dapat dibuat menggunakan kurva standar ini. Persamaan regresi (r2) dihitung untuk memprediksi hubungan antara dua variabel. Semakin dekat nilai r2 pada nilai 1, korelasi antara dua variabel adalah semakin sempurna. Standar kurva trolox, asam askorbat, dan α-tokoferol yang diperoleh pada penelitian ini memiliki nilai r2 yang baik, yaitu sebesar 0.9947, 0.9904, dan 0.9856 (Lampiran 5).
Perlakuan steam blanching mempengaruhi kapasitas antioksidan secara nyata (p ≤ 0.05) (Lampiran 5). Sepuluh menit steam blanching meningkatkan nilai kapasitas antioksidan pada setiap taraf konsentrasi asam sitrat. Nilai kapasitas antioksidan yang tertinggi adalah setara dengan 1300 mg trolox, 878 mg asam askorbat dan 3249 mg α-tokoferol per 100 g tepung DA (Tabel 2.6). Steam blanching merupakan faktor yang lebih menentukan kapasitas antioksidan dibandingkan dengan perendaman asam sitrat. Perbedaan konsentrasi asam sitrat pada setiap taraf lama steam blanching tidak menyebabkan perbedaan nilai kapasitas antioksidan secara nyata. Proses blanching bertujuan menginaktivasi enzim PPO yang dapat mendegradasi antosianin dan komponen fenolat pada umumnya. Cara blanching dengan menggunakan steam (uap) telah terbukti dapat mempertahankan kandungan antosianin, karena enzim PPO diinaktivasi secara total, sehingga antosianin tidak terdegradasi (Lee et al. 2002).
Tabel 2.6 Nilai kapasitas antioksidan tepung DA menurut perlakuan
*Nilai yang diikuti dengan huruf yang berbeda pada kolom yang sama Menunjukkan per edaan yang nyata (p ≤ 0.05)
menghasilkan nilai kapasitas antioksidan yang lebih tinggi (Gambar 2.6). Kandungan fenolat diketahui memiliki korelasi yang tinggi dan merupakan kontributor utama terhadap kapasitas antioksidan (Du et al. 2009). Kadar antosianin dan fenolat di dalam tepung umbi berhubungan dengan kapasitas antioksidan dalam membersihkan radikal DPPH. Akan tetapi kapasitas antioksidan ini kurang berhubungan dengan kandungan diosgenin tepung DA. Analisis korelasi Pearson menunjukkan bahwa nilai korelasi antara kapasitas antioksidan dan kandungan antosianin adalah sebesar 0.6993, sedangkan korelasi kapasitas antioksidan dengan total fenolat adalah 0.5419.
Gambar 2.6 Kadar total fenolat, antosianin dan diosgenin dan hubungannya dengan kapasitas antioksidan setara mg trolox, asam askorbat, dan
α-tokoferol
2.4 Simpulan
3 STRES OKSIDATIF PADA KELINCI YANG DIBERI
RANSUM TINGGI KOLESTEROL BERSAMAAN DENGAN
EKSTRAK AIR ATAU TEPUNG UMBI
DIOSCOREA ALATA
Oxidative Stress on Rabbits Fed with High Cholesterol diet co-administration with Water Extract or Flour of Dioscorea alata
Abstract
Antioxidation effect of Dioscorea alata (DA) extract and tuber flour was studied in New Zealand White male rabbits for 60 days. DA tuber had potency to prevent oxidative stress with the bioactive compounds anthocyanin. Anthocyanin could prevent LDL oxidation from reactive oxygen species (ROS) through free radical scavenging activities, hydrogen atom donor, or metal chelating activities. The level of serum SOD in rabbits fed with DA flour was higher than those fed with high cholesterol diets (K1). The administration of high cholesterol diets co-administrated with 30% DA flour (KT2), gave serum SOD level that equal to those fed with basal diets (K0). However the treatment did not affect another oxidative stress parameters such as the GSHPx and malondialdehyde level. This proposed that bioactive compound play role more in scavenged anion superoxide radical, rather than the hydroxil radicals. Histological analysis on kidney tissue showed that co-administration of 15% and 30% DA flour could improve the
morphology of kidney’s tissue and decrease the number of immune cells
penetrate, degenerative cells and necrosis cells. Imunohistochemical analysis showed that the content of Cu,Zn SOD in kidney tissue could be maintained with such treatments.
Keywords: Dioscorea alata, anthocyanins, diosgenin, oxidation, SOD
Abstrak
Analisis histologi pada jaringan ginjal kelinci menunjukkan bahwa pemberian 15% dan 30% tepung DA mampu memperbaiki gambaran jaringan ginjal dan menurunkan jumLah sel-sel radang, degeneratif, dan nekrosis. Analisis imunohistokimia menunjukkan bahwa pemberian 15% dan 30% tepung DA dapat mempertahankan kandungan Cu,Zn-SOD pada tubuli renalis.
Kata Kunci: Dioscorea alata, antosianin, diosgenin, oksidasi, SOD
3.1 Pendahuluan
Stres oksidatif merupakan kondisi adanya ketidakseimbangan antara pembentukan radikal bebas reaktive oxygen species (ROS) atau reaktive nitrogen species (RNS) dengan antioksidan yang ada di dalam tubuh (Turrens 2003). Secara alami, ROS diproduksi sebagai respons normal dari proses biokimia di dalam tubuh (Muchtadi 2012), dan untuk mengatasi pengaruh merusak dari ROS ini, jaringan mensintesis enzim-enzim antioksidan intrasel yang berperan sebagai antioksidan endogen dalam bentuk enzim, misalnya glutation peroksidase (GSHPx), katalase, dan superoksida dismutase (SOD) (Halliwel dan Gutteridge 1992).
Kondisi hiperlipidemia merupakan kondisi yang dapat meningkatkan stres oksidatif. Tingginya kadar LDL pada serum menyebabkan LDL lebih mudah berinfiltrasi ke dalam sel-sel endotelial, terjebak di dalam matriks, dan teroksidasi oleh ROS yang dikeluarkan oleh sel-sel endotel dan sel-sel otot halus pada dinding arteri (Berliner 1995). Infiltrasi LDL menyebabkan terjadinya inflamasi pada sel-sel endotel. Hal ini akan meningkatkan ekpresi NADPH oksidase dan produksi radikal superoksida (O2.-) (Griendling dan Fitsgerald 2003). LDL yang terperangkap teroksidasi oleh ROS, dan menghasilkan peroksidasi lipida yang menghasilkan produk samping, seperti malondialdehida dan hidroksil yang dapat menyebabkan kerusakan sel dan jaringan (Ostalowska et al. 2006).
tidak langsung menunjukkan tingkat kerusakan membran yang disebabkan oleh radikal bebas (Yuan et al. 2008).
Antioksidan yang berasal dari makanan dapat membantu “melawan” ROS dan radikal bebas sehingga dapat mencegahan oksidasi LDL. Pemberian flavonoid dari makanan juga memberikan aktivitas antioksidan yang dapat menghambat oksidasi LDL melalui beberapa mekanisme seperti membersihkan radikal bebas, agen pereduksi, mendonorkan atom hidrogen, pengkelatan ion metal, melindungi sel dari kerusakan oksidatif, menghambat lipoksigenase (Aviram dan Furhman 2003). Salah satu komponen flavonoid yang memiliki aktivitas antioksidan yang poten adalah antosianin. Diketahui bahwa kapasitas antioksidan antosianin lebih tinggi daripada butylated hydroxyanisole (BHA), alpha-tocopherol (Vit E), 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethychromane-2-carboxylic acid (Trolox), cathecin, dan quercetin dan kemampuan antioksidasi ini dapat melindungi oksidasi LDL secara in vitro (Kahkonen dan Heinonen 2003).
Antosianin merupakan bagian dari komponen fenolat tumbuhan yang diklasifikasikan termasuk dalam grup flavonoid. Terdapat 17 jenis antosianin di alam, akan tetapi hanya 6, yaitu sianidin, delfinidin, petunidin, peonidin, pelargonidin dan malvidin, yang terdapat banyak dalam makanan (Crozier 2007). Antosianin dalam bentuk mono dan di-asilasi sianidin dan peonidin, dapat bereaksi dengan ROS dengan sangat mudah karena kekurangan elektron, dan diketahui merupakan bentuk antioksidan yang lebih poten dibandingkan dengan bentuk antosianian lainnya. Dua jenis antosianin yang poten ini yaitu sianidin dan peonidin 3-gentiobioside yang terasilasi dengan asam sinapik telah berhasil diisolasi dari umbi Dioscorea alata (Shoyama et al. 1990).
Komponen lain yang memiliki manfaat dalam mencegah oksidatif stres yang berkaitan dengan kesehatan pembuluh darah adalah diosgenin, yang merupakan aglikon dari saponin tumbuhan. Studi yang dilakukan oleh Gong et al. (2010) menunjukkan bahwa diosgenin memiliki kemampuan dalam meningkatkan aktivitas enzim superoxide dismutase (SOD) dan GSHPx sehingga dapat melindungi dari radikal bebas dan menurunkan pembentukan malondialdehid.
Beberapa penelitian menunjukkan bahwa umbi Dioscorea alata (DA) dapat menurunkan total kolesterol, LDL-kolesterol, dan triasilgliserol pada darah tikus percobaan (Hang 1994). Penelitian lain menunjukkan bahwa musilase yang terdiri atas glikoprotein, serat pangan dan diosgenin, dapat memodulasi metabolisme lipid sehingga menurunkan total kolesterol, LDL kolesterol pada tikus yang hiperkolesterolemia (Chen et al. 2003, Shunjun et al. 2007). Dengan potensinya tersebut di atas, maka penelitian ini dilakukan mengetahui efek pemberian ekstrak dan tepung DA untuk menurunkan stres oksidatif pada kelinci percobaan yang diberi ransum tinggi kolesterol.
3.2 Metode Penelitian
Bahan dan Peralatan Penelitian
Indofeed di Bogor, kolesterol (Sigma C8503), ADP, formalin, CuSO4, parafin, silol, alkohol 70%, alkohol 80%, alkohol90%, alkohol 95%, alkohol absolut, hematoxylin, eiosin, larutan H2O2, PBS (Phosphate Buffer Saline), antibodi primer anti Cu, Zn-SOD, Antibodi sekunder DEPS (Dako Envision Peroxidase System), larutan diaminobenzidine (DAB), dan entellant.
Alat-alat yang digunakan adalah shaker, sentrifus, freeze drier, spektrofotometer, kandang dan seperangkat alat pemeliharaan kelinci, alat-alat pengambilan darah, embedding tissue console, mikrotom, inkubator, alat-alat pewarnaan histologis, mikroskop cahaya (Olympus Vanox), kamera (Nikon D5000), dan alat-alat gelas lainnya.
Pembuatan Serbuk Ekstrak Air Tepung DA
Serbuk ekstrak air DA dibuat dengan cara mengekstrak 150 g tepung DA dengan menggunakan 1.8 L air (nisbah 1:9). Untuk keperluan pembuatan ransum, ditambahkan 1% (18 g) maltodekstrin sebagai bahan pengisi. Tujuan penggunaan dekstrin ini adalah untuk menghasilkan ekstrak kering yang relatif bagus dan memudahkan penggunaannya. Hasil penelitian pendahuluan menunjukkan bahwa ekstrak air DA yang dikeringkan tanpa menggunakan maltodekstrin, produknya lengket pada wadah, tidak terbentuk serbuk, dan warnanya ungu kehitaman. Ekstrak kering DA di dalam maltodekstrin ini mengandung 25 g antosianin per 100 g ekstrak.
Persiapan Ransum
Ransum diformulasi berdasarkan kebutuhan gizi untuk pertumbuhan normal kelinci dewasa (Lebas et al. 1997). Bahan yang menyumbangkan senyawa fenolat selain umbi DA tidak dimasukkan ke dalam komponen ransum. Perhitungan komposisi ransum dilakukan dengan menggunakan program WUFFDA (Windows-Based User Friendly Feed Formulation Workbook) versi 3 (Thomson 2009), untuk mendapatkan ransum yang isokalori dan isoprotein. Ransum dibuat setiap dua minggu sekali, sebelum digunakan, ransum disimpan di dalam freezer untuk mempertahankan kualitas.
Komposisi bahan penyusun ransum adalah seperti tercantum dalam Tabel 3.1. Ransum dibuat setiap dua minggu sekali, dan disimpan beku sebelum digunakan. Untuk membuat ransum 0.5% kolesterol, 50 g kolesterol dicampurkan dengan 50 g bahan ransum basal, kemudian dibuat pellet. 1 g dari campuran ini (mengandung 0.5 g kolesterol) diaduk dengan 19 g pellet ransum basal, sehingga diperoleh 20 g ransum tinggi kolesterol. Ransum tinggi kolesterol ini diberikan terlebih dahulu kepada kelinci pada kelompok kolesterol untuk dimakan. Setelah itu, ransum basal ditambahkan sebanyak 80 g. Sehingga total ransum diberikan adalah 0.5 g kolesterol di dalam 100 g ransum basal/hari
