EFEK KEMOPREVENTIF PEMBERIAN INFUSA DAUN SIRSAK (Annona muricata L.) PADA EPITEL DUKTUS JARINGAN PAYUDARA
TIKUS BETINA GALUR SPRAGUE DAWLEY YANG DIINDUKSI SENYAWA 7,12-DIMETHYLBENZ[A]ANTHRACENE (DMBA)
Oleh
FARAH BILQISTIPUTRI
Skripsi
Sebagai Salah Satu Syarat untuk Mencapai Gelar SARJANA KEDOKTERAN
Pada
Fakultas Kedokteran Universitas Lampung
FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS LAMPUNG
ABSTRACT
CHEMOPREVENTIVE EFFECTS OF SOURSOP LEAVES (Annona Muricata L.) INFUSION IN DUCTAL EPITHELIAL OF BREAST TISSUE
IN FEMALE SPRAGUE-DAWLEY RATS INDUCED BY 7,12-DIMETHYLBENZ[A]ANTHRACENE (DMBA)
By
FARAH BILQISTIPUTRI
Breast cancer is the cancer with the highest incidence and mortality on woman in the world, and it tends to increase. The Increase of cancer incidence is a serious issue, which needs to be prevented. Soursop leaf has potency as a chemopreventive agent that is safe and relatively inexpensive. The study was aimed to determine the chemopreventive effects of soursop leaf (Annona muricata L.) infusion in the ductal epithelial of breast tissue in female rats.
terminated by anesthesia and cervical dislocation, then the breast tissue was taken for histopathological preparations with hematoxylin-eosin staining, and subsequently carried out for the observations of epithelial hyperplasia of mammary glands.
The results of microscopic appearance showed that KI had normal breast glandular epithelium (0.03 ± 0.82), KII showed severe hyperplasia – athypia (2.2 ± 0.22), KIII showed mild hyperplasia (0.6 ± 0.13) and KIV showed mild – severe hyperplasia (1.03 ± 0.15). The results of the Kruskal-Wallis and Mann-Whitney test showed significant differences among all treatments (the entire p-values were less than 0.005). The test results showed that the soursop leaves infusion at a dose of 0.1 g/1ml (KIII) had the chemopreventive effects better than other treatments.
ABSTRAK
EFEK KEMOPREVENTIF PEMBERIAN INFUSA DAUN SIRSAK (Annona muricata L.) PADA EPITEL DUKTUS JARINGAN PAYUDARA
TIKUS BETINA GALUR SPRAGUE DAWLEY YANG DIINDUKSI SENYAWA 7,12-DIMETHYLBENZ[A]ANTHRACENE (DMBA)
Oleh
FARAH BILQISTIPUTRI
Kanker payudara merupakan kanker dengan insidensi dan mortalitas terbanyak pada wanita di dunia, dan cenderung terus meningkat. Peningkatan insiden kanker menuntut perhatian yang serius, sehingga perlu dilakukan tindakan pencegahan. Daun sirsak merupakan tanaman yang berpotensi sebagai agen kemopreventif yang aman dan relatif murah. Penelitian bertujuan untuk mengetahui efek infusa daun sirsak (Annona muricata) pada epitel duktus jaringan payudara tikus betina.
Hematoxylin Eosin, dan selanjutnya dilakukan pengamatan terhadap hiperplasia epitel kelenjar payudara.
Hasil penelitian memperlihatkan bahwa KI memberikan gambaran mikroskopis epitel kelenjar payudara normal (0,03 ± 0,82), KII hiperplasia berat-atipia (2,2 ± 0,22), KIII hiperplasia ringan (0,6 ± 0,13), KIV hiperplasia ringan-berat (1,03 ± 0,15). Hasil uji Kruskal-Wallis yang dilanjutkan uji Mann-Whitney memperlihatkan adanya perbedaan yang signifikan pada semua perlakuan (p<0,05). Hasil uji tersebut memperlihatkan bahwa infusa daun sirsak dengan dosis 0,1g/1ml (KIII) memiliki efek kemopreventif yang paling baik dibanding perlakuan lainnya.
DAFTAR ISI
Halaman DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL DAFTAR GAMBAR DAFTAR LAMPIRAN
I. PENDAHULUAN ... 1
A.Latar Belakang ... 1
B.Rumusan Masalah ... 4
C.Tujuan Penelitian ... 5
D.Manfaat Penelitian ... 5
E. Kerangka Penelitian ... 6
1. Kerangka teori ... 6
2. Kerangka konsep ... 9
F. Hipotesis ... 9
II. TINJAUAN PUSTAKA ...10
A.Daun Sirsak... 10
B.Payudara... 11
1. Anatomi Organ Payudara... 11
2. Histologi Organ Payudara... 13
3. Tumor Payudara ... 14
B.Tempat dan Waktu Penelitian ... 25
C.Populasi dan Sampel... 26
1. Populasi ... 26
2. Sampel ... 26
D.Variabel Penelitian dan Definisi Operasional... 28
1. Variabel Penelitian ... 28
2. Definisi Operasional... 28
E. Alat dan Bahan Penelitian ... 30
F. Prosedur Penelitian ... 27
G.Pengolahan dan Analisis Data ... 38
H.Diagram Alir ... 39
I. Etika Penelitian ... 40
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ... 41
A. Hasil Penelitian ... 41
1. Gambaran Mikroskopis Jaringan Payudara Tikus ... 41
2. Analisis Gambaran Mikroskopis Jaringan Payudara Tikus ... 44
B. Pembahasan ... 47
V. SIMPULAN DAN SARAN ... 53
A.Simpulan ... 53
B.Saran ... 53 DAFTAR PUSTAKA
DAFTAR GAMBAR
Gambar Halaman
1. Kerangka Teori Efek Kemopreventif Pemberian Infusa Daun Sirsak pada Epitel Duktus Jaringan Payudara Tikus Putih Betina yang Diinduksi Senyawa DMBA ... 8 2. Kerangka Konsep Efek Kemopreventif Pemberian Infusa Daun Sirsak
pada Epitel Duktus Jaringan Payudara Tikus Putih Betina yang Diinduksi Senyawa DMBA ... 9
3. Diagram Alir Penelitian ... 40
4. Gambar Epitel Kelenjar Payudara Tikus (Tanda Panah) yang Dipulas dengan Hematoxylin Eosin Perbesaran 400x ... 42
DAFTAR TABEL
Tabel Halaman
1. Definisi Operasional...29
2. Kelompok Perlakuan...34
3. Rata-rata dan Rerata Grade Epitel Kelenjar Payudara Tikus...44
I. PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Kanker payudara merupakan kanker dengan insidensi dan mortalitas terbanyak pada wanita di dunia, yaitu sebanyak 1.384.155 kejadian dan 458.503 kematian (IARC, 2013). 70% dari kematian tersebut terdapat di negara miskin dan berkembang. Kematian akibat kanker di seluruh dunia diproyeksikan akan terus meningkat, dengan perkiraan 13,1 juta kematian pada tahun 2030 (WHO, 2013).
Kanker payudara merupakan salah satu jenis kanker yang telah menjadi permasalahan kesehatan tidak hanya di negara maju namun juga di negara berkembang. Hal ini disebabkan kanker payudara dapat dipicu oleh beberapa faktor resiko. Pada keluarga yang mempunyai riwayat penyakit kanker payudara, faktor resiko terkena kanker payudara akan meningkatkan dua sampai tiga kali lipat. Beberapa mutasi gen, terutama gen BRCA1, BRCA2, dan p53 juga menjadi resiko tinggi kanker payudara (Lacey, 2009).
hidup (Parkin et al., 2002). Selain itu juga akan berdampak pada ekonomi (Anon, 2009a; Chirikos, 2001), social, dan psikologis penderitanya (Anon, 2009b).
Berdasarkan data-data dan kejadian tersebut, maka perlu dilakukan tindakan pencegahan untuk menekan angka kejadian kanker payudara. Mengingat selain penyakit kanker umumnya baru diketahui setelah sampai pada tahap progresi hingga sulit dilakukan terapi, karena pada tahap tersebut, sel-sel pada payudara sudah mengalami kelainan seluler yang majemuk. Oleh karena itu pengembangan terapi kanker perlu dilakukan ke semua tahap untuk mencegah terjadinya perkembangan lanjut dari sel-sel tumor tersebut (Meiyanto et al., 2007).
Menurut Kakizoe (2003) agen kemopreventif lebih menjanjikan dibanding obat antikanker konvensional. Namun agen kemopreventif itu sendiri ada yang konvensional dan adapula yang berasal dari makhluk hidup. Saat ini sudah terdapat banyak agen antikanker konvesional yang umumnya berasal dari bahan sintetis, yang sengaja diproduksi untuk mengobati maupun mencegah penyakit kanker. Namun obat konvensional atau sitostatika ini selain harganya sangat mahal, juga bekerja tidak selektif, bahkan bersifat toksik pada sel normal, sehingga menimbulkan berbagai efek samping yang merugikan. Oleh karena itu perlu pendekatan lain berupa terapi kanker yang relatif aman (Chang dan Kinghorn, 2001) dan harganya terjangkau. Oleh karena itu maka penggunaan fitofarmaka sebagai agen kemopreventif dapat menjadi pilihan cara untuk mencegah karsinogenesis.
senyawa yang dapat menghambat dan menekan proses onkogenesis. Senyawa yang dapat menghambat dan menekan proses onkogenesis tersebut diantaranya adalah antioksidan (Hadi et al., 2003). Menurut Baskar et al. (2007) salah satu jenis tanaman yang mempunyai aktivitas antioksidan yang tinggi adalah tanaman sirsak (Annona muricata), terutama pada daunnya. Hasil uji in vitro memperlihatkan bahwa daun sirsak mempunyai aktivitas antioksidan yang tinggi. Hal tersebut terjadi karena pada daun sirsak terdapat senyawa acetogenin, yaitu senyawa yang diduga berperan sebagai penangkal radikal bebas dan agen antitumor yang cukup efektif. Maka daun sirsak merupakan tanaman yang berpotensi sebagai agen kemopreventif yang aman dan relatif murah. Namun demikian untuk membuktikan hal tersebut perlu ada bukti ilmiah bahwa daun sirsak efektif untuk menghambat onkogenesis pada kanker payudara.
B. Rumusan Masalah
Kanker saat ini telah menjadi beban di tiap Negara (global burden). Menurut dara statistik WHO (2013), kematian akibat kanker di seluruh dunia diproyeksikan akan terus meningkat, dengan perkiraan 13,1 juta kematian pada tahun 2030. Bahkan sebagian besar angka kejadian kanker terjadi pada negara berkembang. Kanker payudara merupakan masalah kesehatan masyarakat yang penting, karena menjadi kanker terbanyak pada wanita di dunia, dan terbanyak kedua setelah kanker serviks di Indonesia.
Pengobatan yang dijalankan oleh penderita kanker seperti kemoterapi memberikan dampak terhadap kualitas hidup penderita kanker akibat efek samping yang ditimbulkan oleh terapi kanker tersebut (Broekel et al., 2000). Maka perlu dicari agen kemoterapi yang efektif dan aman untuk mencegah kanker. Daun sirsak (Annona muricata) memiliki kandungan antioksidan tinggi dan diduga dapat menjadi agen kemopreventif kanker. Namun hal tersebut harus dibuktikan kebenarannya, misalnya melalui pengamatan gambaran mikroskopis jaringan payudara tikus yang diinduksi oleh senyawa yang dapat menginduksi tumor dan sekaligus diberikan infusa daun sirsak.
C. Tujuan Penelitian
1. Tujuan Umum
Mengetahui efek infusa daun sirsak (Annona muricata) pada perubahan epitel duktus payudara tikus putih (Rattus norvegicus) betina galur Sprague Dawley yang diinduksi senyawa 7,12 dimethylbenz(a)anthracene (DMBA).
2. Tujuan khusus
Mengetahui perbandingan efek infusa daun sirsak (Annona muricata) dengan dosis 0,1g/1ml dan 0,2g/2ml pada perubahan epitel duktus jaringan payudara tikus putih (Rattus norvegicus) betina galur Sprague Dawley yang diinduksi senyawa 7,12 dimethylbenz(a)anthracene (DMBA).
D. Manfaat Penelitian
E. Kerangka Penelitian
1. Kerangka Teori
Berdasarkan penelitian sebelumnya, daun sirsak (Annona muricata) memiliki senyawa dengan aktivitas farmakologis seperti acetogenin, flavonoid, triterpenoid, dan senyawa lain yang diduga dapat digunakan sebagai bahan antikanker. Mekanisme acetogenin adalah menginhibisi sistem transpor elektron dan oksidasi NADH dari metabolisme sel kanker sehingga menghambat pembentukan ATP dan akibatnya jumlah ATP berkurang dan akhirnya sel kanker mati (Chiu et al., 2003). Senyawa flavonoid dapat menghambat proses onkogenesis dengan tiga cara, yang pertama adalah dengan menginduksi apoptosis dan menghentikan siklus sel melalui mekanisme inhibisi enzim topoisomerase, selanjutnya flavonoid juga dapat menghambat aktivitas karsinogen melalui inhibisi sitokrom P450 sehingga senyawa karsinogen menjadi tidak reaktif, serta meningkatkan ekspresi enzim gluthation S-transferase yang dapat mendetoksifikasi karsinogen sehingga cepat dieliminasi tubuh (Ren et al, 2003). Triterpenoid dapat memblok siklus sel pada fase G2/M dengan menstabilkan benang-benang spindle pada fase mitosis sehingga proses mitosis dapat terhambat. Terpenoid juga dapat memicu apoptosis melalui mekanisme seperti flavonoid (Sugianto, et al., 2003).
Pada penelitian ini tikus putih diinduksi oleh senyawa 7,12 dimethylbenz(a)anthracene (DMBA) sehingga menyerupai manusia yang mengalami onkogenesis kanker payudara. Menurut Hakkak (2005) dalam Hatim (2012), DMBA akan menyebabkan mutasi gen dan mengendalikan siklus sel sehingga akan terjadi proliferasi kanker. Perlakuan yang diberikan pada tikus putih yang bersama-sama diinduksi senyawa DMBA tersebut adalah infusa daun sirsak sebagai penginduksi apoptosis dan menghentikan siklus sel, sehingga dapat penghambat proses karsinogenesis (Baskar et al., 2007).
2. Kerangka Konsep
Variabel independen pada penelitian ini adalah dosis infusa daun sirsak yang terdiri dari dosis 0,1 mg/1ml dan 0,2 mg/2ml. Variabel independen ini akan mempengaruhi variabel dependen, yaitu gambaran mikroskopis jaringan payudara tikus yang diinduksi oleh senyawa DMBA. Kerangka konsep penelitian ini dituangkan pada Gambar 2.
Gambar 2. Kerangka Konsep Efek Kemopreventif Pemberian Infusa Daun Sirsak pada Epitel Duktus Jaringan Payudara Tikus Putih Betina yang Diinduksi Senyawa DMBA
F. Hipotesis
Pemberian infusa daun sirsak (Annona muricata) memiliki efek kemopreventif pada gambaran mikroskopis jaringan payudara tikus putih (Rattus norvegicus) betina yang diinduksi senyawa 7,12-dimethylbenz(a)anthracene (DMBA).
Variabel independen Variabel dependen
Dosis infusa daun sirsak
(Annona muricata)
Gambaran epitel duktus
payudara tikus yang diinduksi
II. TINJAUAN PUSTAKA
A. Daun Sirsak
Sirsak merupakan jenis tanaman yang paling mudah tumbuh diantara jenis- jenis Annona lainnya dan memerlukan iklim tropik yang hangat dan lembab. Tanaman ini dapat tumbuh pada ketinggian sampai 1200 m dari permukaan laut. Tanaman sirsak akan tumbuh sangat baik pada keadaan iklim bersuhu 22-28oC, dengan kelembaban dan curah hujan berkisar antara 1500-2500 mm per tahun. (Herliana dan Rifai, 2011).
Tanaman sirsak (Annona muricata Linn.) termasuk tanaman tahunan dengan sistematika sebagai berikut :
Kingdom : Plantae
Divisi : Spermatophyta Subdivisi : Angiospermae Kelas : Dicotyldonae Famili : Annonaceae Genus : Annona
Daun sirsak berbentuk bulat panjang dengan ujung lancip pendek. Daun tuanya berwarna hijau tua sedangkan daun mudanya berwarna hijau kekuningan. Daun sirsak tebal dan agak kaku dengan urat daun menyirip atau tegak pada urat daun utama. Daun sirsak terkadang menimbulkan bau yang tidak enak dicium (Herliana dan Rifai, 2011).
Daun sirsak mengandung senyawa monotetrahidrofuran asetogenin, seperti anomurisin A dan B, gigantetrosin A, annonasin-10-one, murikatosin A dan B, annonasin, dan goniotalamisin. Khasiat senyawa-senyawa ini untuk pengobatan berbagai penyakit. Daun sirsak juga mengandung senyawa flavonoid, triterpenoid, saponin, polifenol, dan metabolit sekunder lainnya yang diduga dapat menjadi bahan antikanker (Suranto, 2011).
B. Payudara
1. Anatomi Organ Payudara
berkembang dan tidak memiliki fungsi dalam proses laktasi seperti pada wanita (Van De Graaff, 2002).
Proses perkembangan payudara dimulai pada janin berumur 6 minggu dimana terjadi penebalan lapisan epidermis pada bagian ventral, superfisial dari fasia pektoralis serta otot-otot pektoralis mayor dan minor. Penebalan yang terjadi pada venteromedial dari regio aksila sampai ke regio inguinal menjadi ‘milk lines’ dan selanjutnya pada bagian superior berkembang menjadi puting susu
dan bagian lain menjadi atrofi (Van De Graaff, 2002).
Payudara lazimnya terletak di antara tulang sternum bagian lateral dan lipatan ketiak, serta terbentang dari iga ke 2 sampai iga ke 6 atau 7. Pada bagian puncak dari payudara terdapat struktur berpigmen dengan diameter 2-6 cm yang dinamakan areola. Warna areola itu sendiri bervariasi mulai dari merah muda sampai coklat tua. Warna areoala ini bergantung pada umur, jumlah paritas, dan pigmentasi kulit (Djamaloedin, 2008).
torakalis lateral. Cabang dari arteri aksilaris adalah arteri arteri torakoakromial, kemudian bercabang lagi menjadi arteri pektoralis. Sementara cabang dari arteri torakalis lateral adalah arteri mamari eksternal yang menyusuri otot pektoralis mayor untuk memperdarahi setengah payudara bagian lateral (Moore, 2009).
Aliran darah balik pembuluh vena dari payudara mengikuti aliran arteri secara berlawanan. Darah kembali menuju vena cava melalui vena aksilaris dan vena torakalis interna. Selain itu, darah juga kembali ke vena cava melalui pleksus vertebralis. Aliran balik vena pada kuadran atas lebih besar daripada aliran balik vena dari kuadran bawah (Moore, 2009).
Persarafan kulit payudara ditanggung oleh cabang pleksus servikalis dan n. interkostalis. Jaringan kelenjar payudara sendiri diurus oleh saraf simpatik. Aliran limfe dari payudara sekitar 75% menuju ke aksila, sisanya ke kelenjar parasternal dan interpektoralis (Juan, 2004).
2. Histologi Organ Payudara
duktus laktiferus akan bergabung menjadi sinus laktiferus dan akhirnya bermuara pada puting (Junqueira, 2007).
Diantara kelenjar susu dan fasia pektoralis serta diantara kulit dan kelenjar payudara terdapat jaringan lemak. Diantara lobulus terdapat ligamentum Cooper yang memberi rangka untuk payudara. Setiap lobulus terdiri dari sel-sel asini yang terdiri dari sel epitel kubus dan mioepitel yang mengelilingi lumen. Sel epitel mengarah ke lumen, sedangkan sel mioepitel terletak diantara sel epitel dan membran basalis (Sjamsuhidajat, 2000).
3. Tumor Payudara
Tumor atau dalam istilah medis disebut sebagai neoplasma, secara harafiah berarti pertumbuhan baru. Neoplasma merupakan massa abnormal jaringan yang pertumbuhannya berlebihan dan tidak terkoordinasi dengan pertumbuhan jaringan normal serta terus demikian, walaupun rangsangan yang memicu perubahan tersebut telah berhenti. Hal mendasar tentang asal neoplasma adalah hilangnya responsivitas terhadap faktor pengendali pertumbuhan yang normal (Kumar, 2007).
tumor ganas atau kanker. Kanker cenderung lebih anaplastik, laju pertumbuhan lebih cepat serta tumbuh dengan cara infiltrasi, invasi, destruksi, sampai metastasis ke jaringan sekitar dan cukup potensial untuk menimbulkan kematian (Kumar, 2007).
Tumor dapat muncul pada berbagai organ tubuh manusia dalam bentuk pembesaran organ seperti pada otak, paru, tulang, ovarium, serviks, payudara, dan lain-lain. Namun, angka morbiditas dan mortalitas tumor ganas (kanker) cenderung lebih tinggi bila dibandingkan dengan tumor yang masih dalam kondisi jinak.
Kelainan payudara berasal dari sel kelenjar, saluran kelenjar, dan jaringan penunjang payudara. Kelainan ini biasanya mengambil bentuk massa atau nodus yang dapat diraba dan kadang-kadang nyeri. Sebagian besar lesi bersifat jinak, namun dapat berkembang ke arah keganasan. Proses pembentukan sel-sel normal menjadi sel-sel tumor hingga menjadi keganasan disebut dengan ongkogenesis. Faktor yang berperan dalam proses onkogenesis secara genetik adalah onkogen dan tumor suppressor gen (Osborne et al., 2004).
A. Onkogen
kanker payudara. Mekanisme aktivasi yang lain yaitu point mutation yang meningkatkan fungsi onkoprotein. Contoh dari point mutation adalah ras oncogene akan tetapi tidak terdapat pada kanker payudara (Osborne et al., 2004).
Mekanisme aktivasi yang lain adalah melibatkan translokasi kromosom dimana gen gabungan terbaru ditranskripsikan menjadi protein dengan fungsi yang meningkat. Onkogen kemungkinan juga akan berinteraksi dengan perubahan genetik atau epigenetik yang lain. Pada kanker payudara difokuskan perhatian lebih banyak pada komponen onkogen dari cell signaling system, contohnya HER-2/Neu cascade. Pada komponen ini yang paling sering dipelajari adalah HER-2 membrane receptor tyrosine kinase (Osborne et al., 2004).
Berbagai onkogen terdapat pada kanker manusia tetapi relatif sedikit yang penting dalam progresi kanker payudara. Proses amplikafikasi dan ekspresi berlebih dari onkogen beserta produknya adalah mekanisme utama dalam proses karsinogenesis. Amplifikasi dapat melibatkan regio kromosomal pendek sampai lengan kromosom yang melibatkan ratusan gen sampai dengan keseluruhan kromosom (Osborne et al., 2004).
1. Human Epithelial Receptor 2 (HER-2)
autonom. Dilanjutkan dengan dimerisasi dan autofosforilasi reseptor yang dapat menimbulkan transduksi multipel melalui berbagai jalur. Jalurnya dapat berupa mitogen-activated protein (MAP) kinase dan 3-kinase (PI3K)/Akt yang berlanjut dengan proliferasi, angiogenesis, perubaan interaksi sel, peningkatan kecepatan sel, metastasis dan resistansi terhadap apoptosis. Gen Her-2 jarang terdapat pada lesi tumor payudara jinak. Her-2 terdapat dan berlebih ekspresinya pada kanker payudara invasif (20-30%) dan paling menarik terdapat paling banyak pada kasus Ductal Carcinoma In Situ (DCIS). Beberapa penelitian menyatakan bahwa hubungan HER-2 dengan resiko rekuren dalam kanker payudara stadium awal dan terjadi resistansi terhadap terapi nonanthracycline, peningkatan sensitivitas terhadap terapi hormonal (tamoxifen) dan doxorubicin. Sampai saat ini status HER-2 hanya direkomendasikan untuk terapi trastuzumab. Selain itu terdapat gen HER-1 atau yaitu Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) yang relevan dengan kanker payudara.
2. Cyclins dan Siklus Sel
amplifikasi sebanyak 20% pada kanker payudara invasif. Sedangkan gen yang mengkodekan Cyclin E terletak pada kromsom 19q12 dan jarang mengalami amplifikasi pada kanker payudara. Meskipun demikian overekspresi dan perubahan jalur degradasi mengakibatkan akumulasi isoform berat molekul rendah dalam kasus 20-30% kanker payudara. 3. Onkogen c-myc terletak pada kromosom 8q24 dan mengkodekan
fosfoprotein yang bertindak sebagai regulator transkripsi dalam proliferasi seluler, diferensiasi dan apoptosis. Mengalami amplikasi dan overekspresi pada 15-25% tumor payudara. Dapat juga dihubungkan dengan prognosis buruk atau gejala klinis yang agresif.
B. Tumor Supressor Genes
(Osborne et al., 2004). 1. Onkogen p53
Mutasi pada p53 diperkirakan terjadi sampai separuh dari semua kanker manusia dan 20-30% pada kanker payudara. Perubahan germline p53 dapat menyebabkan sindrom Li-Fraumeni yaitu predisposisi bawaan untuk mengalami keganasan seperti kanker payudara, sarkoma, leukemia dan tumor otak pada dekade kedua dan ketiga. p53 terletak pada kromosom 17p. Pada kondisi normal, p53 bertindak mengatur mekanisme pembelahan sel. Ketiak teraktivasi, p53 dapat berinteraksi langsung dengan DNA untuk menghasilkan transkripsi sejumlah gen termasuk CKI p21, istirahat sementara pada siklus sel dalam fase G1 atau G2/M sebelum mitosis untuk perbaikan DNA. p53 juga mampu berinteraksi dengan jalur selular lain untuk memacu apoptosis atau diferensiasi. Abnormalitas ekspresi p53 berkaitan dengan prognosis buruk dalam kasus kanker payudara.
2. Breast Cancer Suceptibility Gene 1(BRCA-1)
tetapi perubahan BRCA-1 tidak berkaitan dengan peningkatan resiko kanker payudara laki-laki. Mutasi BRCA-1 meliputi delesi, substitusi dan insersi, sering dikaitkan dengan tumor grading yang tinggi. Meskipun BRCA-1 paling sering terdeteksi pada kanker payudara familial, BRCA-1 jarang ditemukan pada kasus sporadik.
3. Breast Receptor Suceptibility Gene 2 (BRCA-2)
BRCA-2 Memiliki kesamaan dengan BRCA-1 meskipun dengan struktur yang berbeda. Resiko untuk timbulnya kanker payudara atau ovarium adalah sama dengan mutasi BRCA-1. Mutasi pada BRCA-2 tidak berkaitan erat dengan grading tumor yang tinggi. Tidak infiltrat limfosit seperti pada mutasi BRCA-1. Mutasi BRCA-2 juga berkaitan dengan insiden kanker prostat, gaster dan melanoma.
4. Retinoblastoma (Rb)
Gen Rb sebagai tumor supresor pertama yang diketemukan. Perubahan gen ini diperkirakan terjadi lebih dari separuh semua keganasan. Pada kanker payudara mutasi atau kehilangan gen Rb terdapat sebanyak 30% kasus (Osborne et al, 2004).
Dihipotesiskan bahwa reseptor estrogen (ER) dan progesteron (PgR) secara normal terdapat pada epitel payudara dan sering juga terdapat pada sel kanker payudara. Reseptor ini kemungkinan berinteraksi dengan promotor pertumbuhan seperti transforming growth factor α (berkaitan dengan epithelial growth factor), platelet-derived growth factor dan fibroblast growth factor. Mekanisme ini dipacu oleh sel kanker payudara untuk menghasilkan mekanisme autokrin pada perkembangan tumor (Kumar et al., 2007).
C. Potensi Infusa Daun Sirsak sebagai Kemopreventif Tumor Payudara yang Diinduksi DMBA
Senyawa bioaktif yang ditemukan pada daun sirsak adalah annonaceus acetogenin. Pada daun sirsak, telah ditemukan 18 jenis annonaceus acetogenin dan telah terbukti secara in vitro bersifat sitotoksik, dan memiliki kemampuan sitotoksik 10.000 kali lebih kuat daripada terapi kemoterapi. Sifatnya yang sitotoktik ini sangat berguna untuk menyerang sel kanker yang pertumbuhannya sangat cepat di dalam jaringan tubuh. Walaupun sifatnya sitotoksik, namun Annonaceus acetogenin relatif tidak menyerang sel normal. Dan hanya menyerang sel kanker secara spesifik (Chiu et al, 2003).
Salah satu senyawa yang dapat menginduksi onkogenesis kanker payudara adalah 7,12–dimethylbenz(α)antrhacene (DMBA). DMBA merupakan senyawa prokarsinogen dengan rumus empiris C20H16 dan memiliki berat molekul 256.34 g/mol. DMBA berbentuk padat, berwarna kuning kehijau-hijauan. Struktur kimia DMBA adalah 4 macam cincin aromatik yang berikatan khas struktur polisiklik aromatik hidrokarbon (PAH) dengan tiga cincin aromatik dan 2 subtituen metil. (Sigma-Aldrich 2007).
DMBA memiliki reseptor spesifik yang bernama aryl hydrocarbon receptor (AHR). Reseptor ini merupakan protein yang dapat berikatan dengan kontaminan lingkungan seperti sktruktur PAH dan derivat halogen. Ada banyak AHR di dalam tubuh manusia seperti di kelenjar reproduksi, terutama di kelenjar payudara. (Androutsopoulos et al., 2009)
DMBA merupakan senyawa karsinogen spesifik untuk eksperimental kanker payudara dan kanker kulit pada hewan percobaan, tetapi bukan merupakan karsinogen direct. Aktivitas karsinogenik dari DMBA terjadi melalui aktivasi metabolisme (biotransformasi) untuk menghasilkan karsinogenesis. Jalur metabolisme DMBA melalui aktivasi enzim sitokrom P450 membentuk proximate carcinogen dan ultimate carcinogen (Hatim, 2012).
III. METODE PENELITIAN
A. Desain Penelitian
Penelitian ini menggunakan metode eksperimental dengan pola Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 4 (empat) kelompok yang terdiri dari 1 kelompok kontrol negatif (I), 1 kelompok kontrol positif (II), dan 2 kelompok perlakuan (III dan IV) , serta 6 kali pengulangan pada masing masing kelompok.
B. Tempat dan Waktu Penelitian
C. Populasi dan Sampel
1. Populasi
Populasi adalah keseluruhan obyek penelitian atau obyek yang diteliti. Dalam penelitian ini populasi adalah tikus putih (Rattus norvegicus) betina galur Sprague Dawley yang diinduksi senyawa 7,12-dymethyilbenz(a)antracene (DMBA) sebagai model onkogenesis jaringan payudara.
Rattus norvegicus galur Sprague Dawley umumnya digunakan sebagai hewan uji dalam penelitian karena memiliki hubungan kekerabatan yang dekat dengan manusia, yakni termasuk ke dalam kelas mamalia. Oleh karena itu, tikus sering dijadikan model penelitian aplikasi kesehatan manusia karena terdapat persamaan fisiologis. Selain itu, sifat-sifat Rattus norvegicus galur Sprague Dawley telah diketahui dengan jelas, antara lain: mudah dipelihara dalam jumlah besar, cepat berkembang biak dan tidak rentan terhadap infeksi bakteri dan virus, serta cukup agresif dibandingkan dengan galur lainnya (Permana, 2010).
2. Sampel
Jumlah sampel pada penelitian ini didapatkan berdasarkan jumlah perlakuan yang dilakukan. Setiap perlakuan akan menggunakan pengulangan dengan rumus Federer (1977) untuk rancangan acak lengkap yaitu:
t � −1 ≥15
dengan t = jumlah kelompok dan n= jumlah ulangan � � −1 ≥15
4 � −1 ≥15
4� −4≥15
4� ≥19
� ≥4.75
Maka banyaknya pengulangan yang diambil pada masing-masing kelompok adalah 6 (enam) kali pengulangan. Sehingga total tikus putih betina yang dibutuhkan sebagai sampel adalah 24 (dua puluh empat) ekor.
Kriteria Inklusi
a. Tikus putih betina galus Sprague Dawley sehat (tidak tampak penampakan rambut kusam, rontok, atau botak, dan bergerak aktif)
b. Memiliki berat 100-200 gram c. Berusia sekitar 2-3 bulan
Kriteria Ekslusi
Kriteria Drop Out a. Tikus mati.
b. Tikus tampak sakit (gerakan tidak aktif, tidak mau makan, rambut kusam atau rontok).
D. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional
1. Variabel Penelitian
a. Variabel terikat: gambaran mikroskopis jaringan payudara tikus putih (Rattus norvegicus) betina yang diinduksi senyawa DMBA
b. Variabel bebas: dosis infusa daun sirsak (Annona muricata) 2. Definisi Operasional
Tabel 1. Definisi Operasional
Variabel Definisi Skala
Dosis infusa
daun sirsak
Ada 4 kelompok dengan perlakuan yang berbeda
- Kelompok I (kontrol negative)
- Kelompok II (kontrol positif) = induksi DMBA
2x20 mg/kgBB/minggu selama 4 minggu
- Kelompok III (perlakuan)= induksi DMBA 2x20
mg/kgBB/minggu selama 4 minggu + infusa
daun sirsak 0,1 g/ml/hari selama 4 minggu
- Kelompok IV (perlakuan) = induksi DMBA 2x20
mg/kgBB seminggu selama 4 minggu + infusa
daun sirsak 0,2 g/2ml/hari selama 4 minggu
Kategorik
Gambaran
Mikroskopis
payudara
Gambaran mikroskopis dilihat dengan menilai
hyperplasia pada 5 lapangan pandang pada
mikroskop, dengan perbesaran 400x, lalu
dirata-ratakan. Penilaian berdasarkan Ting et. al
(2007):
0 = normal
1 = mild hyperplasia (2-4 lapisan epitel yang
mengalami hyperplasia)
2 = severe hyperplasia (>4 lapisan epitel yang
mengalami hiperplasia)
3 = atypia
4 = ductal carcinoma in situ
5 = ductal carcinoma invasive
E. Alat dan Bahan Penelitian
Bahan
Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun sirsak (Annona muricata). Hewan percobaan yang digunakan untuk pengujian efek kemopreventif kanker payudara adalah tikus putih (Rattus norvegicus L.) betina galur Sprague Dawley. Tikus tersebut diperoleh dari Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor.
Bahan yang digunakan pada infusa daun sirsak adalah aquades. Bahan kimia yang digunakan untuk penginduksian tikus tumor payudara ialah 7,12-dymethyilbenz(a)antracene (DMBA) dan minyak jagung. Sedangkan bahan-bahan yang digunakan dalam pemeriksaan mikroskopis jaringan payudara adalah kertas tisu, formalin 10%, xylol, alkohol, alkohol absolut, alkohol 95%, alkohol 80%, alkohol 70%, parafin, Mayer’s hematoksilin,
lithium karbonat, eosin, dan aquades.
Alat
gambaran mikroskopis adalah tissue basket, gelas objek, cover glass, spidol, label, oven, cangkir logam, tissue embedding cassette, freezer, mikrotom, water bath, mikroskop cahaya dan digital electronic eyepiece camera serta satu unit komputer untuk pengambilan foto gambaran mikroskopis.
F. Prosedur Penelitian
Persiapan Hewan Percobaan
Tikus betina ditempatkan dalam kandang plastik dengan tutup terbuat dari kawat ram dan dialasi sekam, pakan berupa pelet dan air minum diberikan ad libitum. Lingkungan kandang dibuat agar tidak lembab, ventilasi yang cukup serta penyinaran yang cukup dimana lamanya terang 14 jam dan lama gelap 10 jam. Sebelum melakukan percobaan tikus diadaptasi dalam kandang selama 7 hari untuk menyeragamkan cara hidup dan makanannya,. Kesehatan tikus dipantau setiap hari, dan berat ditimbang setiap minggu.
Pembuatan Infusa Daun Sirsak
daun sehingga diperoleh 1000 ml infusa daun sirsak dengan konsentrasi 10%.
Menurut Syariefa (2011), dosis optimal bagi manusia pada tumor tahap awal (berat badan 50 kg) adalah dengan merebus 10 daun sirsak (8 gram) dalam 3 gelas (600 ml) sehingga didapatkan 1 gelas (200 ml) infusa daun sirsak. Dengan faktor konversi dosis dari manusia (70 kg) ke tikus (200gr) adalah 0,018, maka dosis yang akan diberikan kepada tikus adalah 70/50 x 8 x 0,018 = 0,2 g dalam 2 ml. Untuk perlakuan kelompok lainnya adalah dengan memberikan infusa dengan setangah dosis dengan konsentrasi yang sama (10%), yaitu 0,1 g dalam 1 ml.
Pembuatan Larutan DMBA
Pelarut yang digunakan untuk senyawa DMBA adalah corn oil, atau minyak jagung, karena DMBA larut dalam pelarut ini. Minyak jagung merupakan senyawa inert yang digunakan untuk melarutkan DMBA, tidak memiliki sifat karsinogenik
Berdasarkan penelitian oleh Meiyanto (2007) telah ditetapkan dosis serta frekuensi DMBA yang digunakan dalam penelitian ini, yaitu 20 mg/kg BB, dua kali seminggu selama 4 minggu. Selain itu disebutkan pula bahwa pemberian DMBA dengan dosis 20 mg/kg BB sebanyak 10 kali dalam 4 minggu telah dapat mengakibatkan perubahan secara mikroskopis.
20mg
1000g=
d 200g
d = 20mg
1000g× 200g
d = 4mg
kemudian 4 mg DMBA ini dilarutkan dalam 1 ml minyak jagung untuk diberikan secara per oral dengan menggunakan sonde lambung.
Penginduksian DMBA dan Infusa Daun Sirsak
Mula-mula tikus ditimbang untuk mengetahui volume larutan DMBA yang akan diberikan. Bahan yang akan digunakan adalah serbuk DMBA yang dilarutkan dengan mengunakan minyak jagung. Induksi menggunak sonde oral, dengan jadwal pemberian seminggu dua kali dengan dosis 20 mg/kgBB dengan pelarut minyak jagung. Setiap tikus dengan berat sekitar 200 gram mendapatkan kurang lebih 1 ml larutan dengan konsentrasi 4mg/ml.
Selama penginduksian senyawa DMBA, tikus setiap hari diinduksi infusa daun sirsak sebagai kemopreventif dari perkembangan senyawa DMBA tersebut. Infusa daun sirsak diberikan dengan dosis 0,1 gram dalam 1 ml/hari pada kelompok perlakuan 1 dan 0,2 gram dalam 2 ml/hari pada kelompok perlakuan 2, dengan menggunakan sonde lambung. Penginduksian DMBA dan Infusa daun sirsak dilakukan selama 4 minggu
setelah induksi. Perlakuan yang diberikan pada penelitian ini dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Kelompok Perlakuan
No Hewan Percobaan Jenis perlakuan
1 Kelompok I Pemberian Aquades 1 ml/hari setiap hari
2 Kelompok II
Pemberian DMBA 4 mg/ml 2 kali/minggu + Aquades
1 ml/hari setiap hari
3 Kelompok III
Pemberian DMBA 4 mg/ml 2 kali/minggu + Infusa
daun sirsak 0,1 g dalam 1ml setiap hari
4 Kelompok IV
Pemberian DMBA 4 mg/ml 2 kali/minggu + Infusa
daun sirsak 0,2 g dalam 2 ml setiap hari
Terminasi dan Pembuatan Preparat Jaringan Payudara Tikus
a. Fixation
1. Spesimen berupa potongan organ, dipotong secara representatif kemudian segera difiksasi dengan formalin 10% selama 3 jam.
2. Dicuci dengan air mengalir sebanyak 3−5 kali selama 15 menit. b. Trimming
Organ dikecilkan hingga ukuran ± 3 mm. c. Dehidrasi
Dehidrasi dengan :
Alkohol 75% selama 1 jam Alkohol 75% selama 1 jam Alkohol 95% selama 1jam Alkohol 95% selama 1 jam Alkohol absolut selama 1 jam Alkohol absolut selama 1 jam Alkohol absolut selama 1 jam
d. Clearing
Clearing dilakukan dengan xilol I dan II masing–masing selama 1 jam. e. Impregnansi
Impregnansi dilakukan dengan menggunakan parafin cair I dan II masing-masing selama 1 jam dalam oven suhu 65 oC.
f. Embedding
Memasukkan jaringan ke dalam cangkir logam. Lalu tuangkan paraffin cair dengan suhu 58’ C pada cangkir logam yang sudah dimasukan jaringan, dan
embedding cassette yang sudah tertempel jaringan dan parafin dikeluarkan dari cangkir logam. Blok paraffin siap dipotong dengan mikrotom.
g. Cutting
1. Pemotongan dilakukan pada ruangan dingin.
2. Sebelum memotong, blok didinginkan terlebih dahulu di lemari es
3. Dilakukan pemotongan kasar, lalu dilanjutkan dengan pemotongan halus dengan ketebalan 4−5 mikron. Pemotongan dilakukan menggunakan rotary
microtome dengan disposable knife.
4. Lembaran jaringan dipindahkan ke dalam water bath pada suhu 60 0C selama beberapa detik sampai mengembang sempurna.
5. Dengan gerakkan menyendok, lembaran jaringan tersebut diambil dengan slide bersih dan ditempatkan di tengah atau pada sepertiga atas atau bawah. 6. Slide yang berisi jaringan ditempatkan pada inkubator (Suhu 37 0C) selama
24 jam sampai jaringan melekat sempurna.
h. Straining (Pewarnaan) dengan Prosedur Pulasan Meyer Hematoksilin–Eosin: Setelah jaringan melekat sempurna pada slide, dipilih slide yang terbaik selanjutnya secara berurutan memasukkan ke dalam zat kimia di bawah ini dengan waktu sebagai berikut.
1. Dilakukan deparafinisasi dalam: Larutan xylol I selama 1 menit Larutan xylol II selama 1 menit
2. Hydrasi dalam:
Alkohol 70% selama 1 menit Aquades selama 1 menit
3. Pulasan inti dibuat dengan menggunakan: Meyer hematoksilin selama 5-7 menit Air mengalir selama 5 menit
Li CO3 selama 3 menit
Alkohol 95% sebanyak 10 celupan Eosin selama maksimal 3 menit
4. Lanjutkan dehidrasi dengan menggunakan Alkohol 80% sebanyak 10 celupan Alkohol 90% sebanyak 10 celupan Alkohol absolut sebanyak 10 celupan
5. Penjernihan:
Xylol I selama 5 menit Xylol II selama 5 menit Xylol III selama 5 menit
i. Mounting dengan entelan lalu tutup dengan deck glass
Setelah pewarnaan selesai, slide ditempatkan di atas kertas tisu pada tempat datar, ditetesi dengan bahan mounting yaitu kanada balsam dan ditutup dengan deck glass, cegah janan sampai terbentuk gelembung udara.
Pengamatan Jaringan Payudara Tikus
dengan menggunakan mikroskop cahaya perbesaran 400 kali. Gambaran mikroskopis yang diamati adalah epitel kelenjar jaringan payudara tikus dalam 5 lapang pandang. Hal ini ditujukan untuk melihat sejauh mana tingkat perubahan yang terjadi pada epitel kelenjar payudara tikus yang diinduksi DMBA secara oral dan infusa daun sirsak selama 4 minggu. Penilaian epitel kelenjar dilakukan dengan menggunakan grade berdasarkan Ting et al. (2007):
0 = normal
1 = mild hyperplasia (2-4 lapisan epitel yang mengalami hyperplasia) 2 = severe hyperplasia (>4 lapisan epitel yang mengalami hiperplasia) 3 = atypia
4 = ductal carcinoma in situ 5 = ductal carcinoma invasive
G. Pengolahan dan Analisis Data
1. Uji Normaliatas Data
Analisis statistik dilakukan dengan bantuan program statistik. Hasil penelitian akan dianalisi apakah memiliki distribusi normal atau tidak secara statistik dengan uji normalitas Shapiro-Wilk karena jumlah sampel kurang dari 50.
2. Uji Parametrik
3. Uji Post Hoc
Jika pada uji one way ANOVA menghasilkan nilai p<0,05 (hipotesis dianggap bermakna) maka akan dilanjutkan dengan melakukan analisis post-hoc LSD untuk mengetahui perbedaan antar kelompok yang lebih terinci. Sedangkan Alat untuk melakukan analisis post-hoc untuk uji Kruskal–Wallis adalah dengan uji Mann–Whitney.
H. Diagram Alir
Gambar 3. Diagram Alir Penelitian
I. Etika Penelitian
V. SIMPULAN DAN SARAN
A. Simpulan
1. Infusa daun sirsak memiliki potensi sebagai agen kemopreventif pada perubahan epitel duktus payudara tikus yang diinduksi DMBA dilihat dari gambaran mikroskopisnya.
2. Infusa daun sirsak dengan dosis 0,1g dalam 1 ml memiliki efek yang lebih baik dalam perubahan grade epitel duktus payudara dibandingkan dosis 0,2g dalam 2 ml.
B. Saran
Peneliti lain disarankan untuk:
1. Meneliti bahan aktif (senyawa) murni dan konsentrasinya pada infusa daun sirsak.
2. Meneliti lebih lanjut mengenai dosis optimum dan toksisitas infusa daun sirsak sebagai agen kemopreventif onkogenesis payudara
[Anonim]. 2009a. Financial and Legal Impact Of Cancer. (Internet). Diunduh dari http://www.mdanderson.org/patient-and-cancer-information/ancerinformation/ cancer-topics/survivorship/financial-impacts/index.html. Diakses pada tanggal 27 Juli 2013.
[Anonim]. 2009b. Social & Emotional Impacts Of Cancer. (Internet). Diunduh dari http://www.mdanderson.org/patient-and-cancerinformation/cancerinformation/ cancer-topics/survivorship/social-impacts/index.html. Diakses pada tanggal 27 Juli 2013.
Androutsopoulos, VP., Tsatsakis, AM., Spandidos, DA. 2009. Cytochrome P450 CYP1A1: Wider Roles in Cancer Progression and Prevention. BMC Cancer. 9:187.
Baskar, R., Rajeswari, V., Kumar, TS. 2007. In Vitro Antioxidant Studies in Leaves of Annona Species. Indian Journal of Experimental Biology. 45:480-485.
Broeckel, JA., Jacobsen, PB., Balducci, L., Horton, J., Lyman, GH. 2000. Quality Of Life After Adjuvant Chemotherapy For Breast Cancer. Breast Cancer Res Treat. 62:41-150.
Chang, LC., Kinghorn, AD., 2001. Flavonoid as Chemopreventive Agent, Boiactive Compound From Natural Sources, Isolation, Characterization And Biological Properties. New York: Tailor & Friends. pp. 161-168.
Chirikos, TN. 2001. Economic Impact Of The Growing Population Of Breast Cancer Survivors. (Internet). Diunduh dari http://www.medscape.com/viewarticle/ 409044_2. Diakses pada tanggal 27 Juli 2013.
Chiu, HF., Chih, TT., Hsian, YM., Tseng, CH., Wu, MJ., Wu, YC. 2003. Bullatacin, a potent antitumor Annonaceous acetogenin, induces apoptosis through a reduction of intracellular cAMP and cGMP levels in human hepatoma 2.2.15 cells. Biochemical Pharmacology. 65(3):319-327.
Bombay Calcuta: Oxford and IBH Publishing Co.
Hadi, SM., Asad, SF., Singh, S., Ahmad, A., Khan, NU. 2003. A Putative Mechanism for Anticancer and Apoptosis Inducing Properties of Plant Derived Polyphenolic Antioxidants. In Recent Progress In Medicinal Plants (Majumdar DK, Govil JN And Singh VK Eds.). Studium Press. pp. 83.
Hakkak. 2005. Obesity Promotes 7,12-Dimethylbenz(a)anthracene-Induced Mammary Tumor Development in Female Zucker Rats. Breast Canc Res.7: 627-633. Hatim, NB. 2012. Aktivitas Antikanker Ekstrak Etanol Daun Surian (Toona sinensis)
pada Tikus Betina Sprague Dawley yang Diinduksi 7,12-dimetilbenz(a)antrasena. (Skripsi). Departemen Biokimia. Fakultas Matematika Dan Ilmu Pengetahuan Alam. Institut Pertanian Bogor.
Herliana, E., Rifai, N. 2011. Khasiat dan Manfaat Daun Sirsak Menumpas Kanker. Jakarta: Mata Elang Media. hlm. 12-16.
International Agency Research on Cancer. 2013. Globocan 2008, Fast Stats. Section of Cancer Information. (Internet). Diunduh dari http://globocan.iarc.fr/factsheets/ populations/factsheet.asp?uno=900. Diakses pada tanggal 26 Juli 2013.
Juan, R. 2004. Ackerman’s Surgical Pathology. Ed. 6. Mosby. 52-3. pp. 2098-2099. Junqueira, LC., Carneiro, J. 2007. Basic Histology Text and Atlas: Female Reproductive
System. Ed 11. United States of America: McGraw Hill. pp. 447-450.
Kakizoe, T., 2003. Chemoprevention of Cancer Focusing On Cinical Trial. Japan Journal Clinical Oncol. 33(9):421-442.
Kumar, V., Robbins, SL., Cotran, RS. 2007. Buku Ajar Patologi Anatomi. Vol 2 Ed 7. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC. hlm. 788-802.
Lacey, JV. 2009. Breast Cancer Epidemiology According To Recognized Breast Cancer Risk Factors In The Prostate, Lung, Colorectal And Ovarian (PLCO) Cancer Screening Trial Cohort. BMC Cancer. 9:84.
Lippincott Williams & Wilkins. pp. 567-572.
Osborne, C., Wilson, P., Tripathy, D. 2004. Oncogenes and tumor suppressor genes in breast cancer: potential diagnostic and therapeutic applications. The Oncologist. 9(4):361-77.
Parkin, DM., Bray, F., Ferlay, J., Pisani. P. 2002. Global Cancer Statics. CA Cancer Jounal Clin. 55:74-108.
Permana, Zurida. 2010. Konsumsi, Kecernaan dan Performa Tikus Putih (Rattus norvegicus) yang Disuplementasi Biomineral Cairan Rumen dalam Ransum. (Skripsi). Program Studi Ilmu Nutrisi dan Makanan Ternak, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor.
Ren, W., Qiao, Z., Wang, H., Zhu, L., Zhang, L. 2003. Flavonoids: Promising Anticancer Agents. Medicinal Research Review. 23(4):519-534.
Retnani, V. 2011. Pengaruh Suplementasi Ekstrak Daun Annona muricata terhadap Kejadian Displasia Epitel Kelenjar Payudara Tikus Sprague Dawley yang Diinduksi 7, 12 Dimethylbenz[a]anthracene. (Skripsi). Program Pendidikan Sarjana Kedokteran Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro.
Rianes, S. 2012. Karakterisasi Simplisia dan Skrining Fitokimia Serta Uji Aktivitas Antioksidan Jus Buah Sirsak dan Ekstrak Etanol Daun Sirsak (Annona muricata L.). (Skripsi). Program Studi Sarjana Farmasi. Fakultas Farmasi. Universitas Sumatera Utara. Medan.
Santoso, S. 2003. Perkembangan Obat Tradisional Dalam Ilmu Kedokteran di Indonesia dan Upaya Pengembangannya Sebagai Obat Alternatif. Jakarta: FKUI.
Schwab, M. 2008. Encyclopedia of Cancer: 2nd Edition. New York: Springer. pp 587. Sigma-Aldrich. 2007. 7,12-Dimethylbenz[a]anthracene. (Internet). Diunduh dari
http://www. sigmaaldrich.com. Diakses pada tanggal 3 Agustus 2013.
Singletary, K., Macdomald, C., Tovinelli, M., Fisher, C., Wallig, M. 1998. Effect of The Diketones Diferuloylmethane (Curcumin) and Dibenzoilmethane on Rat
Buku Kedokteran EGC. hlm 367-374.
Sugianto, SB., Meiyanto, E., Nugroho, AE., Jenie, UA. 2003. Aktivitas Antikarsinogenik Senyawa yang Berasal dari Tumbuhan. Majalah Farmasi Indonesia. 14(4): 216-225.
Suranto, A. 2011. Dahsyatnya Sirsak Tumpas Penyakit. Jakarta: Pustaka Bunda. hlm. 4-15.
Syariefa, E. 2011. Daun Sirsak: Olah Tepat dan Dosis Aman. Trubus. 2(498):10-27. Ting, AY., Kimler, BF., Fabian, CJ., Petroff, BK. 2007. Characterization of A
Preclinical Model of Simultaneous Breast and Ovarian Cancer Progression. Carcinogenesis. 28(1):130–135.
Van De Graaff, K. 2002. Human Anatomy. Ed 6. United States Of America: McGraw-Hill. pp. 720-730.
Wibowo, EA., Sriningsih, Wuyung, PE., Ranasasmita, R. 2010. The Influence of DMBA (7,12-dimethylbenz-[a]anthracene) Regimen In The Development of Mammae Carcinogenesis on Sprague Dawley Female Rat. Indonesian Journal of Cancer Chemoprevention. I(1):60-66.
World Health Organization. 2013 Breast Cancer: Prevention and Control. (Internet). Diunduh dari http://www.who.int/cancer/detection/breastcancer/en/. Diakses pada tanggal 26 Juli 2013.
World Health Organization. 2013. Cancer. (Internet). Diunduh dari http://www.who.int/ mediacentre/factsheets/fs297/en/. Diakses pada tanggal 26 Juli 2013.
