Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Efek Konsumsi Minuman Bubuk Kakao Bebas Lemak Terhadap Sifat Antioksidativ dan Proliferativ Limfosit Manusia adalah karya saya sendiri dengan bimbingan komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam tesis dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, Januari 2007
Erniati
NRP F251040271
! !" Efek Konsumsi Minuman Bubuk Kakao Bebas lemak Terhadap Sifat Antioksidativ dan Proliferativ Limfosit Manusia. Dibimbing oleh FRANSISKA R. ZAKARIA dan BAMBANG PONTJO PRIOSOERYANTO.
Banyak penelitian secara in vitro dan in vivo telah membuktikan efek kakao untuk kesehatan. Kakao kaya akan sumber antioksidan senyawa flavonoid seperti katekin, epikatekin dan prosianidin. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek konsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak hasil samping produksi lemak kakao terhadap sifat antioksidativ dan aktivitas proliferasi limfosit manusia.
Responden wanita yang sehat dibagi dalam dua kelompok yaitu kelompok kakao (n = 9) yang mengkonsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak yang dicampur dengan susu skim dan gula. Sedangkan kelompok kontrol (n = 9) mengkonsumsi minuman yang sama tetapi tanpa kakao. Semua responden menandatangani surat perjanjian (“inform consent”) dan menjalani pemeriksaan kesehatan oleh dokter yang berwenang sebelum dan sesudah intervensi. Pengambilan darah dilakukan untuk analisa sifat antioksidativ dan aktivitas proliferasi sel T dan sel B. Sifat antioksidativ yang diteliti terdiri dari nilai malonaldehida (MDA), aktivitas antiradikal bebas dengan metode DPPH, kadar glutation dan ketahanan sel limfosit terhadap oksidasi.
nyata (p < 0,05) terhadap formalin dan erithrosin setelah intervensi. Sedangkan ketahanan terhadap oksidasi oleh hidrogen peroksida juga meningkat walaupun secara statitistik tidak berbeda nyata (p > 0,05). Sementara itu aktivitas proliferasi sel T dan sel B kelompok kakao juga cenderung meningkat setelah konsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak walaupun secara statistik tidak berbeda nyata dengan kelompok kontrol (p > 0,096 untuk sel T dan p > 0,056 untuk sel B).
Secara keseluruhan dari hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa bubuk kakao bebas lemak hasil samping produksi lemak kakao dari perkebunan Indonesia mempunyai sifat antioksidativ yang tinggi, dapat melindungi sel limfosit terhadap oksidasi dan bersifat sebagai imunomodulator sehingga baik dikonsumsi sebagai pangan yang memberi manfaat untuk kesehatan.
! !" The Effect of Fat Free Cocoa Powder Driks Consumption on Antioxidative Activity and Lymphocyte Proliferative of Humans Subject. Di
bimbing oleh FRANSISKA R. ZAKARIA, and BAMBANG PONTJO
PRIOSOERYANTO.
Many researches have shown the potential effects of cocoa for health both in vivoandin vitro. Cocoa can be a rich source of flavonoid antioxidants such as catechin, epicatechin and procyanidin. The aim of this research was to evaluate the effect of Indonesian fat free cocoa powder drink consumption on antioxidative properties and proliferation activities of human lymphocyte.
#
Hak cipta milik Institut Pertanian Bogor, tahun 2007
Hak cipta dilindungi
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada
Judul Penelitian : Efek Konsumsi Minuman Bubuk Kakao Bebas Lemak Terhadap Sifat Antioksidativ dan Proliferativ Limfosit Manusia
Nama Mahasiswa : Erniati
NRP : F251040271
Disetujui
Komisi Pembimbing
Prof.Dr.Ir. Fransiska R.Zakaria, M.Sc Dr.Drh.Bambang Pontjo Priosoeryanto,MS
Ketua Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Ilmu Pangan Dekan Sekolah Pascasarjana IPB
Prof.Dr.Ir.Betty Sri Laksmi Jenie, MS Prof.Dr.Ir. Khairil Anwar Notodiputro, MS
Segala puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT yang telah memberikan rahmat dan karuniaNya sehingga tesis ini dapat penulis selesaikan. Thesis ini dibuat sebagai salah satu syarat mahasiswa program pascasarjana program S2 untuk meraih gelar Master pada Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Thesis yang ditulis ini merupakan laporan hasil penelitian yang dibiayai oleh dana Riset Unggulan Terpadu XII (RUT) tahap II tahun 2006 yang diketuai oleh Dr. Ir. Misnawi (Pusat Penelitian Kopi dan Kakao Indonesia di Jember) dan anggotanya Prof. Dr. Ir. Fransiska R. Zakaria, M.Sc. Oleh karena itu penulis mengucapkan terimakasih atas dana yang diberikan. Dalam penelitian ini penulis mencoba meneliti dengan topik Efek Konsumsi Minuman Bubuk Kakao Bebas Lemak Terhadap Sifat Antioksidativ dan Proliferativ Limfosit Manusia.
Dalam melakukan penelitian dan penulisan tesis ini penulis banyak mendapatkan bantuan dan bimbingan dari berbagai pihak. Ucapan terimakasih yang sangat tulus ingin penulis haturkan kepada Prof. Dr. Ir. Fransiska R. Zakaria, M.Sc yang telah meluangkan waktu dalam memberikan motivasi, nasehat, bimbingan dan saran bagi penyusunan tesis dan penyelesaian studi penulis dan juga telah memberikan dana untuk penelitian ini. Kepada Bapak Dr. Drh. Bambang Pontjo Priosoeryanto, MS penulis mengucapkan banyak terimakasih atas bimbingan, saran, perhatian dan memberikan izin kepada penulis menggunakan fasilitas Laboratorium Kultur Jaringan Bagian Patologi FKH selama penelitian. Penulis juga menyampaikan terimakasih kepada Bapak Dr. Ir. Feri Kusnandar, MSc yang telah bersedia menjadi dosen penguji pada ujian tesis dan memberikan banyak masukan dan saran untuk penulisan tesis yang lebih baik.
Rasa terimakasih yang besar penulis sampaikan pada semua responden yang dengan ikhlas menjadi responden dan rela mengikuti intervensi sampai penelitian selesai.
Penulis juga ingin menyampaikan rasa terimakasih kepada semua laboran di laboratorium Ilmu dan Teknologi Pangan dan laboratorium PAU, laboratorium Kultur Jaringan Bagian Patologi FKH, Laboratorium Terpadu FKH IPB, Laboratorium Helmintologi atas kerjasama dan bantuan selama penelitian berlangsung. Kepada semua dosen Program Studi Ilmu Pangan yang telah membimbing dan memberikan ilmunya kepada penulis, pada staf dan karyawan di IPN penulis mengucapkan banyak terimakasih.
Kepada ayahanda (almarhum) yang tidak sempat menyaksikan selesainya pendidikan pascasarjana penulis dan ibunda tercinta, penulis mengucapkan banyak terimakasih atas doa dan dukungan yang luar biasa selama penulis menyelesaikan studi. Kepada kakak dan adik tercinta yang telah memberikan dukungan dan semangat, kepada keponakanku yang telah memberikan keceriaan selama ini penulis mengucapkan banyak terimakasih. Terimakasih juga penulis sampaikan pada calon suami yang telah memberikan banyak motivasi diakhir masa studi penulis.
penulis juga ingin mengucapkan terimakasih. Pada teman kost di UGM dan I3, juga bibik dan teteh serta kost K5, terimakasih atas kebersamaan , suka duka dan dukungan selama di Bogor.
Penulis juga ingin mengucapkan terimakasih kepada pengelola Beasiswa BPPS atas dana beasiswa yang diberikan dan juga kepada Dekan Fakultas Pertanian dan Pihak Universitas Malikussaleh atas kesempatan dan bantuan selama kuliah pascasarjana.
Akhirnya penulis ingin mengucapkan terimakasih dan penghargaan kepada semua pihak yang telah membantu penulis baik selama kuliah maupun penelitian. Semoga Allah SWT memberikan pahala yang berlipat ganda atas semua bantuannya. Tak lupa penulis memohon maaf bila ada kesalahan baik yang disengaja maupun tidak dan juga saran untuk perbaikan tulisan ini. Dan semoga tulisan ini dapat memberikan manfaat bagi ilmu pengetahuan dan pihakE pihak lain yang terkait.
Bogor, Januari 2007
Penulis
$ %
Penulis dilahirkan pada tanggal 3 Mei 1977 sebagai anak ketiga dari empat bersaudara pasangan Ayahanda Yahya (Almarhum) dan Ibunda Hendon. Pendidikan dasar sampai menengah atas diselesaikan di Kabupaten Aceh Bireuen Nanggroe Aceh Darussalam. Pada Tahun 2000 penulis memperoleh gelar sarjana sains dari Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Syiah Kuala, Banda Aceh.
& '
Latar Belakang ... 1
Hipotesa ... 3
Tujuan Penelitian... 3
Manfaat Penelitian... 3
... 4
Taksonomi Kakao ... 4
Komposisi Kimia Kakao... 5
Pengolahan dan Produk Olahan Kakao ... 7
Manfaat Kakao Untuk Kesehatan... 9
Stres Oksidatif, Radikal Bebas dan Kerusakan Sel ... 10
Antioksidan ... 12
Glutation dan Respon Imun ... 13
Limfosit dalam Sistem Imun... 14
Bahan Pangan yang Berpotensi Sebagai Imunomodulator... 16
... 18
Tempat dan Waktu Penelitian ... 18
Bahan dan Alat ... 18
Diagram Alir Penelitian ... 19
Metode Penelitian... 21
Analisa Statistik ... 28
... 29
1. Keadaan Umum Responden ... 29
2. Sifat Antioksidativ Sel Limfosit ... 32
3. Proliferasi Sel Limfosit T dan Sel Limfosit B ... 50
... 57
Simpulan ... 57
Saran ... 57
... 59
('( & '
1. Komposisi kimia bubuk kakao per 100 gram ... 5
2. Kandungan total polifenol produk kakao ... 8
3. Radikal bebas dan ROS yang terdapat dalam tubuh organisme 11 4. Data antropometri responden sebelum dan sesudah intervensi ... 30
5. Makanan siang dan makanan jajanan serta frekuensi konsumsi... 31
('( & ' 1. Struktur kimia senyawa flavonoid ... 5
2. Struktur kimia polifenol yang umum terdapat dalam produk kakao ... 6
3. Diagram alir penelitian ... 20
4. Pengambilan darah dari responden oleh asisten transfusi darah... 23
5. Isolasi limfosit berdasarkan perbedaan densitas larutanficoll histopaque. 25 6. Kadar MDA kelompok kakao sebelum dan sesudah intervensi. ... 33
7. Kadar MDA kelompok kontrol sebelum dan sesudah intervensi. ... 34
8. Kadar glutation sel limfosit kelompok kakao sebelum dan sesudah intervensi. ... 37
9. Kadar glutation sel limfosit kelompok kontrol sebelum dan sesudah intervensi. ... 38
10. Aktivitas antiradikal bebas sel limfosit kelompok kakao sebelum dan sesudah intervensi. ... 41
11. Aktivitas antiradikal bebas sel limfosit kelompok kontrol sebelum dan sesudah intervensi. ... 41
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Efek Konsumsi Minuman Bubuk Kakao Bebas Lemak Terhadap Sifat Antioksidativ dan Proliferativ Limfosit Manusia adalah karya saya sendiri dengan bimbingan komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam tesis dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, Januari 2007
Erniati
NRP F251040271
! !" Efek Konsumsi Minuman Bubuk Kakao Bebas lemak Terhadap Sifat Antioksidativ dan Proliferativ Limfosit Manusia. Dibimbing oleh FRANSISKA R. ZAKARIA dan BAMBANG PONTJO PRIOSOERYANTO.
Banyak penelitian secara in vitro dan in vivo telah membuktikan efek kakao untuk kesehatan. Kakao kaya akan sumber antioksidan senyawa flavonoid seperti katekin, epikatekin dan prosianidin. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek konsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak hasil samping produksi lemak kakao terhadap sifat antioksidativ dan aktivitas proliferasi limfosit manusia.
Responden wanita yang sehat dibagi dalam dua kelompok yaitu kelompok kakao (n = 9) yang mengkonsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak yang dicampur dengan susu skim dan gula. Sedangkan kelompok kontrol (n = 9) mengkonsumsi minuman yang sama tetapi tanpa kakao. Semua responden menandatangani surat perjanjian (“inform consent”) dan menjalani pemeriksaan kesehatan oleh dokter yang berwenang sebelum dan sesudah intervensi. Pengambilan darah dilakukan untuk analisa sifat antioksidativ dan aktivitas proliferasi sel T dan sel B. Sifat antioksidativ yang diteliti terdiri dari nilai malonaldehida (MDA), aktivitas antiradikal bebas dengan metode DPPH, kadar glutation dan ketahanan sel limfosit terhadap oksidasi.
nyata (p < 0,05) terhadap formalin dan erithrosin setelah intervensi. Sedangkan ketahanan terhadap oksidasi oleh hidrogen peroksida juga meningkat walaupun secara statitistik tidak berbeda nyata (p > 0,05). Sementara itu aktivitas proliferasi sel T dan sel B kelompok kakao juga cenderung meningkat setelah konsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak walaupun secara statistik tidak berbeda nyata dengan kelompok kontrol (p > 0,096 untuk sel T dan p > 0,056 untuk sel B).
Secara keseluruhan dari hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa bubuk kakao bebas lemak hasil samping produksi lemak kakao dari perkebunan Indonesia mempunyai sifat antioksidativ yang tinggi, dapat melindungi sel limfosit terhadap oksidasi dan bersifat sebagai imunomodulator sehingga baik dikonsumsi sebagai pangan yang memberi manfaat untuk kesehatan.
! !" The Effect of Fat Free Cocoa Powder Driks Consumption on Antioxidative Activity and Lymphocyte Proliferative of Humans Subject. Di
bimbing oleh FRANSISKA R. ZAKARIA, and BAMBANG PONTJO
PRIOSOERYANTO.
Many researches have shown the potential effects of cocoa for health both in vivoandin vitro. Cocoa can be a rich source of flavonoid antioxidants such as catechin, epicatechin and procyanidin. The aim of this research was to evaluate the effect of Indonesian fat free cocoa powder drink consumption on antioxidative properties and proliferation activities of human lymphocyte.
#
Hak cipta milik Institut Pertanian Bogor, tahun 2007
Hak cipta dilindungi
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada
Judul Penelitian : Efek Konsumsi Minuman Bubuk Kakao Bebas Lemak Terhadap Sifat Antioksidativ dan Proliferativ Limfosit Manusia
Nama Mahasiswa : Erniati
NRP : F251040271
Disetujui
Komisi Pembimbing
Prof.Dr.Ir. Fransiska R.Zakaria, M.Sc Dr.Drh.Bambang Pontjo Priosoeryanto,MS
Ketua Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Ilmu Pangan Dekan Sekolah Pascasarjana IPB
Prof.Dr.Ir.Betty Sri Laksmi Jenie, MS Prof.Dr.Ir. Khairil Anwar Notodiputro, MS
Segala puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT yang telah memberikan rahmat dan karuniaNya sehingga tesis ini dapat penulis selesaikan. Thesis ini dibuat sebagai salah satu syarat mahasiswa program pascasarjana program S2 untuk meraih gelar Master pada Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Thesis yang ditulis ini merupakan laporan hasil penelitian yang dibiayai oleh dana Riset Unggulan Terpadu XII (RUT) tahap II tahun 2006 yang diketuai oleh Dr. Ir. Misnawi (Pusat Penelitian Kopi dan Kakao Indonesia di Jember) dan anggotanya Prof. Dr. Ir. Fransiska R. Zakaria, M.Sc. Oleh karena itu penulis mengucapkan terimakasih atas dana yang diberikan. Dalam penelitian ini penulis mencoba meneliti dengan topik Efek Konsumsi Minuman Bubuk Kakao Bebas Lemak Terhadap Sifat Antioksidativ dan Proliferativ Limfosit Manusia.
Dalam melakukan penelitian dan penulisan tesis ini penulis banyak mendapatkan bantuan dan bimbingan dari berbagai pihak. Ucapan terimakasih yang sangat tulus ingin penulis haturkan kepada Prof. Dr. Ir. Fransiska R. Zakaria, M.Sc yang telah meluangkan waktu dalam memberikan motivasi, nasehat, bimbingan dan saran bagi penyusunan tesis dan penyelesaian studi penulis dan juga telah memberikan dana untuk penelitian ini. Kepada Bapak Dr. Drh. Bambang Pontjo Priosoeryanto, MS penulis mengucapkan banyak terimakasih atas bimbingan, saran, perhatian dan memberikan izin kepada penulis menggunakan fasilitas Laboratorium Kultur Jaringan Bagian Patologi FKH selama penelitian. Penulis juga menyampaikan terimakasih kepada Bapak Dr. Ir. Feri Kusnandar, MSc yang telah bersedia menjadi dosen penguji pada ujian tesis dan memberikan banyak masukan dan saran untuk penulisan tesis yang lebih baik.
Rasa terimakasih yang besar penulis sampaikan pada semua responden yang dengan ikhlas menjadi responden dan rela mengikuti intervensi sampai penelitian selesai.
Penulis juga ingin menyampaikan rasa terimakasih kepada semua laboran di laboratorium Ilmu dan Teknologi Pangan dan laboratorium PAU, laboratorium Kultur Jaringan Bagian Patologi FKH, Laboratorium Terpadu FKH IPB, Laboratorium Helmintologi atas kerjasama dan bantuan selama penelitian berlangsung. Kepada semua dosen Program Studi Ilmu Pangan yang telah membimbing dan memberikan ilmunya kepada penulis, pada staf dan karyawan di IPN penulis mengucapkan banyak terimakasih.
Kepada ayahanda (almarhum) yang tidak sempat menyaksikan selesainya pendidikan pascasarjana penulis dan ibunda tercinta, penulis mengucapkan banyak terimakasih atas doa dan dukungan yang luar biasa selama penulis menyelesaikan studi. Kepada kakak dan adik tercinta yang telah memberikan dukungan dan semangat, kepada keponakanku yang telah memberikan keceriaan selama ini penulis mengucapkan banyak terimakasih. Terimakasih juga penulis sampaikan pada calon suami yang telah memberikan banyak motivasi diakhir masa studi penulis.
penulis juga ingin mengucapkan terimakasih. Pada teman kost di UGM dan I3, juga bibik dan teteh serta kost K5, terimakasih atas kebersamaan , suka duka dan dukungan selama di Bogor.
Penulis juga ingin mengucapkan terimakasih kepada pengelola Beasiswa BPPS atas dana beasiswa yang diberikan dan juga kepada Dekan Fakultas Pertanian dan Pihak Universitas Malikussaleh atas kesempatan dan bantuan selama kuliah pascasarjana.
Akhirnya penulis ingin mengucapkan terimakasih dan penghargaan kepada semua pihak yang telah membantu penulis baik selama kuliah maupun penelitian. Semoga Allah SWT memberikan pahala yang berlipat ganda atas semua bantuannya. Tak lupa penulis memohon maaf bila ada kesalahan baik yang disengaja maupun tidak dan juga saran untuk perbaikan tulisan ini. Dan semoga tulisan ini dapat memberikan manfaat bagi ilmu pengetahuan dan pihakE pihak lain yang terkait.
Bogor, Januari 2007
Penulis
$ %
Penulis dilahirkan pada tanggal 3 Mei 1977 sebagai anak ketiga dari empat bersaudara pasangan Ayahanda Yahya (Almarhum) dan Ibunda Hendon. Pendidikan dasar sampai menengah atas diselesaikan di Kabupaten Aceh Bireuen Nanggroe Aceh Darussalam. Pada Tahun 2000 penulis memperoleh gelar sarjana sains dari Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Syiah Kuala, Banda Aceh.
& '
Latar Belakang ... 1
Hipotesa ... 3
Tujuan Penelitian... 3
Manfaat Penelitian... 3
... 4
Taksonomi Kakao ... 4
Komposisi Kimia Kakao... 5
Pengolahan dan Produk Olahan Kakao ... 7
Manfaat Kakao Untuk Kesehatan... 9
Stres Oksidatif, Radikal Bebas dan Kerusakan Sel ... 10
Antioksidan ... 12
Glutation dan Respon Imun ... 13
Limfosit dalam Sistem Imun... 14
Bahan Pangan yang Berpotensi Sebagai Imunomodulator... 16
... 18
Tempat dan Waktu Penelitian ... 18
Bahan dan Alat ... 18
Diagram Alir Penelitian ... 19
Metode Penelitian... 21
Analisa Statistik ... 28
... 29
1. Keadaan Umum Responden ... 29
2. Sifat Antioksidativ Sel Limfosit ... 32
3. Proliferasi Sel Limfosit T dan Sel Limfosit B ... 50
... 57
Simpulan ... 57
Saran ... 57
... 59
('( & '
1. Komposisi kimia bubuk kakao per 100 gram ... 5
2. Kandungan total polifenol produk kakao ... 8
3. Radikal bebas dan ROS yang terdapat dalam tubuh organisme 11 4. Data antropometri responden sebelum dan sesudah intervensi ... 30
5. Makanan siang dan makanan jajanan serta frekuensi konsumsi... 31
('( & ' 1. Struktur kimia senyawa flavonoid ... 5
2. Struktur kimia polifenol yang umum terdapat dalam produk kakao ... 6
3. Diagram alir penelitian ... 20
4. Pengambilan darah dari responden oleh asisten transfusi darah... 23
5. Isolasi limfosit berdasarkan perbedaan densitas larutanficoll histopaque. 25 6. Kadar MDA kelompok kakao sebelum dan sesudah intervensi. ... 33
7. Kadar MDA kelompok kontrol sebelum dan sesudah intervensi. ... 34
8. Kadar glutation sel limfosit kelompok kakao sebelum dan sesudah intervensi. ... 37
9. Kadar glutation sel limfosit kelompok kontrol sebelum dan sesudah intervensi. ... 38
10. Aktivitas antiradikal bebas sel limfosit kelompok kakao sebelum dan sesudah intervensi. ... 41
11. Aktivitas antiradikal bebas sel limfosit kelompok kontrol sebelum dan sesudah intervensi. ... 41
13. Nilai IS (%) sel limfosit kelompok kontrol terhadap (H2O2)
yang menujukkan ketahanan sel terhadap oksidasi... 44
14. Nilai IS (%) sel limfosit kelompok kakao terhadap formalin yang menujukkan ketahanan sel terhadap oksidasi... 47
15. Nilai IS (%) sel limfosit kelompok kontrol terhadap formalin yang menujukkan ketahanan sel terhadap oksidasi... 47
16. Nilai IS (%) sel limfosit kelompok kakao terhadap erithrosin yang menujukkan ketahanan sel terhadap oksidasi... 48
17. Nilai IS (%) sel limfosit kelompok kontrol terhadap erithrosin yang menujukkan ketahanan sel terhadap oksidasi... 48
18. Nilai IS (%) sel T kelompok kakao sebelum dan sesudah intervensi .. ... 51
19. Nilai IS (%) sel T kelompok kontrol sebelum dan sesudah intervensi .. .... 52
20. Nilai IS (%) sel B kelompok kakao sebelum dan sesudah intervensi .. ... 54
21. Nilai IS (%) sel B kelompok kontrol sebelum dan sesudah intervensi .. .... 54
22. Teori kemungkinan proses biokimia aktivasi sel B oleh senyawa flavonoid dalam bubuk kakao ... 56
('( & ' 1. Kuisioner kesehatan fisik, pola makan dan kebiasaaan konsumsi makanan jajanan... 66
2. Menu makan pagi dan makan malam responden yang disiapkan oleh peneliti selama intervensi berlangsung... 73
3. Informed concent(pernyataan kesediaan) menjadi responden penelitian ... 74
4. Hasil analisa data dengan uji (tEtest) ... 75
5. Rekapitulasi nilai rataErata hasil penelitian... 80
6. Kurva standar penentuan konsentrasi MDA sel limfosit ... 81
ALTJ = Asam lemak tak jenuh BHA = Butylated hydroxyanisole BHT = Butylated hydroxytoluene
BMI = Body Mass Index
CD4 =Cluster of Differentiation 4
Con A = Concanavalin A DAG = Diasilgliserol
DNA = Deoxyribonucleic acid DPPH = 2,2EDiphenilE1Epictihidrazil DTNB = 5,5’EDitio bis 2 nitrobenzoat GSH = Glutation tereduksi
HDL = High density lipoprotein ILE4 = InterleukinE4
IPCS = International Programme on Chemical Safety IP3 = Inositol trifosfat
LDL = Low density lipoprotein LGL = Large granular lymphocytes
LPS = Lipopolisakarida
MDA = Malonaldehyde
MHC = Mayor histocompatibility ocmplex
MTT = 3E(4,5EDimethylthiazoleE2Eyl)E2,5Ediphenyl tetrazolium bromida Nilai IS = Nilai Indeks Stimulasi
PHA = Fitohemoglutinin
PIP2 = Fosfatidil inositol bifosfat
PWM = Pokweed
RNA = Ribonucleic acid
ROS = Reactive oxygen spesies Sel NK= Sel natural killer
& ) *
Saat ini pangan telah mulai diandalkan sebagai pemelihara kesehatan dan menjaga kebugaran tubuh. Bahkan bila memungkinkan, pangan harus dapat menyembuhkan atau menghilangkan efek negatif dari penyakit tertentu. Dari sinilah lahir konsep pangan fungsional (functional foods), yang akhirEakhir ini sangat populer di kalangan masyarakat dunia.
Salah satu pangan yang mulai diteliti mempunyai efek dapat
meningkatkan kesehatan adalah produk kakao (coklat). Kakao merupakan salah satu komoditas perkebunan yang besar di Indonesia. Indonesia adalah produsen kakao terbesar ketiga di dunia setelah Ivory Coast dan Ghana dengan produksi tahunan mencapai 435 ribu ton. Luas areal penanaman kakao telah mencapai lebih dari 770 ribu hektar yang tersebar di seluruh propinsi, kecuali DKI Jakarta.
Sampai saat ini, perdagangan komoditas kakao Indonesia masih sangat bergantung pada pasar ekspor dalam bentuk biji yaitu sekitar 83%. Di sisi lain, kakao Indonesia khususnya yang dihasilkan oleh rakyat, di pasaran internasional dihargai paling rendah, karena didominasi oleh bijiEbiji tanpa fermentasi. BijiEbiji tersebut pada proses pengolahan hanya dijadikan sebagai sumber lemak, sedangkan bubuknya hanya digunakan sebagai bahan pencampur dengan porsi yang sangat kecil. Pembuatan bubuk kakao bebas lemak sebagai sumber flavonoid dari biji kakao non fermentasi merupakan usaha yang sedang dirintis di Pusat Penelitian Kopi dan Kakao Indonesia di Jember. Bubuk kakao bebas lemak tersebut merupakan hasil samping produksi lemak kakao.
Biji kakao dinyatakan sebagai bahan yang kaya dengan flavonoid diantaranya adalah senyawa polifenol yang erat kaitannya sebagai zat yang mempunyai kapasitas antioksidan bagi tubuh. Polifenol dalam kakao diantaranya adalah katekin, epikatekin, prosianidin dan antosianidin. Dalam sebuah penelitian disebutkan bahwa kakao mengandung total fenol dan kapasitas antioksidan yang lebih tinggi dibandingkan anggur maupun teh. Antioksidan yang terdapat dalam coklat atau produk makanan dari coklat ini dapat menetralisir reaktivitas dari
bereaksi dengan asam lemak tidak jenuh yang merupakan penyusun membran serta RNA dan DNA sel yang dapat menyebabkan sel rusak atau mati. Kerusakan yang dialami oleh sel dapat berakibat menurunkan sistem kekebalan tubuh.
Sejumlah penelitian secarain vitromaupunin vivotelah mempelajari efek biologis kakao terutama produk olahan kakao dari biji kakao yang difermentasi terhadap kesehatan. Dalam suatu penelitian disebutkan bahwa konsumsi produk coklat yang kaya akan flavonoid memberikan peningkatan kapasitas antioksidan dalam darah setelah dua jam mengkonsumsi coklat. Dalam penelitian lain disebutkan konsumsi kakao yang kaya akan flavanol dapat mempengaruhi kesehatan vaskuler dengan meningkatkan fungsi pembuluh darah. Produk yang disuplementasi dengan flavanol kakao yang difermentasi juga telah diteliti mempuyai efek dapat menurunkan low density lipoprotein (LDL)oxidative pada manusia. Kecenderungan eritrosit sel darah manusia untuk hemolisis akibat radikal bebas telah diteliti dapat dikurangi secara signifikan setelah mengkonsumsi minuman yang mengandung flavanol kakao. Namun sampai saat ini masih sangat sedikit dilakukan penelitian tentang manfaat bubuk dari biji kakao non fermentasi terutama bubuk yang bebas lemak terhadap kesehatan.
!+( ,
Hipotesa penelitian ini adalah bahwa mengkonsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak yang merupakan hasil samping produksi lemak kakao dari perkebunan Indonesia dapat meningkatkan aktivitas antioksidan, proliferasi limfosit dan ketahanan terhadap oksidasi pada sel limfosit manusia.
- &! !
1. Untuk mengetahui efek konsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak terhadap kadar MDA sel limfosit.
2. Untuk mengetahui kadar glutation sel limfosit setelah mengkonsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak.
3. Untuk menguji kemampuan bubuk kakao bebas lemak dalam meningkatkan aktivitas antiradikal bebas sel limfosit manusia.
4. Untuk menguji ketahanan sel limfosit terhadap oksidator setelah
mengkonsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak.
5. Untuk mengetahui kemampuan bubuk kakao bebas lemak dalam
meningkatkan aktivitas proliferasi sel T dan sel B.
. &! !
1. Membuktikan secara ilmiah mengenai khasiat bubuk kakao bebas lemak terhadap kesehatan , sehingga dapat memberikan informasi kepada masyarakat tentang khasiat bubuk kakao bebas lemak sebagai sumber antioksidan alami yang dapat meningkatkan sistem kekebalan tubuh manusia.
2. Memberikan informasi pada masyarakat bahwa coklat tidak lagi merupakan makanan yang harus dihindari, tetapi mengkonsumsi minuman coklat terutama minuman bubuk coklat bebas lemak merupakan kebiasaan yang baik untuk memperbaiki kesehatan.
),( ('! ) (
Kakao merupakan salah satu komoditas tanaman perkebunan yang telah lama dikembangkan didunia dan juga di Indonesia. Tanaman kakao dapat tumbuh dengan baik didaerah hutan tropis dibawah naungan pohonEpohon tinggi pada curah hujan dan kelembaban yang tinggi (Pusat Penelitian Kopi dan Kakao, 2004). Menurut Tjitrosupomo (1988) sistematika tanaman kakao adalah sebagai berikut:
Divisi : Spermatophyta
Sub Divisi : Angiospermae
Kelas : Dicotyledoneae
Sub kelas : Dialypetalae
Bangsa : Malvales
Suku : Sterculiaceae
Marga : Theobroma
Jenis :Theobroma cacaoL
Terdapat bermacamEmacam jenis kakao. Yang paling banyak
dikembangkan di Indonesia adalah dari jenis kakao mulia atau kakao edel (fine /
flavour cocoa ) berasal dari varietas criollo dengan buah berwarna merah dan
kakao lindak (bulk cocoa) berasal dari varietas forestero dan trinitario dengan warna buah hijau. Kakao lindak merupakan kakao kualitas kedua dan mendominasi perkebunan kakao Indonesia (Pusat Penelitian Kopi dan Kakao, 2004).
('+(,!,! !'! ) (
komposisi kimia kakao menjadi berbeda (Cheney 1999). Berikut ini disajikan komposisi kimia dari bubuk kakao.
Tabel 1 Komposisi kimia bubuk kakao per 100 gram
Nutrient Komposisi
Sumber : Cheney (1999).
Komponen senyawa bioaktif utama dalam biji kakao adalah senyawa polifenol. Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan ternyata pada biji kakao mengandung senyawa polifenol yang dapat berfungsi sebagai antioksidan (Sanbongi et al. 1998). Lee et al. (2003) mengemukakan bahwa kandungan polifenol total dalam kakao, dalam hal ini bubuk kakao lebih tinggi dibandingkan dalam anggur maupun teh, baik teh hitam maupun teh hijau.
Kelompok senyawa polifenol yang banyak terdapat pada kakao adalah flavonoid yaitu senyawa yang mengandung 15 atom karbon yang terdiri dari dua cincin benzena yang dihubungkan oleh rantai karbon dengan struktur dasar sebagai berikut :
O
A C
B
Struktur kimia flavonoid yang bisa disubstitusi oleh gugus hidroksil (OH) pada posisi 3'E, 4'E dan 5' cincin B dan juga substitusi gugus OH pada ikatan rangkap C2 dan C3 pada cincin C menjadikan senyawa ini mempunyai aktivitas antioksidan yaitu sebagai antioksidan primer maupun sebagai pengkhelat ion logam (Rajalakshmi & Narasimhan 1996)
Wollgast dan Anklam (2000) mengemukakan bahwa flavonoid yang umum terdapat pada biji kakao dan produk olahan kakao dan mempunyai efek terhadap kesehatan adalah flavanol yang terdiri dari catechin dan epicatechin dan juga berbentuk senyawa oligomer yang dikenal sebagai procyanidins. Struktur kimia senyawa flavonoid yang umum terdapat dalam kakao dan produk olahan kakao adalah sebagai berikut :
Gambar 2 Struktur kimia senyawa polifenol yang umum terdapat dalam produk kakao
Kandungan senyawa polifenol dalam biji kakao atau produk olahannya sangat tergantung pada proses fermentasi biji kakao sebelum tahap pengeringan. Misnawi dan Selamat (2003) mengemukakan bahwa kandungan dan komposisi polifenol dalam biji kakao berubah secara nyata selama proses fermentasi.
Sementara itu, hasil penelitian yang lain mendapatkan bahwa keberadaan polifenol pada konsentrasi yang tinggi dalam kakao memberi pengaruh negatif terhadap citarasa berupa rasa sepat dan pahit yang berlebihan serta menghambat pembentukan komponenEkomponen aroma selama penyangraian (Misnawi et al. 2004a,b).
R1=H, R2=OH = (+)Ecatekin
*(& / 0 (0 ) & / ) (
Produk coklat dihasilkan melalui tahapan dan proses pengolahan biji kakao. Secara umum biji kakao diolah menjadi bahan pangan yang dapat di konsumsi melalui tahapEtahap :
1. Fermentasi, dilakukan setelah buah dipanen . Lama fermentasi biasanya 4E6 hari, bijinya kemudian dikeringkan.
2. Proses pengolahan biji kakao yang sudah kering menjadi bahan pangan yang bisa dikonsumsi. Tahapan umumnya meliputi : penghalusan (refining), penyempurnaan citarasa (conching) dan pengkristalisasi (tempering) (Bixler & Morgan 1999).
Kualitas dari produk olahan kakao yang dihasilkan sangat tergantung kepada kualitas biji kakao dan proses pengolahan. Salah satu faktor yang sangat menentukan adalah proses fermentasi biji kakao sebelum diolah. Cita rasa coklat yang yang baik dapat diperoleh bila kakao tersebut difermentasi dengan baik. Berdasarkan Direktorat Jenderal Bina Produksi Perkebunan (2004) kakao Indonesia khususnya yang dihasilkan oleh rakyat, di pasaran internasional dihargai paling rendah, karena didominasi oleh bijiEbiji tanpa fermentasi.
Namun demikian proses fermentasi itu sendiri menyebabkan kandungan senyawa kimia dalam biji kakao menjadi berubah, terutama senyawa flavonoid yang dapat memberikan efek positif untuk kesehatan. Berdasarkan penelitian Misnawi dan Selamat (2003) kandungan polifenol dalam biji kakao menurun sampai 50% selama proses fermentasi.
benzen (titik didih 40E60oC). Bubuk kakao yang diperoleh kemudian dihaluskan sampai kehalusan < 40 mesh dan kemudian disimpan dalam kemasan yang kedap
udara ( Misnawi 2005). Berdasarkan penelitian Misnawi et al. (2003)
dikemukakan bahwa dalam bubuk kakao bebas lemak dari biji kakao non fermentasi terdapat 120E180 g/kg polifenol. Bubuk kakao bebas lemak dari varietas bulk masak berdasarkan penelitian Zairisman (2006) mengandung total fenol sebesar 35,5 ppm tiap 0,8 mg/ml ekstrak kakao dalam pelarut air.
Kandungan polifenol kakao juga sangat tergantung pada proses
pengolahan dan produk akhir. Hasil penelitian Misnawi et al. (2002b) juga mendapatkan bahwa aktifitas antioksidan polifenol biji kakao masih tetap tinggi walaupun telah dipanaskan sampai suhu 140°C selama 45 menit. Menurut Wollgast dan Anklam (2000), kandungan polifenol total dalam produk kakao berbedaEbeda. Berikut disajikan kandungan polifenol total dalam cocoa powder, dark chocolate danmilk chocolatedengan metode analisis FolinECiocalteau yaitu menggunakan standar asam gallat dan ekstraksi dengan pelarut metanol.
Tabel 2 Kandungan total polifenol produk kakao
Produk kakao Jumlah (mg / g) polifenol total
Cocoa powder 20
Dark chocolate 8,4
Milk chocolate 5
Sumber : Wollgast dan Anklam (2000)
Terdapat berbagai macam produk olahan dari biji kakao yaitu chocolate liquor(pasta kakao),cocoa powder(bubuk coklat),cocoa butter(mentega kakao)
dandark chocolate.Dark chocolatemengandung 15%chocolate liquor,dan 60 %
cocoa butter, gula dan aditif. Sedangkan cocoa powder (bubuk coklat) dibuat dengan menghilangkancocoa butterdarichocolate liquor(Vinsonet al.1999).
Produk olahan dari kakao ini digunakan untuk berbagai jenis olahan makanan, industri farmasi dan industri kosmetik. Bubuk kakao banyak digunakan sebagai bahan pembuat roti, es krim, permen dan juga untuk minuman. Cocoa
butter banyak digunakan untuk industri makanan, kosmetik dan farmasi (Pusat
. ) ( ) , /
Banyak penelitian telah dilakukan tentang efek kakao untuk memperbaiki kesehatan. Wollgast dan Anklam (2000) mengemukakan bahwa polifenol biji kakao memiliki aktifitas antioksidan yang sangat baik dan bermanfaat bagi tubuh, sehingga polifenol kakao terus mendapat perhatian para pakar gizi dan pengobatan sehubungan dengan kandungan senyawa polifenol yang bersifat sebagai antioksidan. Othmanet al.(2006) menyatakan bahwa kandungan senyawa fenolik dalam biji kakao dari Malaysia, Ghana, Ivory Coast dan Sulawesi (Indonesia) memiliki kapasitas antioksidan yang tinggi.
Penelitian secara in vitrodan in vivo menunjukkan bahwa polifenol biji kakao memiliki kapasitas antioksidan yang mampu menekan hidrogen peroksida dan anion superoksida, melindungi lemak dari kerusakan oksidasi, bertindak sebagai antimikrobia, antimutagenik, menghambat pertumbuhan tumor dan
kanker, dan mengurangi penyakitEpenyakit karena oksidasi low density
lipoprotein (LDL) (Kattenberg 2000; Sanbongi et al. 1998; Wan et al. 2001).
Dalam penelitian lain setelah 4 minggu mengkonsumsi bubuk kakao kaya flavanol, responden mengalami penurunan LDL, peningkatan HDL (high density
lipoprotein) dan peningkatan kapasitas antioksidan total dalam plasma darah.
Hasil penelitian ini berkorelasi positif bagi kesehatan jantung dan merupakan strategi diet penting dalam mendukung kesehatan jantung (Wanet al.2001).
Aminet al.(2004) mengemukakan bahwa konsumsi cairan ekstrak kakao
yang kaya akan antioksidan dapat menurunkan aktivitas enzim petanda tumor dari tikus selama hepatokarsinogenesis yaitu pembentukan tumor di organ hati. Mathur
et al.(2002) menyatakan bahwa polifenol dalam produk kakao mempunyai
kapasitas antioksidan dan aktivitas antiEinflamantori yang mempunyai
kemampuan untuk mencegah penyakit kardiovaskuler oleh stress oksidativ. Fisher
et al.(2003) menyebutkan bahwa mengkonsumsi kakao yang kaya akan flavanol
menyimpulkan bahwa flavanol kakao sangat berperan sebagai modulator respon platelet, dan merupakan faktor diet yang penting sebagai pencegah terjadinya pembekuan darah.
Zhu et al. (2005) menyatakan bahwa kecenderungan erithrosit sel darah
manusia untuk hemolisis akibat radikal bebas dapat dikurangi secara signifikan setelah mengkonsumsi minuman yang mengandung flavanol kakao.
Sanbongi et al. (1998) telah mempelajari efek antioksidan dari coklat terhadap sistem imun manusia. Secara in vitro antioksidan dari coklat dapat menghambat produksi hidrogen peroksida dan anion superoksida limfosit dan makrofag. Untuk meningkatkan sistem imun tubuh cairan fraksi kakao dapat memodulasi sintesis sitokin antiinflamasi interleukinE4 (ILE4). Fraksi monomer
prosianidin dapat meningkatkan sekresi sel yang dirangsang PHA
(fitohemoglutinin) (Maoet al.2000).
Olivia (2006) menyatakan bahwa ekstrak bubuk kakao bebas lemak dari dari biji kakao non fermentasi dalam pelarut air mampu memberikan efek perlindungan terhadap sel limfosit manusia secara in vitro. Pada penelitian ini dikemukakan bahwa cairan ekstrak bubuk kakao tersebut mampu melindungi sel limfosit terhadap hidrogen peroksida yang dapat merusak sel dan anion superoksida yang dapat menginduksi bermacam kematian sel termasuk nekrosis maupun apoptosis. Cairan ekstrak bubuk kakao ini juga dapat melindungi sel limfosit dari kerusakan oleh formalin dan logam berat Hg.
,, ),!0 !. 1 0!) & 2 , , ) &
membran sel, protein, enzim serta kerusakan DNA (Deoxyribonucleic Acid) (Kehrer 1993; Langseth 2000; Halliwell et al. 1992).
Radikal bebas atau sering disebut juga senyawa oksigen reaktif (reactive
oxygen species) (ROS) adalah adalah spesi kimia yang memiliki elektron yang
tidak berpasangan di kulit terluar sehingga sangat reaktif. Reaksi antara radikal bebas dengan molekul kimia dalam sel dapat menyebabkan berbagai jenis reaksi kimia. Dan jika terjadi di dalam tubuh organisme akan menimbulkan berbagai macam kerusakan sel yang menimbulkan berbagai penyakit (Langseth 2000).
Beberapa radikal bebas dan ROS yang terdapat dalam tubuh organisme adalah sebagai berikut :
Tabel 3 Radikal bebas dan ROS yang terdapat dalam tubuh organisme
Jenis Senyawa Rumus Molekul
Radikal Bebas
• Radikal hidroksil
• Radikal superoksida
• Radikal oksida nitrit
• Radikal lipid peroksil
OH• Sumber : Langseth, (2000).
Radikal bebas dapat berasal dari sumber endogenus maupun sumber eksogenus. Sumber endogenus berasal dari reaksi reduksi dan oksidasi normal sel dalam mitokondria, peroksisom, detoksifikasi senyawa xenobiotik, metabolisme obatEobatan dan fagositasi. Sedangkan sumber eksogenus berasal dari lingkungan diluar tubuh yaitu asap rokok, radiasi, inflamasi, latihan oleh raga berlebihan, diet tinggi ALTJ (asam lemak tak jenuh) dan karsinogenik (Langseth 2000).
pembentukan senyawa radikal yang dapat merusak sel melalui oksidasi asam lemak (Zakaria 1996a).
Pengukuran radikal bebas secara langsung masih sulit untuk dilakukan. Pengukuran lipid peroksidasi sering digunakan sebagai teknik untuk mengevaluasi kondisi stress oksidatif karena radikal bebas. MDA merupakan produk akhir oksidasi lipid membran. Pengukuran MDA sel yang merupakan produk dari oksidasi lipid sering digunakan untuk mengukur radikal bebas. Status antioksidan yang tinggi biasanya diikuti oleh penurunan kadar MDA (Zakaria et al. 2003). Salah satu metode yang digunakan adalah reaksi dengan 2 thiobarbituric acid (TBA) (Kasogiet al. 1989).
!(),!0
Antioksidan dapat didefinisikan sebagai suatu senyawa yang dapat menghambat atau memperlambat terjadinya oksidasi (Hall & Cuppett SL 1997). Menurut Winarno (1997) terdapat dua macam antioksidan, yaitu antioksidan primer dan antioksidan sekunder. Suatu molekul dapat disebut sebagai antioksidan primer apabila dapat memberikan atom hidrogen secara cepat kepada radikal lipid dan jika radikal yang terbentuk kemudian lebih stabil daripada radikal lipidnya atau diubah menjadi produk lain yang lebih stabil. Zat – zat yang termasuk golongan ini dapat berasal dari alam seperti tokoferol, polifenol, lesitin, fosfatida,
dan asam askorbat serta antioksidan buatan seperti BHA (butylated
hydroxyanisole) dan BHT (butylated hydroxytoluene)" Sedangkan antioksidan sekunder adalah suatu zat yang dapat mencegah kerja prooksidan sehingga dapat digolongkan sebagai sinergi. Beberapa asam organik tertentu dapat mengikat logam – logam, misalnya satu molekul asam sitrat akan mengikat prooksidan Fe seperti sering dilakukan pada minyak kacang kedelai.
Menurut Fang et al. (2002), dalam tubuh manusia secara alami
karotenoid. Banyak metode yang digunakan untuk menentukan aktivitas antiradikal bebas oleh zat antioksidan. Melloet al.(2004) mengemukakan bahwa uji aktivitas antiradikal bebas dengan menggunakan senyawa DPPH (2,2EdiphenilE 1Epictihidrazil) merupakan uji secara kolorimetri (berdasarkan warna). Warna yang terbentuk berasal dari hasil reaksi antara radikal bebas DPPH dengan antioksidan. Reaksi yang terjadi adalah DPPH* + AH DPPHEH + A*. DPPH* dalam bentuk radikal memberikan absorpsi yang maksimum pada panjang gelombang 517 nm. Setelah direduksi oleh antioksidan, maka absorpsinya akan menghilang dan bentuk nonEradikal yang berwarna kuning pucat akan terbentuk.
& !( 0 ,+( '
Glutation (LEγEglutamilELEsistenilglisin) merupakan senyawa thiol non protein yang banyak terdapat dalam jaringan tubuh. Senyawa peptida ini banyak terdapat dalam cairan fisologis seperti plasma atau cairan empedu, dan juga pada selEsel lain di dalam tubuh. Glutation berfungsi sebagai penangkal senyawa radikal dalam sitoplasma dan dalam metabolisme zat xenobiotik elektrofil tahap II. Glutation dapat berfungsi sebagai antioksidan yang akan melindungi selEsel tubuh dari radikal bebas Sekitar 98 % glutation total berada dalam bentuk glutation tereduksi (GSH) (Bergmeyer 1990).
Glutation sangat erat hubungannya dengan fungsi imunitas tubuh. Proliferasi, pertumbuhan dan differensiasi selEsel imun sangat tergantung pada keberadaan GSH. Sel limfosit B dan sel Limfosit T memerlukan jumlah GSH yang cukup untuk berdiferensiasi. Jumlah GSH sel limfosit yang rendah akan signifikan dengan rendahnya jumlah CD4 (Cluster of Differentiation) yang merupakan petanda molekul subset Th. GSH intraseluler juga diperlukan oleh sel limfosit T untuk berpoliferasi sebagai respon terhadap stimulasi mitogen, untuk mengaktivasi sel T sitotoksit (Tc) dan beberapa fungsi spesifik sel T diantaranya
!'.(,! & ' !, ' '
Koolman dan Rohm (2001) mengemukakan bahwa unsurEunsur padat darah terdiri dari eritrosit (sel darah merah), leukosit (sel darah putih) dan trombosit (kepingEkeping darah). Limfosit termasuk kedalam salah satu jenis leukosit (sel darah putih) yang mempunyai peranan yang sangat penting dalam mekanisme sistem imunitas tubuh. Limfosit akan memberikan respon terhadap suatu substansi benda asing (antigen) yang masuk ke dalam tubuh melalui sistem imunitas seluler maupun imunitas humoral.
Limfosit terdiri dari limfosit T dan limfosit B serta subset limfosit yang terutama berperan dalam respon imun seluler. SelEsel imun tersebar diseluruh tubuh dan ditemukan di dalam limfa, timus, darah, saluran nafas, saluran pencernaan dan saluran kemih. Kemampuan mengenal benda asing oleh limfosit disebabkan oleh adanya reseptor pada permukaan sel. Reseptor sel T (TCR) dapat
mengenal peptida antigen yang terikat dengan molekul MHC (Mayor
Histocompatibility Complex). TCR terdiri dari heterodimer yang mengikat antigen/MHC dan kompleks polipeptida yang disebut kompleks CD3 (Cluster of Differentiation) yaitu petanda permukaan pada limfosit T yang diperlukan untuk aktivasi sel T selanjutnya. Fungsi yang umum dari sel T adalah membantu sel B dalam produksi antibodi, mengenal dan menghancurkan sel yang terinfeksi virus, mengaktifkan makrofag dalam fagositosis serta mengontrol ambang dan kualitas sistem imun (Baratawijaya 2002).
dengan antigen yang sama, maka akan mengalami proliferasi lebih cepat membentuk sel plasma untuk membentuk antibodi spesifik (Roitt & Delves 2001). Sebagian sel limfosit tidak mengandung petanda seperti yang ditemukan pada sel B atau sel T, oleh karena itu disebut sel nol. Sel tersebut berupa Large
Granular Lymphocytes (LGL). Sel ini sering disebut dengan sel NK (Natural
Killer) (Baratawijaya 2002). Sel yang terinfeksi virus dapat dibunuh oleh limfosit dengan aktivitas sel NK melalui perforin / granzim yang akan menyebabkan kematian sel yang terpogram (apoptosis). (Roitt & Delves 2001).
Proliferasi merupakan proses perbanyakan sel melalui pembelahan sel sebagai respon terhadap adanya antigen dan mitogen. Pada proses proliferasi ini dihasilkan selEsel efektor aktif yang berperan dalam sistem imun. Proliferasi merupakan fungsi dasar biologis limfosit (Rose et al. 1994). Respon proliferasi secara in vitro dapat menggambarkan fungsi limfosit dan status imun individu. Sehingga dapat dikatakan bahwa kemampuan limfosit untuk berproliferasi menunjukkan secara tidak langsung kemampuan respon imunologik atau tingkat kekebalan.Sel limfosit merupakan jenis sel yang sangat sensitif, sehingga pengujian komponen uji secarain vitrosekaligus merupakan eksplorasi pengujian langsung apakah komponen bahan uji yang diberikan bersifat sitotoksik atau tidak (Zakariaet al.1996).
Limfosit dapat dikembangbiakkan diluar tubuh hewan atau manusia, yang dinamakan dengan kultur sel. Untuk dapat mengkultur sel limfosit secarain vitro diperlukan lingkungan dan makanan yang menyerupai kondisi in vivo. Media pertumbuhan yang diperlukan harus mengandung asam amino, vitamin, mineral, garam organik dan serum. Keadaan lingkungan yang harus diperhatikan adalah pH optimum kultur 7,8, suhu inkubasi 37oC, kadar CO2 5% dan kelembaban
relatif sebesar 95%. Untuk mencegah terjadinya kontaminan oleh
kuda dan juga serum AB manusia. Prokop O dan Unlenbruck (1969) mengemukakan bahwa dalam serum darah manusia mengandung antibodi yang dapat mengaglutinasi (menggumpal) jika bereaksi dengan antigen tertentu. Darah golongan A mengandung antigen A dan antibodi terhadap B dalam serumnya, sehingga serum darah dari golongan A akan menggumpal bila direaksikan dengan sel darah yang mengandung antigen B. Sementara itu golongan darah AB memiliki antigen A dan B serta tidak menghasilkan antibodi terhadap antigen A maupun B. Sehingga serum dari golongan darah AB tidak akan menggumpal bila direaksikan dengan sel darah atau limfosit yang mengandung antigen A maupun B, atau limfosit yang diisolasi dari darah golongan A, golongan B maupun golongan AB itu sendiri. Karena sifat inilah maka serum darah dari golongan AB banyak digunakan untuk kultur sel yang menggunakan sel limfosit manusia.
Penambahan LPS dalam media kultur limfosit berfungsi sebagai mitogen yang dapat menstimulasi proliferasi sel limfosit ( Zakaria et al. 1996). Beberapa mitogen yang dapat digunakan sebagai stimulan proliferasi antara lain Concanavalin A (Con A), fitohemoglutinin (PHA), lipopolisakarida (LPS) bakteri dan pokweed (PWM). Con A dan PHA dapat mengaktifkan sel T, PWM dapat mengaktifkan sel B dan sel T. Sedangkan lipopolisakarida bakteri dapat mengaktifkan sel B (Bellanti 1993).
/ * % * +( ,! 2 * ! ' ('(0 & ( "
Bahan pangan lain yang juga telah diteliti dapat meningkatkan aktivitas proliferasi sel limfosit adalah ekstrak cincau hijau yang sering dikonsumsi sebagai
minuman (Pandoyo 2000), jamu (Yuana 1998), dan ekstrak buah merah
(Meiriana 2006). Senyawa kitooligomer yang diproduksi dari kitosan limbah kulit udang juga telah diteliti dapat meningkatkan aktivitas proliferasi limfosit sehingga dapat bersifat sebagai imunomodulator (Wahyuni 2006). Zairisman SZ (2006) melaporkan bahwa ekstrak bubuk kakao bebas lemak dalam pelarut air dapat meningkatkan aktivitas proliferasi sel limfosit manusia yang dikultur secara in vitro.
'+ 0 $ ) &! !
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Biokimia Pangan dan
Laboratorium Mikrobiologi Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan,
Laboratorium Kimia PAU Pangan dan Gizi IPB, Laboratorium Kultur Jaringan Bagian Patologi dan Laboratorium Terpadu Fakultas Kedokteran Hewan IPB, Laboratorium Klinik Caritas Bogor, Klinik Farfa Darmaga serta 3 rumah indekost mahasiswa di komplek perumahan IPB II Sindang Barang.
Waktu yang diperlukan dari pembuatan proposal sampai pembuatan laporan adalah selama 8 bulan yaitu dari bulan April sampai bulan November tahun 2006.
/ 0 & /
Bahan baku yang digunakan pada penelitian ini adalah bubuk biji kakao bebas lemak yang diperoleh dari Pusat Penelitian Kopi dan Kakao Indonesia di Jember. Bubuk yang digunakan merupakan bubuk biji kakao varietas bulk masak non fermentasi yang memiliki total fenol dan daya proliferasi limfosit yang tinggi berdasarkan ujiin vitro(Zairisman 2006). Bahan lain yang digunakan adalah gula pasir, air panas dan susu bubuk skim.
BahanEbahan kimia yang digunakan adalah larutan histopaque (1077)
A) (CO 412 dari Sigma), lipopolisakarida (LPS) (Sigma), antibiotik penisilinE streptomisin, MTT (3E(4,5EdimethylthiazoleE2Eyl)E2,5Ediphenyl tetrazolium bromida) dari Sigma, pewarna trifan biru, NaHCO3, asam klorida, larutan standar
malonaldialdehida (MDA) dari 1,1,3,3Etetraetoksipropana (Sigma), Phosphate Buffer Saline (PBS) , asam trikloro asetat, aquabides, alkohol 90%, asam tiobarbiturat, pelarut air bebas ion (Kimia Farma), larutan isopropanol, KH2PO4,
asam fosfat, 2,2EdifenilE1Epictihidrazil (DPPH), metanol pro analisis, standar glutation (GE6529) (Merck), 5,5’Editio bis 2 nitrobenzoat (DTNB) yang lebih dikenal dengan pereaksi Ellman, Na2HPO4, asam sulfosalisilat, EDTAENaE
2H2.2H2O, hidrogen peroksida (H2O2), formalin dan pewarna merah makanan
(eritrosin).
Sedangkan serum yang digunakan untuk media pertumbuhan adalah serum darah golongan AB yang diambil dari seorang donor yang sehat.
&
Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain sentrifuge (JOUAN, tipe CR 412), laminar air flow (Holten Laminar air tipe HV 2472), incubator Jouan tipe IG 150) (CO2 5%, 37oC), mikroskop, hemasitometer
(Superior), mikroplate reader (BIOERAD, Benchmark), spektrofotometer
(Shimadzu), mikropipet (Finnepipette), inverted microscope tipe 1x70 dari
Olimpus, water bath, freezer dan autoclave serta peralatan gelas yang sering
digunakan untuk analisa di laboratorium
Sedangkan peralatan sekali pakai yang digunakan adalah syringe 50 ml (Terumo), syringe 3 ml, tabung sentrifuge steril 15 dan 50 ml sekali pakai (Corning), lempeng mikro 96 sumur (Corning), membran filter 0,22 Vm (Corning), repeater (Eppendorf), dispenser tip (Marsh), tabung vacutainer ukuran 9 ml dengan koagulan, tabung vacutainer non koagulan, needles vacutainer (Becton dickinson) dan cover gelas.
! * ' &! &! !
Minuman bubuk kakao bebas lemak dari varietas bulk masak
Dikonsumsi oleh responden
Diambil darah
Isolasi sel limfosit
Uji Sifat Antioksidativ Uji Proliferasi
Analisa Antiradikal Bebas dengan Metode DPPH
Analisa Nilai MDA
Analisa Kadar Glutation Analisa
Ketahanan Terhadap
Oksidasi
Nilai Indeks Stimulasi (IS)
Nilai Indeks Stimulasi (IS)
Oksidator
H2O2
Oksidator erithrosin Oksidator
formalin
(0 &! !
3" '2 ! ' 2 ) ) (
Minuman bubuk kakao (coklat) yang siap dikonsumsi dibuat dengan melarutkan 4 gram bubuk kakao bebas lemak dalam 100 ml air hangat, ditambahkan 2 gram gula dan 2 gram susu bubuk skim. Minuman bubuk kakao diminum oleh responden dalam keadaan hangat.
" ,! + ,+( 0
Responden yang terlibat dalam penelitian ini adalah mahasiswa Institut Pertanian Bogor sebanyak 18 orang yang berusia 22 – 27 tahun dan bertempat tinggal di perumahan dosen komplek IPB II Sindang Barang. Semua responden yang dipilih berjenis kelamin perempuan. Responden dibagi dalam 2 kelompok,
masingEmasing kelompok berjumlah 9 orang. Kelompok pertama merupakan
kelompok kakao yang mengkonsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak. Sedangkan kelompok kedua mengkonsumsi minuman yang terdiri dari 2 gram susu bubuk skim yang ditambah 2 gram gula dalam 100 ml air hangat. Kelompok kedua ini dinamakan dengan kelompok kontrol.
Responden yang dipilih adalah mahasiswa yang dinyatakan sehat berdasarkan hasil pemeriksaan kesehatan oleh dokter di Klinik Farfa Darmaga. Begitu juga setelah menjalani intervensi, responden diperiksa kesehatan kembali oleh dokter yang sama dengan sebelum intervensi (format pemeriksaan terlampir di lampiran 1 point C dan D).
4" & ), 5 ,!
peneliti untuk responden terdapat pada lampiran 2. Seminggu sekali selama pelaksanaan intervensi dilakukan diskusi yang melibatkan seluruh responden mengenai penelitian dan kesehatan umum.
Sebelum pelaksanaan intervensi juga dilakukan penandatanganan surat perjanjian (“inform consent”) ( lampiran 3) dan wawancara terhadap responden dengan format kuisioner standar (lampiran 5 butir B, E, F dan G). Kuisioner tersebut berisi pertanyaanEpertanyaan yang harus di isi oleh responden mengenai status sosial ekonomi, pengetahuan tentang pangan, pola konsumsi dan kebiasaan membeli makanan jajanan.
6" * ) , !7! 8 /' 399:;
Pengukuran status gizi responden dilakukan secara antropometri yang meliputi tinggi badan (TB) dan berat badan (BB) sebelum dan sesudah intervensi. Penggolongan status gizi menurut ”Body Mass Index” (BMI) dengan satuan Kg/m2, yaitu: BMI = BB / TB2
Dimana : BMI < 17,0 , kekurangan berat badan tingkat berat BMI 17,0 – 18,4, kekurangan berat badan tingkat ringan BMI 18,5 – 25 , normal
BMI 25,1 – 27, kelebihan berat badan tingkat ringan BMI > 27,0, kelebihan berat badan tingkat berat
<" * '2!& /
=" ,(& ,! !'.(,! 8$ / ! =;
Sebelum dilakukan isolasi sel limfosit, terlebih dahulu dilakukan persiapan media kultur. Media untuk kultur dan pemeliharaan sel menggunakan RPMIE1640 bubuk 1 sachet sebanyak 16,2 gram dan dilarutkan dalam air deionisasi sampai volume 1 (satu) liter. Kemudian ditambahkan NaHCO32 gram
dan antibiotik penisilinEstreptomisin 1 % (10 ml), kemudian dilakukan sterilisasi dingin dengan membran steril berukuran 0,22 Vm. Jika digunakan dalam media pertumbuhan, komposisi medium ditambahkan 10% serum darah manusia golongan AB.
Serum darah AB diperoleh dari seorang donor darah yang bergolongan darah AB. Pengambilan darah dilakukan oleh seorang asisten tranfusi darah dengan menggunakan jarum Precisionglide TM steril sekali pakai. Kemudian darah ditempatkan dalam tabung vacutainer non koagulan. Darah tersebut selanjutnya disentrifus pada kecepatan 4000 rpm selama 30 menit. Serum dipisahkan dari endapan selEsel darah dengan menggunakan syringe steril. Serum tersebut kemudian dipanaskan dalam waterbath selama 30 menit pada suhu 56oC, kemudian disterilisasi dengan membran steril berukuran 0,22 Vm.
Limfosit manusia diisolasi dari darah ferifer dengan sentrifugasi berdasarkan perbedaan densitas larutan ficollEhypaque (Gambar 5). Pertama dilakukan pemisahan komponen seluler dengan sentrifugasi sampel darah pada
1500 rpm selama 5 menit dengan menggunakan sentrifus rotor swing. Bagian darah yang lebih berat (sel darah merah) berada dibagian bawah, sedangkan plasma darah terpisah dibagian atas. Lapisan buffycoat yang berisi sel limfosit diambil lalu ditambahkan medium basal. Tahap pemisahan selanjutnya suspensi limfosit dalam medium basal dilewatkan pada larutan ficoll hypaque secara perlahan sehingga terbentuk dua lapisan yang tidak bercampur. Kemudian tabung disentrifus lagi 30 menit pada 2500 rpm. Sel limfosit, monosit berada sebagai lapisan diatas permukaan ficoll. Sedangkan granulasit dan sel darah merah terpisah didasar tabung sentrifus. Lapisan atas yang berisi sel limfosit, monosit dan platelet dicuci dengan media basal 2 (dua) kali dan disentrifus pada 1500 rpm selama 10 menit, sehingga limfosit (dalam presipitat) terpisah dari platelet, monosit dan ficoll (dalam supernatan). Pelet sel yang diperoleh langsung
ditambah medium RPMIE1640 dan dihomogenkan, kemudian dilakukan
perhitungan jumlah sel dengan menggunakan pewarna trifan biru dengan perbandingan 1 : 1 (10 Vl suspensi sel ditambah dengan 10 Vl pewarna trifan biru). Setelah didiamkan selama 1 menit jumlah sel yang hidup dan mati dihitung dengan menggunakan hemasitometer pada perbesaran mikroskop sebesar 100 kali. Perhitungan jumlah sel dengan menggunakan pewarna trifan biru dimaksudkan untuk menentukan viabilitas sel yang akan diuji, yaitu sebelum dilakukan pengujian sel harus dalam kondisi hidup sebesar 95%. Berdasarkan hasil perhitungan jumlah sel menggunakan hemasitometer, maka dapat ditetapkan jumlah sel dalam setiap ml suspensi sebagai berikut :
N = V/4 x F x 104sel/ml N = Jumlah sel/ml
V/4 = RataErata jumlah sel terhitung dari empat bidang pandang F = Faktor pengenceran
104= 1 ml perkapasitas hemasitometer, yaitu 104ml ( Zakariaet al.2000; Wahyuni 2006).
oksidasi. Untuk uji respon proliferasi dan uji ketahanan sel limfosit terhadap oksidasi, sel limfosit ditambahkan serum darah AB 10%. Untuk analisa antiradikal bebas dan analisa kadar glutation sejumlah tertentu sel limfosit harus dilisis terlebih dahulu dengan air bebas ion dan disimpan dalam freezer pada suhu E30oC sampai digunakan untuk pengukuran.
Gambar 5 Isolasi limfosit berdasarkan perbedaan densitas larutan ficoll
histopaque (a) Bufficoat yang dilewatkan ficoll, (b) Pemisahan
dengan ficoll yang menghasilkan cincin limfosit dan (c) Endapan sel limfosit hasil pemisahan
" -! !. !(),!0 !5 & !'.(,!
" &!, &( &0! &0 /!0 8 ; & !'.(,! 8 (0!.!) ,! (0 $! ,!
> ( * ;
MulaEmula dibuat berbagai larutan standar MDA dari 1,1,3,3E
tetraetoksipropana dengan pelarut air bebas ion dengan konsentrasi 1,25 , 1,5, 1,75, 2, 2,5 pmol/ Vl. Pereaksi TBA dibuat dengan melarutkan 1,728 gram TBA (asam tiobarbiturat ) dalam 100 ml buffer phosphat pH 3.
Cincin Limfosit
Endapan sel limfosit
Sebanyak 100 Vl suspensi sel limfosit atau standar dimasukkan ke dalam tabung sentrifus, kemudian ditambahkan 75 Vl TCA 20% (dalam 0,6 mol/L HCl). Setelah itu didinginkan dalam es selama 20 menit. Campuran tersebut disentrifus
pada 5000 rpm selama 20 menit. Seratus Vl supernatan yang diperoleh
ditambahkan 20 Vl pereaksi TBA dan selanjutnya campuran tersebut dididihkan selama 30 menit. Setelah didinginkan dengan air kran campuran tersebut dimasukkan kedalam lempeng sumur mikro 96 sumur dan diukur absorbansinya dengan menggunakanmikroplate reader pada panjang gelombang 540 nm. Kurva standar dibuat dengan memplot nilai absorbansi dengan konsentrasi standar. Konsentrasi MDA sel limfosit dapat dihitung berdasarkan kurva standar.
2" &!, 0 & !( & !'.(,! 8 (0!.!) ,! (0 * '
399 0 - , ! ;
MulaEmula dipersiapkan larutan standar glutation (LEglutamylELE cysteinlycine)(GSH) dengan konsentrasi 2, 1, 0,1, 0,05, 0,001 mmol/L. Pereaksi DTNB atau pereaksi Ellman dibuat dengan melarutkan 23,8 mg DTNB dalam 10 ml larutan 1. Komposisi larutan 1 terdiri dari 3,99 gram Na2HPO4 direaksikan
dengan 0.43 gram NaH2PO4.H2O dan 0,53 gram EDTAENa2H2.2H2O kemudian
ditambahkan air sampai volume 250 ml, PH 7,5.
?" &!, ) !5! , ! 0!) & 2 , & !'.(,! 0 * (0
8 (0!.!) ,! )' <;
Suspensi sel limfosit yang memiliki jumlah sel 1,1 x 106sel / ml terlebih dahulu dilisis dalam air deionisasi dan disimpan pada suhu E30oC. Sebanyak 1 ml suspensi sel limfosit yang telah dilisis diambil dan ditambahkan metanol proE analisis 1 ml serta DPPH 0,2 mM sebanyak 1 ml dan dikocok. Kemudian disimpan dalam ruang gelap (tanpa cahaya) selama 60 menit. Sampel diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 517 nm. Sebagai kontrol digunakan campuran larutan DPPH dan metanol. Absorbansi dari tiapEtiap sampel di dapat dan aktivitas antiradikal bebas sel limfosit dapat dihitung :
Aktivitas Antiradikal Bebas (%)=
Kontrol
Untuk menguji ketahanan sel limfosit terhadap oksidasi, maka digunakan parameter aktivitas proliferasi berdasarkan nilai indeks stimulasi (IS). Oksidator yang digunakan terdiri dari tiga jenis oksidator yaitu hidrogen peroksida (H2O2),
pewarna merah makanan erithrosin dan formalin.
Suspensi sel limfosit dalam medium pertumbuhan yang mengandung serum darah AB 10% dari masingEmasing responden dimasukkan kedalam lempeng sumur mikro sebanyak 80 Vl. Kemudian ditambahkan oksidator H2O2, pewarna
erithrosin dan formalin masingEmasing sebanyak 20 Vl. Untuk H2O2konsentrasi
yang digunakan adalah 0,18 VM, pewarna erithrosin yang digunakan mempunyai konsentrasi 197 VM dan untuk formalin digunakan konsentrasi 6,6 VM. Sebagai kontrol hanya ditambahkan media RPMI saja. Dilakukan pengulangan sebanyak tiga sumur. Semua kultur diinkubasi pada inkubator dengan kondisi 5 % CO2,
37oC, dan RH 90% selama 2 jam.
Setelah masa inkubasi berakhir dilakukan pengujian dengan metode MTT seperti pada uji proliferasi. Kemudian dihitung ketahanan sel limfosit terhadap oksidasi berdasarkan aktivitas proliferasi yang dinyatakan sebagai nilai indeks stimulasi (IS) yaitu : IS =
:" -! ,+( (&!. !. !'.(,! 0 * (0 8$ / ! => /' 399:;
Suspensi sel limfosit ( 1,1 x 106 sel/ml) dari masingEmasing responden dalam medium pertumbuhan yang mengandung serum AB 10%, dimasukkan ke dalam lempeng mikro 96 sumur masingEmasing sebanyak 80 Vl tiap sumur. Tiga sumur ditambahkan mitogen Con A, tiga sumur ditambahkan mitogen LPS dan kontrol negatif hanya ditambahkan media RPMI saja, sehingga volume akhir masingEmasing sumur menjadi 100 Vl. Semua kultur diinkubasi pada inkubator dengan kondisi 5 % CO2, 37oC, dan RH 90% selama 3 x 24 jam.
Empat jam sebelum masa inkubasi berakhir ditambahkan 10 Vl larutan pereaksi garam tetrazolium (MTT) 5 mg/ml pada tiap sumur, selanjutnya diinkubasi lagi. Setelah inkubasi berakhir dilakukan pelarutan dengan larutan HCl dalam isopropanol pada tiap sumur sebanyak 100 Vl. Kemudian dilakukan pembacaan dengan alat microplate reader pada panjang gelombang 570 nm. Aktivitas proliferasi dinyatakan sebagai nilai indeks stimulasi (IS) yaitu :
IS = x100%
kontrol Absorbansi
mitogen Absorbansi
&!, !, !)
Data yang diperoleh dilakukan analisa statistik menggunakan uji t (tEtest) perbandingan dua sampel untuk melihat adanya pengaruh nyata konsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak sebelum dan sesudah intervensi antara kelompok perlakukan dan kelompok kontrol terhadap :
a. Nilai rataErata MDA sel limfosit
b. Nilai rataErata kadar glutation sel limfosit
c. Nilai rataErata aktivitas antiradikal bebas sel limfosit
d. Ketahanan sel limfosit terhadap oksidasi tiga jenis oksidator yaitu H2O2,
formalin dan erithrosin berdasarkan nilai IS
e. Nilai rataErata respon proliferasi limfosit yaitu nilai IS
3" 0 ' ' ,+( 0
Responden yang terlibat dalam penelitian ini adalah mahasiswa tingkat sarjana dan juga mahasiswa pascasarjana Institut Pertanian Bogor yang berjenis kelamin perempuan. Dasar pemikiran pemilihan responden ini adalah subjek yang memiliki aktivitas yang hampir sama. Semua responden merupakan mahasiswa yang bertempat tinggal di satu kawasan sehingga kegiatan dan menu makanan
mereka hampir sama. Dengan demikian diharapkan responden tersebut
mempunyai kebiasaan makan dan keadaan gizi yang tidak jauh berbeda.
Sebelum menjalani intervensi konsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak, semua responden baik itu kelompok kakao maupun kelompok kontrol harus menjalani pemeriksaan kesehatan terlebih dahulu di Klinik Farfa Darmaga (format pemeriksaan terdapat di lampiran 1 point C dan D). Hal ini dimaksudkan agar responden yang terlibat adalah responden yang sehat dan tidak menderita
penyakit yang serius. Pemeriksaan kesehatan yang dilakukan meliputi
pemeriksaan kesehatan fisik, denyut nadi, laju pernafasan, tekanan darah dan suhu tubuh serta wawancara terhadap riwayat kesehatan. Pemeriksaan kesehatan juga dilakukan setelah responden menjalani intervensi oleh dokter yang sama. Hasil pemeriksaan kesehatan dinyatakan bahwa semua responden berada dalam keadaan sehat dan tidak menderita penyakit yang serius. Begitu juga setelah mereka menjalani intervensi, kesehatan mereka tetap baik.
Tabel 4 Data antropometri responden sebelum dan sesudah intervensi
Hari 0 Perlakuan Setelah 25 hari Perlakuan
Responden
bubuk coklat bukanlah penyebab utama obesitas. Jadi disini kenaikan berat badan responden setelah intervensi pada penelitian ini, tidak bisa diklaim karena pengaruh konsumsi coklat, tetapi bisa juga karena faktor yang lain. Selain itu bubuk kakao yang dikonsumsi kelompok kakao pada penelitian ini adalah bubuk kakao bebas lemak sehingga kemungkinan untuk terjadi kenaikan berat badan karena konsumsi bubuk kakao adalah kecil. Murphy et al. (2003) menyebutkan bahwa konsumsi flavanol kakao dan oligomer prosianidin selama 28 hari oleh 32 responden tidak terjadi perubahan berat badan secara nyata antara kelompok perlakuan dan kelompok kontrol.
Selama intervensi berlangsung menu makan pagi dan makan malam responden disediakan oleh peneliti (lampiran 2). Hal ini diharapkan agar terdapat keseragaman asupan gizi responden selama penelitian berlangsung. Sehingga bias karena perbedaan asupan gizi diantara responden dapat diperkecil. Dan juga diharapkan selama intervensi berlangsung responden terpenuhi asupan gizi yang seimbang. Menu sarapan pagi dan makan malam yang disediakan adalah menu yang umum dikonsumsi oleh mahasiswa. Jenis makanan tersebut mudah diperoleh di warung yang berada di kampus ataupun disekitar tempat tinggal mahasiswa. Hanya menu makan siang dan makanan ringan yang mereka konsumsi sendiri antara makan pagi dan makan malam yang berbeda. Tabel 5 menggambarkan makan siang dan makanan jajanan yang dikonsumsi dan frekuensinya perorang dalam seminggu selain yang disediakan oleh peneliti. Data pada tabel 5 diperoleh berdasarkan hasil pengisian kuisioner pada lampiran 5 point F dan G.
Tabel 5 Makan siang dan makanan jajanan serta frekuensi konsumsi
Jenis Makanan Frekuensi (kali / minggu / orang)
Jeruk manis 0,91
Tempe goreng 0,79
Kerupuk 0,73
Nasi, ayam goreng 0,68
Nasi, telur ayam goreng/rebus 0,52
JenisEjenis makanan yang terdapat pada tabel 5 merupakan makanan yang mempunyai frekuensi lebih besar dari 0,25 kali perminggu per orang. Dari tabel dapat dilihat bahwa selain mengkonsumsi makanan pokok berupa nasi di siang hari, responden juga mengkonsumsi buah dan juga makanan ringan seperti pisang goreng, tempe goreng, roti dan juga es krim. Umumnya makanan jajanan ini diperoleh dari warung yang ada disekitar tempat tinggal atau sekitar kampus.
Selama intervensi berlangsung, responden dilarang mengkonsumsi
beberapa jenis makanan dan minuman diantaranya: semua jenis makanan yang terbuat dari bahan coklat, minuman kopi, teh dan minuman bersoda tinggi. Makanan dari coklat, minuman teh atau kopi dilarang konsumsi karena jenis makanan ini mengandung senyawa polifenol yang sama dengan minuman coklat bebas lemak yang diuji. Dengan demikian diharapkan bias yang terjadi karena pengaruh jenis antioksidan dari selain bahan uji dapat diperkecil.
Pengambilan darah dan analisis terhadap limfosit responden dilakukan dua kali yaitu sebelum dan sesudah intervensi. Pengambilan darah dilakukan pada jam 07.00 – 08.00 WIB. Hal ini agar keadaan kesehatan responden masih prima karena belum melakukan aktivitas yang lain. Pada saat pengambilan darah tahap kedua (sesudah intervensi) responden yang berkode K5 tidak bisa diambil darahnya karena tidak bisa hadir sehingga data responden berkode K5 (kelompok kontrol) sesudah intervensi tidak bisa dianalisis. Namun demikian hilangnya data K5 sesudah intervensi tidak mempunyai pengaruh yang berarti terhadap data penelitian secara keseluruhan.
" !. !(),!0 !5 & !'.(,! " &( &0 /!0 8 ; & !'.(,!
produk oksidasi asam lemak tidak jenuh oleh senyawa radikal (Contiet al.1991). Analisa kadar MDA sel dapat digunakan sebagai salah satu parameter untuk mengevaluasi sejauh mana terjadi kerusakan sel karena reaksi radikal bebas. Semakin tinggi kadar MDA maka mengindikasikan semakin tinggi lipid peroksida dalam tubuh yang akan merusak sel (Zakariaet al.2003).
Metode kimia yang digunakan untuk mengukur kadar MDA pada penelitian ini adalah metode uji TBA (tiobarbituric acid). Metode ini didasarkan pada reaksi antara MDA dengan asam tiobarbiturat dalam suasana asam membentuk komplek MDAETBA yang berwarna merah muda, intensitas warnanya dapat diukur dengan spektrofotometer, pada panjang gelombang 535 nm (Hong et al. 2000). Dalam penelitian ini untuk menghemat sampel limfosit pada pengukuran kadar MDA, maka metode Hong et al. dimodifikasi, dimana pengukurannya menggunakan lempeng mikro 96 sumur dan pembacaan
absorbansi intensitas warna komplek MDAETBA dengan menggunakan
mikroplate reader pada panjang gelombang 540 nm.
Hasil penelitian pengukuran kadar rataErata MDA sel limfosit kelompok kakao sebelum intervensi adalah sebesar 2,98 Vmol/l, sedangkan kelompok kontrol sebesar 3,01 Vmol/l. Setelah menjalani intervensi kadar rataErata MDA kelompok kakao menjadi 1,299 Vmol/l, sedangkan kelompok kontrol menjadi 2,069 Vmol/l. Gambar 6 dan gambar 7 merupakan hasil pengukuran kadar MDA kelompok kakao dan kelompok kontrol sebelum dan sesudah intervensi.
Gambar 6 Kadar MDA sel limfosit kelompok kakao sebelum dan sesudah
Gambar 7 Kadar MDA sel limfosit kelompok kontrol sebelum dan sesudah intervensi
Berdasarkan hasil penelitian, dapat dilihat bahwa kelompok kakao mengalami penurunan kadar MDA sel limfosit dimana selisih penurunannya sebesar 1,681 Vmol/l sesudah menjalani intervensi. Begitu juga dengan kelompok kontrol juga mengalami penurunan kadar MDA walaupun nilai penurunannya lebih kecil dibandingkan dengan kelompok kakao. Selisih penurunan kadar MDA kelompok kontrol setelah menjalani intervensi sebesar 0.941 Vmol/l.
Berdasarkan analisa statistik menggunakan uji t terjadi penurunan kadar MDA sel limfosit kelompok kakao secara nyata (p < 0,05) setelah intervensi konsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak selama 25 hari. Sedangkan kelompok kontrol penurunan kadar MDA tidak berbeda nyata (p > 0,05) antara sebelum dan sesudah intervensi..
polifenol kakao yaitu dari golongan senyawa flavonoid dapat berfungsi sebagai antioksidan primer. Kochhar and Rossell (1990) mengemukakan bahwa senyawa
polifenol dapat berfungsi sebagai antioksidan primer karena mampu
menghentikan reaksi berantai radikal bebas yang terjadi di dalam sel. Polifenol dalam bubuk kakao akan bereaksi langsung dengan senyawa peroksida radikal yang terdapat pada membran atau di dalam sel. Dengan demikian dapat menurunkan kadar MDA yang merupakan produk oksidasi asam lemak karena radikal bebas. Penurunan kadar MDA ini juga didukung dengan pengukuran aktivitas antiradikal bebas sel limfosit yang meningkat pada kelompok kakao setelah mengkonsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak.
Namun demikian tidak boleh disimpulkan bahwa penurunan kadar MDA kelompok kakao setelah intervensi hanya disebabkan oleh konsumsi bubuk kakao bebas lemak semata, namun juga dipengaruhi oleh faktor lain. Hal ini karena kelompok kontrol yang tidak mengkonsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak juga terjadi penurunan kadar MDA (secara statistik dengan uji t tidak berbeda nyata) setelah menjalani intervensi selama 25 hari.
