PERBANDINGAN EFEK KEMOPREVENTIF PEMBERIAN EKSTRAK DAN INFUSA DAUN SIRSAK (Annona muricata L.) TERHADAP GAMBARAN MIKROSKOPIS JARINGAN PAYUDARA TIKUS (Rattus
norvegicus) BETINA GALUR Sprague Dawley YANG DIINDUKSI SENYAWA 7,12 Dimethylbenz(a)anthracence (DMBA)
Oleh
BENNY SETIYADI
Skripsi
Sebagai Salah Satu Syarat untuk Mencapai Gelar SARJANA KEDOKTERAN
Pada
Fakultas Kedokteran Universitas Lampung
FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS LAMPUNG
ABSTRACT
THE CHEMOPREVENTIVE EFFECTS OF EXTRACTS COMPARE WITH INFUSE OF SOURSOP LEAVES (Annona Muricata L.) IN BREAST
TISSUE OF FEMALE SPRAGUE-DAWLEY RATS INDUCED BY DMBA
By
BENNY SETIYADI
Breast cancer is a malignancy derived from epithelial ducts and lobules. The breast cancer is the second most common cancer in Indonesia after cervical cancer.The medical treatment of cancer still has a lot of side effects. this can be minimized by using chemopreventive agents of soursop leaf infusion and extract which works selectively attacking cancer cells.
with post hoc test, there are significantly difference between groups (p<0,05).
ABSTRAK
PERBANDINGAN EFEK KEMOPREVENTIF PEMBERIAN EKSTRAK DAN INFUSA DAUN SIRSAK (Annona Muricata L.) TERHADAP GAMBARAN MIKROSKOPIS JARINGAN PAYUDARA TIKUS BETINA
GALUR SPRAGUE DAWLEY YANG DIINDUKSI DMBA
Oleh
BENNY SETIYADI
Kanker payudara merupakan keganasan yang berasal dari epitel duktus dan lobulus. Angka kejadian kanker payudara menempati urutan kedua di Indonesia setelah kanker serviks. Upaya pengobatan dengan kemoterapi masih banyak menimbulkan efek samping. Efek samping ini dapat diminimalisir dengan penggunaan agen kemopreventif dalam infusa dan estrak daun sirsak yang bekerja secara selektif dalam menyerang sel kanker.
pengambilan bagian kelenjar payudara tikus. Setelah itu dibuat sediaan Hematoxylin Eosin dan dilakukan pengamatan terhadap tingkatan hiperplasia epitel.
Dari hasil penelitian didapatkan rerata hiperplasia epitel kelompok K (0,03 ± 0,81), kelompok 1 (2,2 ± 0,21), kelompok 2 (0,7 ± 0,1), dan kelompok 3 (1,03 ± 0,12). Dengan menggunakan uji statistik Kruskall-Wallis didapatkan hasil bahwa terdapat minimal 2 kelompok yang mengalami perbedaan yang signifikan. yang dilanjutkan dengan uji post hoc Mann-Whitney didapatkan perbedaaan yang signifikan (p<0,05).
DAFTAR ISI
Halaman DAFTAR TABEL
DAFTAR GAMBAR
I. PENDAHULUAN ... 1
A.Latar Belakang ... 1
B.Rumusan Masalah ... 3
C.Tujuan Penelitian ... 4
D.Manfaat Penelitian ... 4
E. Kerangka Penelitian ... 6
1. Kerangka teori ... 6
2. Kerangka konsep ... 9
F. Hipotesis ...10
II. TINJAUAN PUSTAKA ...11
A.Daun Sirsak... 11
1. Klasifikasi... 11
2. Morfologi……… 12
3. Kandungan Kimia……… 12
4. Manfaat………. 13
B.Payudara... 13
1. Anatomi Organ Pauyudara... 13
2. Histologi Organ Payudara... 15
3. Tumor Payudara...16
C.Ekstraksi dan Infusa... 17
1. Ekstraksi……….. 17
2. Metode-metode Ekstraksi……… 18
III. METODOLOGI PENELITIAN ... 23
A.Desain Penelitian... 23
B.Tempat dan Waktu... 23
C.Populasi dan Sampel... 24
D.Besar Sampel……… 24
E. Kriteria Inklusi dan Eksklusi………. 25
F. Identifikasi Variabel dan Definisi Operasional... 26
1. Identifikasi variabel ... 26
2. Definisi operasional variabel ... 27
G.Bahan dan Cara Kerja……… 28
1. Alat dan Bahan Penelitian……… 28
2. Pembuatan Ekstraksi……… 29
3. Pembuatan Infusa Daun Sirsak……….30
4. Aklimatisasi dan Pemeliharaan Hewan Coba……….. 31
5. Induksi DMBA……… .31
6. Pembuatan Preparat………..32
H.Analisis Data ... 35
I. Alur Penelitian………...36
J. Etika Penelitian...38
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN...39
A. Hasil...39
1. Gambaran Mikroskopis Jaringan Payudara Tikus... 39
2. Analisis mikroskopik gambaran Mikroskopi Jaringan Payudara…… 43
B. Pembahasan...46
V. SIMPULAN DAN SARAN...51
A.Simpulan...51
B.Saran...52 DAFTAR PUSTAKA
DAFTAR GAMBAR
Gambar Halaman
1. Kerangka teori ...8
2. Kerangka konsep...9
3. Diagram alur penelitian ...36
4. Gambaran jaringan payudara tikus………...39
DAFTAR TABEL
Tabel Halaman
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran
1. Etik Penelitian
2. Data berat badan seluruh kelompok tikus 3. Uji statistik
I. PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Kanker merupakan suatu jenis penyakit berupa pertumbuhan sel yang tidak terkendali (Mun’im et al., 2007). Kanker payudara merupakan keganasan yang berasal dari epitel duktus dan lobulus. Kanker payudara merupakan salah satu keganasan yang paling sering dialami wanita di dunia, khususnya di Indonesia. Kanker payudara menempati urutan kedua setalah kanker serviks dengan insidensi sebanyak 8.227 kasus atau sebesar 16,85% pada tahun 2007 (Fitricia, 2012).
Pengobatan dengan menggunakan obat-obatan/ Kemoterapi yang sekarang
diterapkan, seperti taxol, klorambusil, alkaloid indo seperti vinblastin, dan
vinkristin, bekerja dengan cara mempengaruhi metabolisme asam nukleat
terutama DNA atau biosintesis protein secara tidak selektif, sehingga bersifat
toksik tidak hanya pada sel kanker tetapi juga pada sel normal, terutama sel
normal yang memiliki kecepatan proliferasi yang tinggi seperti sum-sum
tulang belakang (Siswandono et al., 2000). Penghambatan proliferasi sel-sel
sum-sum tulang belakang akan mengakibatkan penurunan jumlah leukosit
sistem imun. Dosis obat sitostatik yang tinggi juga bisa menyebabkan
terjadinya resistensi. Oleh karena itu, diperlukan pendekatan terapi kanker
yang lebih efektif dan selektif. Terapi kanker menggunakan agen
kemopreventif lebih menjanjikan daripada obat antikanker konvensional
(Hanahan & Weinberg, 2000).
Salah satu jenis tanaman yang dapat yang memiliki aktivitas sebagai agen kemopreventif adalah sirsak, terutama pada daunnya. Zat aktif dalam tanaman sirsak yang mampu berperan sebagai antikanker adalah Annonaceous acetogenins. Acetogenins merupakan inhibitor kuat dari kompleks I mitokondria atau NADH dehidrogenase. Zat ini akan mengakibatkan penurunan produksi ATP yang akan menyebabkan kematian sel kanker, lalu kemudian memicu terjadinya aktivasi jalur apoptosis serta mengaktifkan p53 yang dapat menghentikan siklus sel untuk mencegah terjadinya proliferasi tak terkendali. Selain itu, senyawa triterpenoid dan flavonoid di dalam daun sirsak juga memiliki efek antikarsinogenesis (Retnani, 2011). Pada penelitian yang dilakukan Retnani (2011) telah terbukti ekstrak daun sirsak dapat menghambat proses onkogenesis. Namun, yang sekarang digunakan oleh masyarakat Indonesia secara umum adalah rebusan atau infusa daun sirsak. Sehingga perlu dibandingkan, apakah penggunaan infusa daun sirsak dengan dosis optimal sama baiknya dengan penggunaan ekstrak daun sirsak dengan dosis optimalnya dalam menghambat onkogenesis (Hatim, 2012).
terhadap gambaran mikroskopis jaringan payudara tikus putih (Rattus norvegicus) betina galur Sprague Dawley yang diinduksi 7,12 Dimethylbenz(a)anthracence (DMBA). Serta mengetahui perbandingan antara keduanya.
B. Perumusan Masalah
Berdasarkan uraian di atas, dapat dirumuskan permasalahan sebagai berikut: 1. Apakah terdapat efek kemopreventif pemberian ekstrak daun sirsak (Annona
muricata L. L.) terhadap perubahan gambaran mikroskopis jaringan payudara tikus putih (Rattus norvegicus) betina galur Sprague Dawley yang diinduksi 7,12 Dimethylbenz(a)anthracence (DMBA)?
2. Apakah terdapat efek kemopreventif pemberian infusa daun sirsak (Annona muricata L.) terhadap gambaran mikroskopis jaringan payudara tikus putih (Rattus norvegicus) betina galur Sprague Dawley yang diinduksi 7,12 Dimethylbenz(a)anthracence (DMBA)?
3. Apakah pemberian ekstrak daun sirsak (Annona muricata L.) menunjukan hasil gambaran histologi payudara tikus putih (Rattus norvegicus) betina galur Sprague Dawley yang diinduksi 7,12 Dimethylbenz(a)anthracence (DMBA) lebih baik daripada pemberian infusa daun sirsak?
C. Tujuan
1. Mengetahui apakah terdapat efek kemopreventif pemberian ekstrak daun sirsak (Annona muricata L.) terhadap gambaran mikroskopis jaringan payudara tikus putih (Rattus norvegicus) betina galur Sprague Dawley yang diinduksi 7,12 Dimethylbenz(a)anthracence (DMBA);
2. Mengetahui apakah terdapat efek kemopreventif pemberian infusa daun sirsak (Annona muricata L.) terhadap gambaran mikroskopis jaringan payudara tikus putih (Rattus norvegicus) betina galur Sprague Dawley yang diinduksi 7,12 Dimethylbenz(a)anthracence (DMBA);
3. Mengetahui apakah pemberian ekstrak daun sirsak (Annona muricata L.) menunjukan hasil gambaran histologi payudara tikus putih (Rattus norvegicus) betina galur Sprague Dawley yang diinduksi 7,12 Dimethylbenz(a)anthracence (DMBA) lebih baik daripada pemberian infusa daun sirsak.
D. Manfaat
1. Bagi Ilmu Pengetahuan
2. Bagi Pembangunan
Hasil penelitian ini diharapkan menjadi acuan yang akan mendukung upaya pemeliharaan tanaman sirsak (Annona muricata L.) sebagai salah satu tanaman berkhasiat obat. Dengan demikian akan mendukung upaya pemerintah untuk menyukseskan program tanaman obat atau obat herbal.
3. Bagi FK Unila
Meningkatkan iklim penelitian dibidang agromedicine sehingga dapat menunjang pencapain visi FK Unila sebagai Fakultas Kedokteran terbaik di Indonesia tahun 2025 dengan kekhususan agromedicine.
4. Bagi Peneliti Lain
a. Dapat dijadikan bahan acuan untuk dilakukannya penelitian yang serupa yang berkaian dengan efek daun sirsak (Annona muricata L.).
E. Kerangka Pemikiran
1. Kerangka Teori
Berdasarkan penelitian sebelumnya, daun sirsak (Annona muricata L.) memiliki senyawa dengan aktivitas farmakologis seperti acetogenin, flavonoid, triterpenoid, dan senyawa lain yang dapat digunakan sebagai agen kemopreventif.
Penginduksian tikus putih oleh senyawa 7,12 dimethylbenz(a)anthracene (DMBA) dimasudkan agar terjadi proses karsinogenesis pada payudara. DMBA akan menyebabkan mutasi gen dan mengacaukan siklus sel dan meningkatkan proliferasi sel yang bermutasi. Perlakuan yang diberikan pada tikus putih yang bersama-sama diinduksi senyawa DMBA tersebut adalah ekstrak dan infusa daun sirsak sebagai pemicu aktivasi jalus apoptosis sel kanker secara selektif, dan menghambat proliferasi yang tidak terkendali melalui kandungan acetogenins dan polifenol sebagai agen antikarsinogenesis (Retnani, 2011).
2. Kerangka Konsep
[image:19.612.148.524.110.391.2]F. Hipotesis
Hipotesis dari penelitian ini adalah :
1. Terdapat efek kemopreventif pemberian ekstrak daun sirsak (Annona muricata L.) terhadap gambaran histopatologi payudara tikus putih (Rattus norvegicus) betina galur Sprague Dawley yang diinduksi 7,12 Dimethylbenz(a)anthracence (DMBA);
2. Terdapat efek kemopreventif pemberian infusa daun sirsak (Annona muricata L.) terhadap gambaran histopatologi payudara tikus putih (Rattus norvegicus) betina galur Sprague Dawley yang diinduksi 7,12 Dimethylbenz(a)anthracence (DMBA)
II. TINJAUAN PUSTAKA
A. Daun Sirsak (Annona muricata L.)
1. Klasifikasi
Klasifikasi dari tumbuhan sirsak adalah: Kingdom : Plantae
Divisi : Spermatophyta Sub divisi : Angiospermae Kelas : Dicotyledonae Ordo : Polycarpiceae Familia : Annonaceae Genus : Annona
2. Morfologi
Morfologi dari daun sirsak adalah berbentuk bulat dan panjang, dengan bentuk daun menyirip dengan ujung daun meruncing, permukaan daun mengkilap, serta berwarna hijau muda sampai hijau tua. Terdapat banyak putik di dalam satu bunga sehingga diberi nama bunga berpistil majemuk. Sebagian bunga terdapat dalam lingkaran, dan sebagian lagi membentuk spiral atau terpencar, tersusun secara hemisiklis. Mahkota bunga yang berjumlah 6 sepalum yang terdiri dari dua lingkaran, bentuknya hampir segitiga, tebal, dan kaku, berwarna kuning keputih-putiham, dan setelah tua mekar dan lepas dari dasar bunganya. Bunga umumnya keluar dari ketiak daun, cabang, ranting, atau pohon bentuknya sempurna (hermaprodit) (Sunarjono, 2005).
3. Kandungan Kimia
mengaktifkan p53 yang dapat menghentikan siklus sel untuk mencegah terjadinya proliferasi tak terkendali (Retnani, 2011).
4. Manfaat
Daun sirsak dimanfaatkan sebagai pengobatan alternatif untuk pengobatan kanker, yakni dengan mengkonsumsi air rebusan daun sirsak. Selain untuk pengobatan kanker, tanaman sirsak juga dimanfaatkan untuk pengobatan demam, diare, anti kejang, anti jamur, anti parasit, anti mikroba, sakit pinggang, asam urat, gatal-gatal, bisul, flu, dan lain lain (Mardiana, 2011).
B. Payudara
1. Anatomi Organ Payudara
Proses perkembangan payudara dimulai pada janin berumur 6 minggu dimana terjadi penebalan lapisan epidermis pada bagian ventral, seperfisial dari fasia pektoralis serta otot-otot pektoralis mayor dan minor. Penebalan yang terjadi pada venteromedial dari regio aksilla sampai ke regio inguinal menjadi „milk
lines’ dan selanjutnya pada bagian superior berkembang menjadi puting susu dan bagian lain menjadi atrofi (Kissane, 2005).
Payudara lazimnya terletak di antara tulang sternum bagian lateral dan lipatan ketiak, serta terbentang dari iga ke 2 sampai iga ke 6 atau 7. Pada bagian puncak dari payudara terdapat struktur berpigmen dengan diameter 2-6 cm yang dinamakan areola. Warna areola itu sendiri bervariasi mulai dari merah muda sampai coklat tua. Warna aerola ini bergantung pada umur, jumlah paritas, dan pigmentasi kulit (Djamaloedin,2008).
kemudian bercabang lagi menjadi arteri pektoralis. Sementara cabang dari arteri torakalis lateral adalah arteri mamari eksternal yang menyusuri otot pektoralis mayor untuk memperdarahi setegah payudara bagian lateral (Poggi, 2003).
Aliran darah balik pembuluh vena dari payudara mengikuti aliran artei secara berlawanan. Darah kembali menuju vena cava melalui vena aksilaris dan vena torakalis interna. Selain itu, darah juga kembali ke vena cava melalui pleksus vertebralis. Aliran balik vena pada kuadran atas lebih besar dariapda aliran balik vena kuadran bawah (Poggi, 2003).
Persarafan kulit payudara ditanggung oleh cabang pleksus servikalis dan nervus interkostalis. Jaringan kelenjar payudara sendiri diurus oleh saraf simpatik. Aliran limfe dari payudara sekitar 75% menuju ke arah aksila, sisanya ke kelenjar parasternal dan interpektoralis (Juan, 2004).
2. Histologi Organ Payudara
lobulus terdapat ligamentum Cooper yang memberi rangka untuk payudara. Setiap lobulus terdiri dari sel-sel asini yang terdiri dari sel epitel kubus dan mioepitel yang mengelilingi lumen. Sel epitel mengarah ke lumen, sedangkan sel mioepitel terletak diantara sel epitel dan membran basalis. Bagian dasar dari setiap lobus tersebut berada di daerah proksimal dekat tulang iga sedangkan bagian puncaknya adalah puting yang merupakan muara dari duktus setiap lobus. Jadi, setiap duktus laktifers akan bergabung menjadi sinus laktiferus dan akhirnya bermuara pada puting. (Junqueira, 2005).
3. Tumor Payudara
Tumor atau dalam istilah medis disebut sebagai neoplasma, secara harafiah berarti pertumbuhan baru. Neoplasma merupakan massa abnormal jaringan yang pertumbuhannya berlebihan dan tidak terkoordinasi dengan pertumbuhan jaringan normal serta terus demikian, walaupun rangsangan yang memicu perubahan tersebut telah berhenti. Hal mendasar tentang asal neoplasma adalah hilangnya responsivitas terhadap faktor pengendali pertumbuhan yang normal (Kumar, 2007).
tumor ganas atau kanker. Kanker cenderung lebih anaplastik, laju pertumbuhan lebih cepat serta tumbuh dengan cara infiltrasi, invasi, destruksi, sampai metastasis ke jaringan sekitar dan cukup potensial untuk menimbulkan kematian (Kumar, 2007).
Tumor dapat muncul pada berbagai organ tubuh manusia dalam bentuk pembesaran organ seperti pada otak, paru, tulang, ovarium, serviks, payudara, dan lain-lain. Namun, angka morbiditas dan mortalitas tumor ganas (kanker) cenderung lebih tinggi bila dibandingkan dengan tumor yang masih dalam kondisi “jinak”.
C. Ekstraksi dan Infusa
1. Ekstraksi dan Infusa
Infusa adalah salah satu cara melakukan ekstraksi, yaitu dengan cara panas menggunakan air yang mendidih. Pelarut yang digunakan pada proses infus adalah pelarut air dengan temperatus penangas air (bejana infus tercelup dalam penangas air mendidih, temperatur terukur 96-98oC) selama waktu tertentu (15-20 menit). Kelebihan dari infusa adalah cara melakukan nya mudah dan alat yang digunakan pun tergolong sederhana dan murah (Ditjem POM, 2000).
2. Metode-Metode Ekstraksi
Ekstraksi dengan menggunakan pelarut terbagi menjadi 2 cara, yaitu : 1. Cara dingin
Ekstraksi menggunakan pelarut dengan cara dingin terdiri dari: a. Maserasi
Maserasi merupakan proses pengekstraksian simplisia dengan menggunakan pelarut dengan beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada temperatur ruangan.
b. Perkolasi
2. Cara panas
Ekstraksi menggunakan pelarut dengan cara panas terdiri dari: a. Refluks
Ekstraksi dengan cara refluks menggunakan pelarut pada temperatur titik didihnya selama waktu tertentu, dan dengan jumlah pelarut yang terbatas dan relatif konstan dengan adanya pendingin balik
b. Sokletasi
Dalam Sokletasi, digunakan alat khusus sehingga terjadi ekstraksi kontinu dengan jumlah pelarut yang konstan dengan adanya pendingin balik.
c. Digesti
Digesti adalah maserasi kontinu pada suhu yang lebih tinggi daripada suhu kamar (40 – 50oC).
d. Infus
Pelarut yang digunakan pada proses infus adalah pelarut air dengan temperatus penangas air (bejana infus tercelup dalam penangas air mendidih, temperatur terukur 96-98oC) selama waktu tertentu (15-20 menit).
e. Dekok
D. DMBA Untuk Karsinogenesis
DMBA merupakan senyawa prokarsinogen dengan rumus empiris C20H16 dan memiliki berat molekul 256,34 g/mol. DMBA berbentuk padat, berwarna kuning kehijau-hijauan. Struktur kimia DMBA adalah 4 macam cincin aromatik yang berikatan khas struktur polisiklik aromatik hidrokarbon dengan tiga cincin aromatik dan 2 substituen metil (Sigma- Aldrich, 2007).
Golongan polisiklik hidrokarbon (PAH) adalah golongan zat kimia karsiogenik yang dapat menyebabkan kanker. Salah satu contoh dari golongan PAH adalah dimetilbenz(a)antrasena (DMBA). DMBa akan menjadi aktif apabila ada aktivasi metabolisme yang melibatkan enzim-enzim sitokrom dan epoksida hidrolasi. Metabolisme oleh enzim tersebut akan menyebabkan terbentuknya proximate carcinogen (karsinogen awal) yang akan akan berkembang dan dapat merusak DNA melalui pembentukan epoksoid dihidrodiol yang kemudian membentuk DNA adduct (kompeks yang dibentuk oleh bagian DNA dengan senyawa mutagen kimia dan ikatan kovalen) dan akan mengakibatkan terjadinya mutasi sel, yang akhirnya mengakibatkan terbentuknya kanker (Fitricia, 2012).
karsinogen direct. Aktivitas karsinogenik dari DMBA terjadi melalui aktivitas enzim sitokrom P450 membentuk proximate carcinogen dan ultimate carcinogen (Dandekar et al., 2006).
Sitokrom P-450 dan microsomal epoxide hydrolase (mEH) memetabolisme DMBA menjadi dua metabolit yaitu metabolit elektrofilik dan metabolit yang mampu membentuk DNA adduct (DNA yang mampu berikatan dengan senyawa karsinogenik). Sitokrom P-450 CYP1B1 mengoksidasi DMBA menjadi 3,4-epoxides yang diikuti dengan hidrolisis epoxides oleh mEH membentuk metabolit proximate carcinogenic dan DMBA-3,4-diol. Metabolit ini nantinya dioksidasi oleh CYP1A1 atau CYP1B1 menjadi metabolit ultimate carcinogenic (DMBA-3,4-diol-1,2-epoxide) (Smith et al., 2000).
E. Tikus Putih (Rattus Norvegicus) Galur Spraue Dawley
1. Klasifikasi TIkus Putih
Familia : Muridae Genus : Rattus
Spesies : Rattus norvegicus (Natawidjaya, 1983).
2. Jenis Tikus Putih
Tikus putih merupakan hewan yang paling sering digunakan sebagai hewan uji untuk penelitian karena mewakili dari kelas mamalia, sehingga kelengkapan organ, metabolism biokimianya, sistem reproduksi, kebutuhan nutrisi, peredaran darah, pernafasan, dan ekskresi yang mirip dengan manusia (Isroi, 2010).
Tikus putih atau tikus albino galur outbred adalah jenis tikus yang paling sering dipakai untuk penelitian dibandingkan dengan tikus albino galur inbred. Beberapa contoh jenis tikus putih galur outbred adalah Wistar, Sprague Dawley. Jenis ini lebih cepat tumbuh dibandingkan dengan jenis Long Evans (Natawidjaya,1983).
III. METODE PENELITIAN
A. Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian yang bersifat eksperimental laboratorium denan menggunakan hewan uji berupa tikus putih betina galur Sprague Dawley.
B. Tempat dan Waktu Penelitian
C. Populasi dan Sampel
Populasi adalah tikus putih betina galur Sprague Dawley (Rattus norvegicus) berusia 5-7 minggu dengan berat antara 100-200 gram yang diperoleh dari Kampus IPB (Institut Pertanian Bogor Dramaga) Fakultas Peternakan, Bogor . Sampel adalah jaringan payudara tikus putih populasi yang telah diinduksi DMBA dengan dosis dan kurun waktu tertentu. DMBA diperoleh dari LABTIAP, Serpong.
D. Besar Sampel
Sampel penelitian yang digunakan sebanyak 24 ekor tikus yang dipilih secara acak dan dibagi dalam 4 kelompok. Menurut Federer (1977) rumus penentuan sampel untuk uji eksperimental dengan rancangan acak lengkap adalah :
t(n-1)≥15
Dimana t merupakan jumlah kelompok percobaan dan n merupakan jumlah sampel yang diperlukan tiap kelompok. Penelitian ini menggunakan 4 kelompok perlakuan sehingga perhitungan sampel menjadi:
4(n-1)≥15 4n-4≥15
Jadi, sampel yang digunakan tiap kelompok percobaan sebanyak 6 ekor (n≥4,75) dan jumlah kelompok yang digunakan adalah 4 kelompok sehingga penelitian ini menggunakan 24 ekor tikus putih, yaitu:
Kelompok kontrol (K) : tikus yang hanya diberi aquadest 1 cc setiap hari selama 4 minggu.
Kelompok 1 : tikus yang diinduksi DMBA 20 mg/kg BB 2 x seminggu selama 4 minggu, dan diberi aquadest 1 cc setiap hari selama 4 minggu.
Kelompok 2 : tikus yang diinduksi DMBA 20 mg/kg BB 2 x seminggu selama 4 minggu dan diberi ekstrak daun sirsak dosis 40 mg/kg BB sekali sehari selama 4 minggu.
E. Kriteria Inklusi dan Eksklusi
Kriteria inklusi:
a. Sehat (tidak tampak penampakan rambut kusam, rontok, atau botak, dan bererak aktif)
b. Memiliki berat 100-200 gram c. Berjenis kelamin betina d. Berusia sekitar 5-7 minggu
Kritera Eksklusi:
a. Mati selama masa adaptasi, atau sebelum diberi perlakuan
b. Terdapat penurunan berat badan lebih dari 10% setelah masa adaptasi di laboratorium
F. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional Variabel
1. Identifikasi Variabel
a. Variabel Bebas (Independent Variable)
Variabel bebas pada penelitian ini adalah ekstrak dan infusa daun sirsak.
b. Variabel Terikat (Dependent Variable)
2. Definisi Operasional Variabel
Untuk memudahkan penelitian dan agar penelitian tidak menjadi terlalu luas, maka dibuat definisi operasional sebagai berikut:
Tabel 1. Definisi Operasional
Variabel Definisi Skala
Dosis ekstrak dan infusa daun sirsak
Ada 4 kelompok dengan perlakuan yang berbeda - Kelompok I (kontrol negatif)
- Kelompok II (kontrol positif) = induksi DMBA 20 mg/kgBB 2 x seminggu selama 4 minggu,
- Kelompok III (perlakuan coba) = induksi DMBA 20 mg/kgBB 2 x seminggu selama 4 minggu + ekstrak daun sirsak 40 mg/kgBB/hr selama 4 minggu, - Kelompok IV (perlakuan coba) = induksi DMBA 20
mg/kgBB 2 x seminggu selama 4 minggu + infusa daun sirsak 0,2 gr/ml/hari selama 4 minggu, .
Kategorik
Gambaran Histopatologi payudara
- Melihat dari hiperplasi epitel, dalam 5 lapang pandang, dari jaringan payudara yang dikategorikan secara bertingkat menurut Ting et al (2007), yaitu: Grade 0 = normal
Grade 1 = mild hyperplasia (2-4 lapis epitel yang
mengalami hyperplasia)
Grade 2 = severe hyperplasia (>4 lapis epitel yang mengalami hyperplasia)
Grade 3 = hyperplasia with athypia Grade 4= in situ carcinoma ductal Grade 5 = invasive carcinoma ductal
G. Bahan dan Cara Kerja
Alat dan Bahan Penelitian
Alat penelitian yang digunakan adalah sonde, alat bedah minor, toples kaca, neraca analitik Mettler Toledo dengan tingkat ketelitian 0,01 gr, spuit oral 1 cc dan 5 cc, kandang tikus, botol minum tikus, kapas, alat untuk membuat preparat histologi (mikrotom, oven, cetakan paraffin), Alat untuk melihat gambaran histologi (deck glass, object glass, mikroskop cahaya), Larutan NaCl untuk mencuci payudara tikus setelah dilakukan laparotomi, serta tikus putih.
Cara Kerja dari penelitian di atas adalah:
1. Ekstraksi Daun Sirsak dalam etanol 70%
Ekstraksi daun sirsak dilakukan dengan etanol 70%. Simplisia kering daun sirsak di giling dan di ayak dengan menggunakan ayakan yang sesuai, setelah sebelumnya dipotong kecil-kecil. Sebanyak 500 gram daun sirsak direndam dalam larutan etanol 70%. Setiap hari rendaman diaduk-aduk dan disaring sampai didapatkan maserat yang jernih. Maserat dikentalkan dengan rotary evaporator sampai diperoleh hasil ekstraksi. Hasil ekstraksi kemudian diencerkan dengan menggunakan akuades sesuai dengan dosis yang diinginkan, yaitu 40 mg/kgbb. Dosis tersebut merupakan dosis yang paling berpengaruh pada penelitian Hermawan et al.(2013) dilihat dari kadar fenol yang terkandung di dalamnya. Fenol merupakan salah satu gugus dari acetogenins. Dengan berat tikus yang diambil adalah 200mg, maka perhitungan dosis pemberiannya adalah:
Dosis Pemberian = dosis yang diinginkan x berat tikus
Dosis Pemberian =40 mg
kg x 200gr
Dosis Pemberian =40 mg x 200 gr
1000 gr
Larutan terapi diberikan kepada tikus dengan dosis yang 8 mg per tikus dan dilarutkan dalam 1 ml larutan aquades setiap hari selama 4 minggu.
2. Pembuatan Infusa Daun Sirsak
Infusa dibuat dari dari daun sirsak 20 % b/v dengan cara sebagai berikut :200 gr Daun sirsak ditambah dengan 1200 ml (1000 ml + 200 ml ekstra aquades) aquades dipanaskan dalam panci infusa menggunakan penangas air selama 15 menit terhitung setelah suhu dalam panci mencapai 900 C , sambil sesekali diaduk. Saring sampai memperoleh volume 1000 ml. Bila volume kurang dari 1000 ml maka dapat ditambahkan air panas yang dilewatkan melalui ampas daun sehingga diperoleh 1000 ml infusa daun sirsak dengan konsentrasi zat aktif 20%. Larutan terapi diberikan kepada tikus dengan dosis 0,2 gr/ml/ hari selama 4 minggu.
3. Aklimatisasi dan Pemeliharaan Hewan Coba
Aklimatisasi hewan coba tikus putih betina galur Sprague Dawley yang berusia 5-7 minggu dengan berat antara 100-200 gram selama 1 minggu untuk adaptasi tikus di tempat pemeliharaan. Pemberian makanan berupa pellet, serta minuman berupa air kepada tikus uji dilakukan secara ad libitum, suhu kandang dijaga dengan suhu optimal sekitar 25’C dan ada pertukaran gelap dan terang setiap 12 jam. Masing-masing kelompok dletakkan dalam kandang tersendiri dan dijaga sedemikian rupa sehingga tidak saling berinteraksi. Setiap kali akan diinduksi dan setiap pekan setelah diinduksi terakhir berat badan tikus ditimban sampai tikus diterminasi.
4. Induksi kanker payudara dengan DMBA dan pengambilan sampel
menggunak uap eter lebih dahulu, kemudian diambil jaringan payudara dengan pembedahan.
5. Pembuatan preparat dari jaringan payudara tikus
Adapun prosedur pembuatan preparat histologi (Aprilia, 2010), yaitu: a. Fixation
Memfiksasi spesimen berupa potonan organ yang telah dipilih kemudian langsung difiksasi dengan larutan formalin 10% selama 1 jam, lalu dicuci dengan air mengalir selama 15 menit..
b. Trimming
Mengecilkan organ menjadi setebal 2-4 mm.
c. Dehydration
d. Clearing
Dilakukan perendaman potongan jaringan pada xylol I, dan II, masing masing selama 1 jam secara bergantian dan berurutan, dengan tujuan untuk menghilangkan alkohol dan menjernihkan jaringan.
e. Impregnation
Dilakukan Impregnasi dengan menggunakan paraffin cair I selama 1 jam dalam oven suhu 60 oC, lalu dipindahkan ke paraffin cair II selama 1 jam kembali dalam oven suhu 60 oC.
f. Embedding
Masukan jaringan ke dalam cangkir logam. Lalu tuangkan paraffin cair dengan suhu 58’ C pada cangkir logam yang sudah dimasukan jaringan, dan ditutup dengan embedding cassette. Kemudian didiamkan sampai mulai dingin, dan dimasukan sekitar 10 menit ke dalam freezer. Kemudian setelah dingin, embedding cassette yang sudah tertempel jaringan dan parafin dikeluarkan dari cangkir logam. Blok paraffin siap dipotong dengan mikrotom.
g. Cutting
ketebalan 4-5 mikron. Pemotongan dilakukan menggunakan rotary microtome dengan disposable knife. Setelah pemotongan , dipilih lembaran jaringan yang paling baik. Kemudian lembaran jaringan tersebut dipindahkan ke dalam wadah waterbath selama beberapa detik sampai mengambang sempurna. Lembaran tersebut diambil dengan slide bersih. Prosedur ini dilakukan dengan gerakan menyendok. Lalu diletakan di tengah atau pada sepertiga atas ataupun bawah. Usahakan jangan sampai ada gelembung udara di bawah jaringan.
h. Staining (pewarnaan) dengan Meyer Hematoksilin Eosin
Setelah jaringan melekat sempurna pada slide kemudian dipilih yang terbaik. Selanjutnya secara berurutan slide dimasukan ke dalam zat kimia di bawah ini dengan waktu sebagai berikut:
1. Slide dimasukan ke dalam xylol I, II. Masing-masing dilakukan selam 1 menit.
2. Slide dimasukan ke dalam alkohol absolut I, 90%, 80%, dan 75% masing masing selama 1 menit.
3. Slide dicuci dengan aquadest selama 1 menit.
4. Slide dimasukan ke dalam bahan pewarna preparat meyer hematosilin selama 5-7 menit, kemudian dicuci dengan air mengalir selama 5 menit.
6. Slide dimasukan ke dalam alkohol 95% sebanyak 10 celupan.
7. Slide dimasukan ke dalam eosin selama 3 menit. Setelah itu dimasukkan ke dalam alkohol 80%, alkohol 90% dan alkohol absolute masing-masing sebanyak 10 celupan.
8. Slide dicelupkan ke dalam xylol I, II, dan III, masing-masing dilakukan selama 5 menit.
i. Mounting
Setelah proses pewarnaan selesai, slide ditempatkan di atas kertas tisu pada tempat datar. Slide diteteskan dengan bahan mounting yaitu kanada balsam. Kemudian ditutup menggunakan cover glass. Lakukan secara hati-hati agar tidak terbentuk gelembung udara di bawah jaringan.
j. Pembacaan slide dengan mikroskop
Slide diperiksa dibawah mikroskop dengan pembesaran 100x dan 400x.
H. Analisis Data
dianggap bermakna jika didapatkan p > 0,05. Namun, apabila distribusi data tidak normal dan varians data tidak homogen (tidak memenuhi syarat parametrik), akan diuji dengan uji Kruskal Wallis. Jika pada uji one way ANOVA menghasilkan nilai p < 0,05 (hipotesis dianggap bermakna) maka akan dilanjutkan dengan melakukan analisis Post Hoc LSD untuk mengetahui perbedaan antar kelompok yang lebih terinci. Untuk uji Post Hoc Kruskal Wallis digunakan uji Mann-Whitney.
I. Alur Penelitian
J. Etika Penelitian
V. SIMPULAN DAN SARAN
A.Simpulan
1. Terdapat efek kemopreventif pemberian ekstrak daun sirsak (Annona muricata L. L.) terhadap perubahan gambaran mikroskopis jaringan payudara tikus putih (Rattus norvegicus) betina galur Sprague Dawley yang diinduksi 7,12 Dimethylbenz(a)anthracence (DMBA).
2. Terdapat efek kemopreventif pemberian infusa daun sirsak (Annona muricata L.) terhadap gambaran mikroskopis jaringan payudara tikus putih (Rattus norvegicus) betina galur Sprague Dawley yang diinduksi 7,12 Dimethylbenz(a)anthracence (DMBA).
B.Saran
Peneliti lain disarankan untuk:
1. Meneliti lebih lanjut terkait perbedaan pengaruh ekstrak dan infusa apabila DMBA yang digunakan diberikan tidak secara oral, tetapi secara intraperitoneal.
2. Meneliti lebih lanjut dengan jangka waktu yang lebih lama untuk melihat bagaimana jika pemberian DMBA dalam waktu yang lebih lama.
DAFTAR PUSTAKA
Aprilia L. 2010. Efek protektif ekstrak etanol buah mahkota dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl.) terhadap gambaran histopatologi hati mencit jantan galur balb/c yang diinduksi oleh etanol. Skripsi. Lampung: Fakultas Kedokteran Universitas Lampung..
Dandekar, S., Sukumar, S., Zarbl, H., Young, L., dan Cardiff, R. 2006. Spesific activation of the cellular Harvey-ras oncogene in dimethylbenzathracene-induced mouse mammar tumors. Moll Cell Biol. 3 (6) : 4104-4108.
Ditjen POM. 2000. Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat. Cetakan Pertama. Jakarta : Departemen Kesehatan RI. Hlm 5, 10- 11.
Djamaloedin. 2008. Kelainan pada Mamma (Payudara). Dalam: Wiknjosastro, H (ed.). Ilmu Kandungan, Ed ke-2. Jakarta: Yayasan Binsa Pustaka Sarwono Prawodiharjo. Hlm 472-477.
Federer, WT. 1977. Experimental Design Theory And Application, Ed ke-3. New Delhi Bombay Calcuta. :Oxford and IBH Publishing Co.
Fitricia, I., Winarni, D., dan Pidada, R. 2012. Pengaruh Pemberian Tomat (Solanum Lycopensicum L.) terhadap Histologi Kelenjar Mammae Mencit yang diinduksi 7,12- Dimetilbenz(a)antrasena (DMBA). Jurnal Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Airlangga 2 (15) : 9.
Hanahan, D., Weinberg, RA. 2000. The Hallmarks of Cancer, Cell, Vol.100, Hal 57-70.
Hatim, N. 2012. Aktivitas Antikanker Ekstrak Etanol Daun Surian (Toona sinensis) Pada Tikus Betina Sprague dawley Yang Diinduksi 7,12- Dimetilbenz(a)antrasena (DMBA). Departemen Biokimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor: Bogor.
Hermawan, GP., dan Laksono, H. 2013. Ekstraksi Daun Sirsak (Annona muricata L.) Menggunakan Pelarut Etano. Jurnal Teknologi Kimia dan Industri Universitas Dipenogoro. 2 (2) : 111-115.
Isroi. 2010. Tikus untuk Penelitian di Laboratorium. Diakses tanggal 31 Juli 2013. www.isroi.com/2010/03/02/tikus-untuk-penelitian-di-laboratorium/
Kawasaki,T., Igarashi, K., Koeda, T., Sugimoto, K., Nakagawa, K., Hayashi, S., Yamaji, R., Inui, H., Fukusato T., dan Yamanouchi, T. 2009. Rats Fed Fructose-enriched Diets have Characteristics of Nonalcoholic Hepatic Steatosis. J. Nutr. 4(39): 2067-2071.
Kissane, JM. 2005. Anderson’s Pathology II. Mosby Inc : United States of America. pp. 186-190 Kumar, V., Robbins, SL., dan Cotran, RS. 2007. Buku Ajar Patologi Anatomi. Vol 2 Ed 7. Jakarta:
Penerbit Buku Kedokteran EGC. pp. 378
Laurence, J., Bacharach, M. 1964. Analytical Toxicology. Philadelphia: CRC Press.
Mardiana, L., Ratnasari, J. 2011. Ramuan dan Khasiat Sirsak. Jakarta : Penebar Swadaya. Hlm 17, 38-40.
Mun’im, A., Mansur, U., Chany, F., dan Wulan, T. 2007. Uji Hambatan Karsinogenesis Sari Buah Merah (Pandanus conoidus Lam.) Merek N terhadap Tikus Putih Betina yang diinduksi 7,12- Dimetilbenz(a)antrasena (DMBA). Jakarta: Departemen Farmasi FMIPA UI. Poggi, MM., dan Kathleen, H. 2003. Current Diagnosis & Treatment Obstetrics & Gynecologic.
10th ed. North America: McGraw-Hill. pp. 98-100.
Rahayu, L. 2009. Isolasi dan Identifikasi Senyawa Flavonoid dari Biji Kacang Tunggak (Vigna unguiculata L.). Skripsi. Universitas Brawijaya: Malang.
Retnani, V. 2011. Pengaruh Suplementasi Ekstrak Daun Annona muricata Terhadap Kejadian Displasia Epitel Kelenjar Payudara Tikus Sprague dawley yang diinduksi 7,12- Dimetilbenz(a)antrasena (DMBA). Skripsi. Fakultas Kedokteran Universitas Dipenogoro: Semarang.
Sigma-Aldrich. 2007. 7,12-Dimethylbenz(A)anthracene. Diakses tanggal 2 Oktober 2013. http//www.sigmaaIdrich.com.
Siswandono, SB. 2000. Kimia Medisinal, Ed ke-2. Airlangga University. Hal 56-57.
Smith, AD. 2000. Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology. Revised Ed. London : Oxford University Pr.
Smith, IB., dan Mangkoewidjojo, S.2010. Pemeliharaan, Pembiakan dan Penggunaan Hewan Percobaan di Daerah Tropis. Department of Education and Culture. Directorate Generale of Higher Education, Australia.
Ting AY., Kimler BF., Fabian CJ., dan Petroff BK. 2007. Characterization of A Preclinical Model of Simultaneous Breast and Ovarian Cancer Progression. Carcinogenesis Journal. 1(28): 130–135.
