BAB IV HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN

14 

Loading....

Loading....

Loading....

Loading....

Loading....

Teks penuh

(1)

4.1 Hasil Penelitian

4.1.1 Penentuan Suhu Optimum Alkalin Protease

Data rata - rata aktivitas enzim tiap variasi suhu disajikan pada Tabel 4.1. Data selengkapnya disajikan pada lampiran 3.

Tabel 4.1 Karakterisasi Suhu Optimum Alkalin Protease

Suhu (oC) Rata-rata Aktivitas (U/ml)

30 0,248 ± 1,453 x 10-2 d

0,290 ± 9,04 x 10-3 c 0,359 ± 2,409 x 10-2 b 0,405 ± 1,477 x 10-2 a 0,371 ± 8,860 x 10-3 a b 40

50 60 70

Keterangan: Huruf berwarna merah menunjukan grouping data berdasarkan Tukey’s Confidence Interval dengan Pvalue > 0,05. Huruf yang berbeda menandakanperbedaan

signifikan.

Hasil analisis statistik data (lampiran 4), terlihat data rata-rata aktivitas karakterisasi suhu tersebut berdistribusi normal dan homogen ditandai nilai Pvalue

> 0,05. Karena data normal dan homogen, analisis dilanjutkan dengan uji statistik one way ANOVA. Dari hasil uji Tukey’s Confidence Interval, terlihat perlakuan uji aktivitas pada suhu 60oC memiliki nilai aktivitas yang berbeda signifikan dengan

yang dilakukan pada suhu 30,40, dan 50oC. Sementara perlakuan uji pada suhu

70oC tidak berbeda signifikan dengan suhu 50 mapupun 60oC. Meskipun 60oC tidak

berbeda signifikan dengan 70oC, 60oC tetap berbeda signifikan dengan suhu-suhu

lainnya dan memiliki nilai rata-rata aktivitas yang paling tinggi sehingga dapat disimpulkan uji aktivitas optimum dilakukan pada suhu 60oC.

(2)

4.1.2 Penentuan pH Optimum Alkalin Protease

Data rata - rata aktivitas enzim tiap variasi pH disajikan pada Tabel 4.2. Data selengkapnya disajikan pada lampiran 3.

Tabel 4.2 Karakteriasi pH Optimum Alkalin Protease

pH Rata-rata Aktivitas (U/ml)

7 0,305 ± 1,625x 10-2 b

0,349 ± 2,946 x 10-2 a b 0,348 ± 2,044 x 10-2 a b

0,406 ± 2,061 x 10-2 a 0,368 ± 1,982 x 10-2 a 8

9 10 11

Keterangan: Huruf berwarna merah menunjukan grouping data berdasarkan Tukey’s Confidence Interval dengan Pvalue > 0,05. Huruf yang berbeda menandakan perbedaan

signifikan.

Hasil analisis statistik data (lampiran 4), terlihat data rata-rata aktivitas karakterisasi pH tersebut berdistribusi normal dan homogen ditandai nilai Pvalue >

0,05. Karena data normal dan homogen, analisis dilanjutkan dengan uji statistik one way ANOVA. Dari hasil uji Tukey’s Confidence Interval, terlihat perlakuan uji aktivitas pada pH 10 memiliki nilai aktivitas yang berbeda signifikan dengan yang dilakukan pada pH 7. Sementara perlakuan uji pada pH 10 tidak berbeda signifikan dengan pH 8, 9,dan 11. Namun, pH 7, 8, 9, dan 11 saling tidak berbeda signifikan satu sama lain sehingga dapat dikatakan ketiganya berasal dari satu grup yang sama. Selain itu, pH 10 memiliki nilai rata-rata aktivitas yang paling tinggi sehingga dapat disimpulkan uji aktivitas optimum dilakukan pada pH 10.

4.1.3 Pemurnian Dengan Presipitasi dan Dialisis

(3)

Tabel 4.3 Data Pemurnian Ekstrak Kasar Hingga Dialisis

Awal 120 228.5 186.1 22338.8 0.378 45.4 2,032 x 10-3

10% 10 169.2 140.7 1407.9 0.280 2.802 1,990 x 10-3 6.173 0.979

20% 1.5 173 108.9 163.4 0.286 0.429 2,629 x 10-3 0.946 1.293

30% 4 200.2 107.7 431.04 0.331 1.325 3,076 x 10-3 2.920 1.513

40% 4 138.4 103.3 413.5 0.229 0.917 2,218 x 10-3 2.020 1.091

50% 4 136.6 113.3 453.3 0.226 0.905 1,996 x 10-3 1.993 0.982

60% 4 144.2 89.8 359.4 0.238 0.955 2,657 x 10-3 2.103 1.307

70% 10 312.8 137.6 1376.06 0.518 5.180 3,764 x 10-3 11.408 1.852

80% 5 237.8 121.2 606.4 0.393 1.969 3,246 x 10-3 4.336 1.597

Dialisis 6 292.7 124.07 744.4 0.484 2.907 3,906 x 10-3 6.777 1.759

Keterangan: Data yang ditampilkan merupakan data rata-rata dari ketiga replikasi. Data lengkap disajikan pada Lampiran 5 Tabel 5.

4.1.4 Pemurnian Dengan Ion Exchange Chromatography (IEC)

Sampel yang dimurnikan pada tahap IEC adalah sampel hasil dialisis presipitasi ammonium sulfat 70%. Berikut adalah data IEC replikasi 1-3 .

Tabel 4.4 Hasil Rata-Rata IEC

9 1 27.458 83.086 0.045 83.086 0.54 x 10-3 0.1286 0.270

10 1 695.908 100 1.152 100 1.160 x 10-2 2.537 5.708

11 1 111.906 84.678 0.185 84.678 2.131 x 10-3 0.1906 1.048

(4)

12 1 47.810 65.577 0.079 65.577 1.371574 x 10-3 0.1435427 0.674

13 1 36.113 57.248 0.0532 57.248 4.01373 x 10-4 0.1240339 0.197

14 1 0 0 0 0 - -

-Keterangan : “ – “ berarti tidak dapat dihitung karena 0 / 0 . Yield dan purification factor dihitung terhadap ekstrak kasar enzim. Data yang ditampilkan merupakan data rata-rata dari ketiga replikasi. Data lengkap disajikan pada Lampiran 5 Tabel 7-9.

Fraksi ke-10 dipilih sebagai fraksi yang digunakan untuk SDS PAGE karena memiliki nilai yield dan purification factor terbaik.

Peningkatan hasil pemurnian pada setiap tahap, disajikan pada Tabel 4.5. Tabel 4.5 Perbandingan Tahap Pemurnian

Awal 120 228.533 186.156 22338.830 0.378 45.404 2,032 x

10-3 100 1

Presipitasi

70% 10 312.876 137.606 1376.066 0.518 5.180 3,764 x10-3 11.408 1.852

Dialisis 6 292.735 124.076 744.457 0.484 2.907 3,606 x

10-3 6.777 1.759

Keterangan: Yield dan purification factor dihitung terhadap ekstrak kasar enzim.

4.1.5 Penentuan Berat Molekul Protein Enzim dengan SDS PAGE

Hasil SDS PAGE disajikan pada Gambar 4.1

(5)

Gambar 4.1 SDS PAGE Sampel pada Tiap Tahap Pemurnian

Gambar 4.2 Hasil SDS PAGE pada Tahap IEC Replikasi 3 M IEC 3

CE M 70% 1 D 9 10 11 12 24

10,5

14 22 29 42 51 62 70 95 130 175

10,514 22 29 42 51 60 70 95 130 175 10,5

(6)

Gambar 4.3 Hasil SDS PAGE pada Tahap Pemurnian Replikasi 1 Keterangan : M : Marker Vivantis 100 kDA

70%-1,2,3 : Hasil Presipitasi 70% replikasi 1,2, dan 3 D-1,2,3 : Hasil Dialisis pada replikasi 1, 2, dan 3

IEC 1,2,3: Hasil IEC (fraksi 10) pada replikasi 1,2, dan 3 9,10,11,12,24 : Hasil IEC pada fraksi tersebut replikasi 1

Penentuan berat molekul protein dihitung dari persamaan regresi linear marker protein, antara jarak migrasi (sumbu x) dan log berat molekul (sumbu y). Persamaan yang didapat adalah y = -0,175 x + 2,130 R² = 0,955 (Lampiran 5). Hasil perhitungan berat molekul sampel ditunjukkan pada Lampiran 6 Tabel 10. Didapatkan band protein target sebesar 33,32 kDa.

(7)

Gambar 4.4 Isolat Bakteri

Isolat yang digunakan pada produksi enzim pada penelitian ini berasal dari limbah cair pemotongan hewan di Rumah Pemotongan Hewan (RPH) Jalan Pegiriaan, Surabaya. Limbah cair tersebut memiliki suhu sebesar 30oC dan pH 8. Dari

limbah tersebut, akan diisolasi bakteri yang akan menghasilkan enzim alkaline protease yang kemudian akan dimurnikan lebih lanjut. Untuk mendapatkan enzim alkaline protease tersebut, diperlukan proses produksi enzim. Produksi enzim dilakukan dengan cara menginokulasikan isolat bakteri terpilih ke dalam media susu skim cair yang merupakan media produksi enzim. Kemudian dilakukan inkubasi pada suhu 30oC selama 45 jam dengan agitasi 100 rpm. Menurut penelitian Widjaja (belum

dipublikasikan), suhu 30oC dipilih sebagai suhu optimum untuk produksi enzim

alkaline protease dan waktu optimum produksi enzim alkaline protease ialah 45 jam. Pemanenan enzim alkaline protease dilakukan dengan cara memisahkan hasil produksi enzim dengan sel bakteri melalui sentrifugasi. Sel bakteri yang memiliki densitas lebih berat akan mengendap sebagai pellet sedangkan enzim akan larut dalam air sehingga akan bertahan pada supernatant. Supernatan yang dihasilkan setelah sentrifugasi dianggap sebagai ekstrak kasar enzim alkaline protease. Pada penelitian ini, ekstrak kasar enzim yang didapatkan sebesar 360 ml dan akan dibagi untuk tiga replikasi pada tahap pemurnian.

(8)

Karakterisasi pH dan suhu optimum enzim dilakukan untuk mengetahui kondisi suhu dan pH yang paling baik bagi enzim untuk bekerja. Data ini digunakan untuk menentukan buffer pH yang digunakan untuk melarutkan pellet enzim di tahap berikutnya dan suhu yang digunakan untuk uji aktivitas di tahap pemurnian selanjutnya. Penentuan suhu optimum ditentukan dari nilai aktivitas enzim yang tertinggi. Larutan enzim tersebut diuji aktivitas dan kadar proteinnya, hasil uji tampak pada Tabel 4.1 dan Gambar 4.5.

Gambar 4.5 Grafik Karakterisasi Suhu Optimum Alkalin Protease

Aktivitas tertinggi diperoleh pada uji aktivitas yang dilakukan pada suhu 60oC,

yakni sebesar 0,405 U/ml. Hasil Tukey’s Confidence Interval (Tabel 4.1) menunjukan suhu optimum adalah 60oC. Limbah cair yang merupakan sumber isolat

penghasil enzim alkaline protease memiliki suhu 30oC. Hasil penelitian Soeka (2011)

menunjukan fenomena serupa dimana enzim alkaline protease yang berasal dari beberapa jenis Bacillus seperti Bacillus licheniformis dan Bacillus cereus yang ditumbuhkan pada suhu 37oC dapat menghasilkan enzim dengan suhu optimum

sebesar 60oC.

0,405

(9)

4.2.2 Penentuan pH Optimum

Hasil karakterisasi pH optimum enzim alkaline protease diperoleh aktivitas tertinggi pada pH 10. (Tabel 4.2 dan Gambar 4.6) .

Gambar 4.6 Grafik Karakterisasi pH Optimum Alkalin Protease

Aktivitas tertinggi diperoleh pada uji aktivitas yang dilakukan pada suhu 60oC

dan pH 10, yakni 0,406 U/ml. Hasil Tukey’s Confidence Interval (Tabel 4.2) menunjukan pH optimum adalah 10. Limbah cair yang merupakan sumber isolat penghasil enzim alkaline protease memiliki suhu 35oC dan pH sebesar 8. Hasil

penelitian Soeka (2011), mengatakan bahwa enzim alkaline protease yang berasal dari Bacillus cereus yang ditumbuhkan pada suhu 37oC dapat menghasilkan enzim

dengan suhu optimum sebesar 60oC dan pH 10.

4.2.3 Presipitasi dan Dialisis 4.2.3.1 Presipitasi Amonium Sulfat

Pada proses presipitasi ammonium sulfat, sampel yang digunakan ialah ekstrak kasar hasil pemanenan enzim alkaline protease. Presipitasi ammonium sulfat yang dilakukan memiliki tingkat kejenuhan 10%-80%. Dilakukan presipitasi secara bertahap dikarenakan protein enzim alkaline protease belum diketahui pasti mengendap pada kejenuhan tertentu sehingga diperlukan optimasi untuk mengetahui

0,305

0,349

0,348

0,406

(10)

di tingkat kejenuhan berapa enzim alkaline protease akan mengendap. Pelet dengan tingkat kejenuhan ammonium sulfat 70% memiliki aktivitas spesifik tertinggi yakni sebesar 3,766 x 10-3 µmol/µg.menit. Adanya kenaikan nilai aktivitas spesifik

dibandingkan ekstrak kasar awal menunjukkan adanya peningkatan kemurnian enzim. Hal ini juga didukung dengan kenaikan nilai purification factor sebesar 1,85. Terdapat penurunan nilai yield hingga 11,4%. Hal ini menunjukan bahwa tidak semua enzim target terndapkan pada tahap ini. Selain itu, adanya kemungkinan menurunnya nilai yield diakibatkan adanya aktivitas enzim yang hilang selama proses akibat denaturasi enzim.

4.2.3.2 Dialisis

Dialisis dilakukan setelah tahap presipitasi ammonium sulfat. Dialisis dilakukan untuk menghilangkan sisa garam amonium sulfat dalam proses presipitasi. Pemisahan protein enzim dengan garam berfungsi agar garam tidak mengganggu proses pemurnian selanjutnya, yakni IEC. Adanya garam dalam proses IEC akan menghambat proses penempelan protein enzim bermuatan dengan resin sehingga enzim tidak dapat terelusi dengan baik. Dalam penelitian ini dipakai tabung selofan merk Servapor yang memiliki MWCO 14.000, berarti garam amonium sulfat dapat keluar, namun protein tetap di dalam tabung selofan.

Pada proses dialisis didapatkan adanya penurunan nilai yield yang awalnya sebesar 11,4% menjadi 6,77%. Penurunan nilai yield ini diakibatkan penurunan aktivitas enzim saat proses dialisis. Penurunan nilai aktivitas dapat diakibatkan karena adanya aktivator logam yang kemungkinan juga ikut hilang selama proses dialisis. Enzim alkaline protease memiliki beberapa aktivator, yakni Zn2+, Fe2+, dan Ca2+

(Murdiyatmo, 2006). Peneliti menggunakan media susu skim sebagai media produksi enzim. Susu skim mengandung berbagai mineral, 67% diantaranya adalah ion kalsium dan beberapa persen ion Fe2+ (Pruitt, 2004). Adanya ion Ca2+ dan Fe2+ pada

(11)

Sedangkan nilai purification factor yang didapat cenderung tetap dibandingkan dengan presipitasi 70%.

4.2.4 Pemurnian Alkalin Protease dengan Metode IEC

Sampel yang dimurnikan lebih lanjut dengan metode IEC ini ialah sampel hasil dialysis. Diketahui pI enzim alkaline protease dari Bacillus diketahui berkisar antara 9 (Murdiyanto, 2006). Pada penelitian ini, ditemukan bahwa enzim alkaline protease yang didapatkan memiliki pI sebesar 8,8. Pada pengujian pH optimum enzim (Tabel 4.2), didapatkan aktivitas enzim alkalin protease yang paling optimum berada pada pH 10. Saat enzim berada dalam larutan dengan pH di atas nilai pInya, enzim tersebut cenderung berbentuk anion, sehingga dilakukan pemurnian dengan anion exchanger chromatography.

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

0 1 2 3 4 5 6

Fraksi

ke-Pu

rif

ca

to

n

Fa

ct

or

(12)

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Gambar 4.8 Hasil Yield Pemurnian Enzim dengan Metode IEC

Keterangan : Data grafik yield dan purification factor pemurnian enzim dengan metode IEC di atas merupakan data rata-rata. Data lengkap dapat dilihat pada

Lampiran 5 Tabel 7-9. Fraksi ke- 10 menunjukan peak terelusinya enzim alkalin protease.

Gambar 4.9 Grafik Nilai Purification Factor dan Yield pada Tahap Pemurnian.

Hasil purification factor dengan metode IEC (Gambar 4.7), menunjukan didapatkannya nilai purification factor sebesar 5,708. Fraksi ke 10 merupakan fraksi dengan kenaikan nilai purification factor terbaik. Kenaikan nilai purification factor ini

(13)

menandakan kenaikan kemurnian enzim. Sedangkan pada Gambar 4.8 disajikan data hasil yield dengan metode IEC dengan yield akhir sebesar 2,537%. Yield terbaik juga didapatkan pada fraksi ke 10 sehingga dapat disimpulkan fraksi ke 10 merupakan fraksi saat terelusinya enzim.

Pada Gambar 4.9 didapatkan tren data purification factor dan yield pada setiap tahap pemurnian. Nilai purification factor naik sebanyak 1 menjadi 5,708 terhadap ekstrak kasarnya. Kenaikan nilai purification factor ini menandakan keberhasilan proses pemurnian enzim. Fenomena lain ditunjukan oleh nilai yield pada tiap tahap pemurnian. Nilai yield turun dari 100% menjadi 2,537% terhadap ekstrak kasarnya. Penurunan nilai yield dikarenakan kemungkinan adanya aktivitas enzim yang mungkin hilang selama proses. Beberapa penyebab hilangnya atau turunnya aktivitas enzim selama pemurnian penelitian ini, antara lain dikarenakan denaturasi, proteolisis, serta hilangnya aktivator. Enzim protease akan cenderung mengalami proteolisis dimana enzim itu sendiri akan mengenali enzim alkaline protease lain sebagai substrat sehingga terjadi reaksi pemecahan enzim itu sendiri. Hal inilah yang dapat mengakibatkan kehilangan yield protein dalam suatu proses pemurnian (Roe, 2001). Sedangkan proses denaturasi kemungkinan terjadi saat proses pemurnian. Denaturasi enzim kebanyakan disebabkan karena proses handling enzim yang kurang tepat seperti enzim terlalu lama di suhu ruang.

4.2.5 Penentuan Berat Molekul Protein dengan SDS PAGE

(14)

Figur

Tabel 4.1 Karakterisasi Suhu Optimum Alkalin Protease
Tabel 4 1 Karakterisasi Suhu Optimum Alkalin Protease. View in document p.1
Tabel 4.2 Karakteriasi pH Optimum Alkalin Protease
Tabel 4 2 Karakteriasi pH Optimum Alkalin Protease. View in document p.2
Tabel 4.3 Data Pemurnian Ekstrak Kasar Hingga Dialisis
Tabel 4 3 Data Pemurnian Ekstrak Kasar Hingga Dialisis. View in document p.3
Tabel 4.4 Hasil Rata-Rata IEC
Tabel 4 4 Hasil Rata Rata IEC. View in document p.3
Tabel 4.5 Perbandingan Tahap Pemurnian
Tabel 4 5 Perbandingan Tahap Pemurnian. View in document p.4
Gambar 4.2  Hasil SDS PAGE pada Tahap IEC Replikasi 3
Gambar 4 2 Hasil SDS PAGE pada Tahap IEC Replikasi 3. View in document p.5
Gambar 4.3 Hasil SDS PAGE pada Tahap Pemurnian Replikasi 1
Gambar 4 3 Hasil SDS PAGE pada Tahap Pemurnian Replikasi 1. View in document p.6
Gambar 4.4  Isolat Bakteri
Gambar 4 4 Isolat Bakteri. View in document p.7
Gambar 4.6  Grafik Karakterisasi pH Optimum Alkalin Protease
Gambar 4 6 Grafik Karakterisasi pH Optimum Alkalin Protease. View in document p.9
Gambar 4.7 Hasil Purification Factor Pemurnian Enzim dengan Metode IEC
Gambar 4 7 Hasil Purification Factor Pemurnian Enzim dengan Metode IEC. View in document p.11
Gambar 4.8  Hasil Yield Pemurnian Enzim dengan Metode IEC
Gambar 4 8 Hasil Yield Pemurnian Enzim dengan Metode IEC. View in document p.12
Gambar 4.9 Grafik Nilai Purification Factor dan Yield pada Tahap Pemurnian.
Gambar 4 9 Grafik Nilai Purification Factor dan Yield pada Tahap Pemurnian . View in document p.12

Referensi

Memperbarui...