Analisis komponen kimia fraksi minyak atsiri daun sirih (piper batle Linn.) dan daun uji aktivitas antibakteri terhadap beberapa jenis bakteri gram negatif

(1)

ANALISIS KOMPONEN KIMIA FRAKSI MINYAK ATSIRI

DAUN SIRIH (Piper bettle Linn.) DAN UJI AKTIVITAS

ANTIBAKTERI TERHADAP BEBERAPA JENIS BAKTERI

GRAM NEGATIF

Skripsi Ini Diajukan Sebagai Salah Satu Syarat Untuk Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Far)

Oleh ERNY FITRIANA NIM : 106102003402

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH

(2)

ii

LEMBAR PERSETUJUAN SKRIPSI

Nama : ERNY FITRIANA NIM : 106102003402

Judul : ANALISIS KOMPONEN KIMIA FRAKSI MINYAK ATSIRI DAUN SIRIH (Piper bettle Linn: PIPERACEAE) DAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI TERHADAP BEBERAPA JENIS BAKTERI GRAM NEGATIF

Disetujui Oleh :

Pembimbing I Pembimbing II

Dr. Andria Agusta Drs. M. Yanis Musdja, M.Sc, Apt.

NIP 196908161994031003 NIP 195601069851010001

Mengetahui,

Ketua Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universtas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta

(3)

iii

LEMBAR PENGESAHAN SKRIPSI

Skripsi dengan judul

ANALISIS KOMPONEN KIMIA FRAKSI MINYAK ATSIRI DAUN SIRIH (Piper bettle Linn.) DAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI TERHADAP

BEBERAPA JENIS BAKTERI GRAM NEGATIF

Telah disetujui, diperiksa dan dipertahankan dihadapan tim penguji oleh

ERNY FITRIANA 4. Anggota Penguji III Farida Sulistiawati, M. Si, Apt. ………

Mengetahui,

Dekan Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Prof. DR. (hc). Dr. M.K. Tadjudin, Sp. And

(4)

iv

LEMBAR PERNYATAAN

Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi yang berjudul:

ANALISIS KOMPONEN KIMIA FRAKSI MINYAK ATSIRI DAUN SIRIH

(Piper bettle Linn.) DAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI TERHADAP

Adalah karya sendiri dan belum pernah diajukan dalam bentuk apapun kepada

perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya

yang diterbitkan maupun yang tidak diterbitkan dari penulis lain, telah disebutkan

dalam teks dan dicantumkan dalam daftar pustaka.

(5)

v

Halaman Persembahan

!" #$ %%&

"

"'( "'("'(

"'( ) *

" ' " ' " ' " '

(6)

vi

ABSTRAK

ANALISIS KOMPONEN KIMIA FRAKSI MINYAK ATSIRI DAUN SIRIH (Piper bettle Linn) DAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI TERHADAP

Sirih (Piper betle Linn.) merupakan salah satu jenis tanaman dari famili Piperaceae yang sering digunakan untuk menyirih. Fraksi minyak atsiri daun sirih diperoleh dengan cara destilasi uap air dan difraksinasi berdasarkan perbedaan waktu penyulingan. Analisis fraksi minyak atsiri dengan GC-MS dari fraksi jam ke 1, 2,4, dan 6 menunjukkan adanya 4 komponen kimia utama yang diduga berperan pada aktivitas antibakteri yaitu kavibetol, kariofilen, patcouli alkohol, dan 4-alil-1,2-diasetoksibenzene. Fraksi minyak atsiri daun sirih telah diuji aktivitas antibakteri dan mekanisme penghambatan terhadap beberapa jenis bakteri gram negatif. Aktivitas antibakteri minyak atsiri daun sirih menggunakan difusi cakram menunjukkan bahwa ke-4 fraksi minyak atsiri daun sirih aktif terhadap Escherichia coli dan Proteus vulgaris, namun tidak menunjukkan aktivitas terhadap Pseudomonas aeruginosa. Evaluasi lebih lanjut aktivitas antibakteri minyak atsiri daun sirih terhadap Escherchia coli dengan metode

microdillution menunjukkan nilai MIC sebesar 0,5% (F1), 0,25% (F2), 0,125%

(F3), dan 0,0625% (F4). Mekanisme penghambatan pertumbuhan bakteri oleh fraksi minyak atsiri daun sirih terjadi melalui pengerusakan dinding sel mikroba uji setelah perlakuan 1 MIC dan 2 MIC.

Kata kunci : Piper betle, minyak atsiri, fraksi, antibakteri, bakteri gram negatif,

(7)

vii

ABSTRACT

ANALYSIS OF CHEMICAL COMPONENTS OF ESSENTIAL OIL FRACTIONS OF BETLE LEAVES (Piper betle Linn.) AND ANTI-BACTERIAL ACTIVITY TEST AGAINST SOME GRAM NEGATIVE

BACTERIA

Beetle (Piper betle Linn) is a plant belongs to Piperaceae that often used in beetle chewing. Essential oils fractions of beetle leaves was given by steam and water distilation and fractionated based on time periods. Analysis of essential oils by GC-MS showed that 4 main chemical components were chavibetol, caryophyllene, patchouli alcohol and 4-allyl-1,2-diacetoxybenzene respectively. All of these main chemical constituents were propose to responsible for its antibacterial activity. The anti-bacterial activity of essential oils of beetle leaves was evaluate with a disc diffusion method. The results showed all of essential oil fractions tested active against Escherichia coli and Proteus vulgaris, but not active to Pseudomonas aeruginosa. The MIC values for all of essential oil fractions were 0,5% (F1), 0,25% (F2), 0,125% (F3), and 0,0625% (F4) respectively. Inhibition mechanism their activity was indicate through microbial cell walls vandalism test after treatment 1 MIC and 2 MIC of the oils.

(8)

viii

KATA PENGANTAR

Bismillahirrahmanirrahim.

Puji syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT atas segala

rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penulisan

skripsi dengan judul “Analisis Komponen Kimia Fraksi Minyak Atsiri

Daun Sirih (Piper Bettle Linn.) Dan Uji Aktivitas Antibakteri Terhadap

Beberapa Jenis Bakteri Gram Negatif.” Skripsi ini disusun sebagai salah

satu syarat untuk menyelesaikan program pendidikan tingkat sarjana Strata

1 (S1) pada program studi Farmasi, Fakultas kedokteran dan Ilmu

Kesehatan, Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

Mudah-mudahan skripsi ini bermanfaat kepada siapa saja terutama yang

membacanya. Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih

kepada Bapak Dr. Andria Agusta dan Bapak Drs. M. Yanis Musdja, M.Sc,

Apt. sebagai pembimbing yang sangat baik dan dengan sabar yang telah

memberikan pengarahan, bimbingan, motivasi, nasehat, dan petunjuk

selama penyusunan skripsi ini berlangsung.

Penulis juga mengucapkan terima kasih yang mendalam kepada :

1. Bapak Prof. Dr. (hc). Dr, M. K Tadjudin, Sp. And, selaku Dekan dan

Bapak Drs. Achmad Ghalib, MA selaku Pembantu Dekan FKIK UIN

Syarif Hidayatullah Jakarta yang telah memberikan kesempatan kepada

penulis atas jasa dan harapannya untuk menyelesaikan pendidikan di

Progam Studi Farmasi.

2. Bapak Drs. M. Yanis Musdja M. Sc, Apt sebagai ketua jurusan Farmasi

serta semua karyawan Jurusan Farmasi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

yang telah memberikan kesempatan dan dukungannya kepada penulis

dalam menyelesaikan penyusunan skripsi.

3. Bapak Ibu dosen yang penulis cintai dan hormati yang telah memberikan

ilmu, motivasi, nasehat serta kejujuran kepada penulis sehingga penulis

(9)

ix

4. Bapak Dr. Eko Baroto Walujo, APU sebagai kepala bidang botani, LIPI

Cibinong yang telah membantu memberikan izin untuk melakukan

penelitian di Laboratorium Fitokimia, Puslit biologi, LIPI Cibinong.

5. Ibu Dr. Praptiwi, M. Agr, Dr. Yuliasri Jamal, M. Sc, Ahmad Fathoni dan

Andi Saptaji Kamal dari Laboratorium Fitokimia, Bidang Botani, LIPI

Cibinong yang telah membantu penulis dalam mengarahkan serta

menuntun untuk melakukan penelitian.

6. Bapak Dedi Rosadi dan Bapak Dedi Kustiwa dari Balitro yang telah

menyediakan sampel dan membantu dalam pelaksanaan penelitian.

7. Ayahanda, Ade Legiman dan Ibunda, Juniyati yang selalu memberikan

doa, semangat, dukungan, perhatian dan kasih sayang selama penulis

menyelesaikan skripsi ini. Serta adik, Edwin Rizki Nurdiansyah dan

Kakak, Mahmudin, yang selalu memberikan motivasi dan semangat

selama menyelesaikan skripsi ini.

8. Febriyati, Mustikaning Ayu HP, Nuryatni, Fika Fauziah, Nurul Gustiari,

Lidya Pratiwi A, Nurul Farihah, Ulfah Sadiah yang telah membantu dan

menemani di Laboratorium Botani untuk menyelesaikan penelitian.

9. Rahmania Hidayah, Fiestyo Alim, Nida Nunabila, dan Aminah

Nurhadiyah yang selalu memberikan semangat dan motivasi.

10.Semua teman-teman Farmasi UIN seluruh angkatan terutama Farmasi

angkatan 2006 yang memberikan senyuman, pertemanan, dukungan,

bantuan, semangat, serta doa hingga akhir penulisan skripsi ini.

Untuk menyempurnakan skripsi ini, penulis menerima segala saran

dan kritik yang membangun. Semoga penelitian ini dapat bermanfaat bagi

ilmu pengetahuan dan kesehatan masyarakat

Jakarta, September 2010

(10)

x

DAFTAR ISI

Lembar Persetujuan Skripsi ... ii

Lembar Pengesahan Skripsi... iii

Lembar Pernyataan ... iv

BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang ... 1

2.6.1 Gas Chromatography-Mass Spectrophotometer (GC-MS) ………. 20

2.6.2 Spectrophotometry UltraViolet-Visible (UV-Vis) ….. . 21

2.6.3 Atomic Absorption Spectrophotometry (AAS) ……… 22

2.6.4 Scanning Electron Microscope ………... 22

(11)

xi

BAB IV METODOLOGI PENELITIAN

4.1 Waktu dan Tempat Penelitian ... 25

4.3.3 Penentuan Komponen Kimia Minyak Atsiri Daun Sirih 27 4.3.4 Penentuan Aktivitas Antibakteri Minyak Atsiri ... 28

4.3.5 Analisis Kebocoran Protein dan Asam nukleat ... 32

4.3.6 Analisis Kebocoran Ion Logam ... 32

4.3.7 Analisis Perubahan Morfologi Sel ... 33

BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN 5.1 Hasil Penelitian ... 35

5.1.1 Isolasi dan Identifikasi Komponen Minyak Atsiri Daun Sirih ... 35

5.1.2 Pengujian Aktivitas Antibakteri Fraksi Minyak Atsiri Daun Sirih ... 42

5.1.3 Penentuan MIC Fraksi Minyak Atsiri Daun Sirih Terhadap Beberapa Jenis Bakteri Gram Negatif ... 43

5.1.4 Analisis Protein dan Asam Nukleat ... 44

5.1.5 Analisis Ion Logam Ca2+ dan K+ ... 46

5.1.6 Perubahan Morfologi Sel Escherichia coli ... 47

5.2 Pembahasan ... 48

BAB VI KESIMPULAN DAN SARAN 6.1 Kesimpulan ... 56

6.2 Saran ... 57

DAFTAR PUSTAKA ... 58

(12)

xii

DAFTAR TABEL

5.1. Perbandingan komponen kimia fraksi minyak atsiri daun sirih ... 39

5.2. Penggolongan komponen kimia antar fraksi minyak atsiri daun sirih... ... 41

5.3. Aktivitas fraksi minyak atsiri daun sirih terhadap 3 bakteri gram negatif

pada konsentrasi 50% ... 42

5.4. Penentuan nilai MIC fraksi minyak atsiri daun sirih terhadap

(13)

xiii

DAFTAR GAMBAR

5.1. Daun sirih (Piper betle Linn.) ... 35

5.2. Kromatogram fraksi minyak atsiri daun sirih ... 38

5.3.Tingkat kebocoran protein dan asam nukleat dari Escherichia coli

pada beberapa konsentrasi fraksi minyak atsiri daun sirih ... 45

5.4.Tingkat kebocoran ion-ion dari Escherchia coli pada pada

beberapa konsentrasi fraksi minyak atsri daun sirih ... 46

5.5. Morfologi sel Escherichia coli kontrol (a) ... 47

Sel Escherichia coli dengan perlakuan minyak atsiri 1 MIC (b)

(14)

xiv

DAFTAR LAMPIRAN

1. Hasil determinasi daun sirih (Piper betle) ... 62

2. Perhitungan Rendemen Minyak Atsiri Daun Sirih ... 63

3. Rumus Struktur Komponen Mayor Minyak Atsiri Daun Sirih ... 63

4. Komponen Medium ... 64

5. Skema kerja ... 65

6. Hasil uji sensitivitas fraksi minyak atsiri daun sirih terhadap beberapa jenis bakteri gram negatif ... 71

7. Perhitungan Berbagai Konsentrasi MIC ... 72

8. Pertumbuhan bakteri Escherichia coli terhadap fraksi minyak atsiri daun sirih dengan metode platting ... 73

9. Perhitungan Konsentrasi MIC (Fraksi jam ke-1) untuk SEM ... 74

10. Analisis kebocoran protein dan asam nukleat bakteri Escherichia coli .... 75

11. Analisis kebocoran ion-ion logam Ca2+ dan K+ bakteri Escherichia coli .. 75

12. Kadar Ion Ca 2+ dan K+ dengan Menggunakan AAS ... 76

13. Instrumen yang Digunakan dalam Penelitian ... 78

(15)

62

(16)

63

Lampiran 2. Perhitungan Rendemen Minyak Atsiri Daun Sirih

Berat Jenis Minyak Atsiri Daun Sirih = 0,976

Berat Simplisia Daun Sirih = 30 kg

• Jam ke-1 = 18,8 ml x 0,976 =18,349 gr

=18,349 gr x 100% = 0,061% 30000 gr

• Jam ke-2 = 10,3 ml x 0,976 = 10,053 gr

= 10,053 gr x 100% = 0,034% 30000 gr

• Jam ke-4 = 8,3 ml x 0,976 = 8,101 gr

= 8,101 gr x 100% = 0,027% 30000 gr

• Jam ke-6 = 4,6 ml x 0,976 = 4,490 gr

= 4,490 gr x 100% = 0,015% 30000 gr

Lampiran 3. Rumus Struktur Komponen Mayor Minyak Atsiri Daun Sirih

(17)

64

Kariofilen Fenol, (4-(2-profenil)-asetat)

Lampiran 4. Komponen Medium

1. NA (Nutrient Agar)

• Agar 15 gram

• Gelatin Pepton 5 gram

• Beef Extract 3 gram

2. MHA (Mueller Hinton Agar)

• Beef Extract Powder 2 gram

• Acid Digest of Casein 17,5 gram

• Starch 1,5 gram

• Agar 17 gram

3. MHB (Muelle Hinton Broth)

• Casein Acid Hydrosylate 17,5 gram

• Beef Extract 2 gram

(18)

65

Lampiran 5. Skema Kerja

a. Isolasi Minyak Atsiri Daun Sirih dengan Destilasi Uap dan Air

b. Peremajaan Bakteri Uji

Daun sirih segar ditimbang ± 42 kg

Diperoleh minyak atsiri

Stok bakteri uji Didestilasi uap dan air

selama 6 jam

Penampungan destilat pada

jam ke-1, ke-2, ke-4 dan ke-6

Diperoleh destilat Disortasi basah dan dirajang

Diinokulasi pada NA

Identifikasi komponen kimia fraksi

minyak atsiri dengan GCMS Ditambahkan NaSO4 anhidrat

Diinkubasi selama 24

(19)

66

c. Pembuatan Suspensi Bakteri Uji

Stok biakan bakteri pada agar

NA umur 24 jam

Diambil 1 ose disuspensikan ke

dalam 5 ml Mueller Hinton broth

Dishaker 18 jam, suhu 37 ºC,

100 rpm

Suspensi bakteri digunakan

untuk uji difusi agar

Suspensi bakteri digunakan

untuk penentuan MIC Diencerkan hingga diperoleh

105 sel bakteri/ml

Dihitung jumlah bakteri dengan

(20)

67

Lampiran 5. Lanjutan

d. Penentuan Diameter Daerah Hambat Bakteri

Diratakan dengan batang spreader Media MHA cair

Dituang kedalam cawan petri dan

dibiarkan memadat

Diinolukasikan dengan 0,1 ml suspensi

bakteri

Diletakkan kertas cakram yang telah

ditetesi 10 µl larutan uji dan dibiarkan

mengering sebelum diletakkan

Diinkubasi pada suhu 37 °C selama 24

Diukur daerah bening yang terbentuk

(21)

68

e. Penentuan MIC

Kontrol

Ditambah larutan uji Ditambah suspensi

bakteri

Medium MHB dalam microplate

Media +

inokulum

+ pelarut Media +

inokulum Media Media +

pelarut

Diinkubasi pada suhu 37 °C selama 24

Diplating ke agar pada cawan petri dan di

inkubasi 18 jam

Diamati pertumbuhan yang terjadi

(22)

69

f. Analisis Kebocoran Protein, Asam Nukleat dan Ion Logam

Diambil 10 ml Suspensi bakteri

dalam media MHB umur 24 jam

Sentrifuge dingin, kecepatan

3500 rpm, 20 menit

Pellet disuspensikan dalam

buffer fosfat pH 7,4

Filtrat dibuang

KONTROL, tanpa

minyak atsiri Tambahkan minyak atsiri daun

sirih dosis 1 MIC dan 2 MIC

Diinkubasi shaker 24 jam, 37 ºC

Cairan supernatan diambil dan

disaring

Suspensi disentrifuge, 15 menit,

kecepatan 3500 rpm

Pellet digunakan

untuk analisis

morfologi sel

Diukur absorban λ_{260 nm dan}

280 nm dengan spektro UV

Diukur kadar ion K dan Ca

(23)

70

g. Analisis Perubahan Morfologi Sel

Pellet direndam dengan tannin acid 2% dalam buffer kakodilate

selama 12 jam

Disentrifuse, pellet dicuci 2 kali dengan etanol 50 %, dibiarkan

selama 10 menit dan disentrifuse

Disentrifuse, pellet direndam dalam 1 % larutan osmium

tetraoksida selama 1 jam.

Pellet bakteri dari analisis sebelumnya direndam dalam

glutaraldehid selama 4 jam, disentrifuse

Slip gelas dilapisi dengan emas dalam kondisi vakum dan diamati

dengan mikroskop electron seri JSM-5310LV

Disentrifuse, pellet dicuci 2 kali dengan larutan buffer kakodilate

Endapan sel ditambah sedikit tert-butanol, dioleskan pada slip

gelas, kemudian divakum dan disimpan pada suhu -20 °C selama

12 jam

Dicuci dengan etanol 70 %, 80 % & 95 %, masing-masing selama

10 menit, disentrifuse, dicuci dengan etanol absolut 2 kali dan tert

(24)

71

Lampiran 6. Hasil uji sensitivitas fraksi minyak atsiri daun sirih terhadap

beberapa jenis bakteri gram negatif.

No Bakteri Uji Hasil Uji Difusi Minyak Atsiri Daun Sirih

1 Escherichia coli

2 Proteus vulgaris

3 Pseudomonas aeruginosa

Ket : F1: Fraksi jam ke-1

F2: Fraksi jam ke-2

F3: Fraksi jam ke-4

F4: Fraksi jam ke-6

(25)

72

Lampiran 7. Perhitungan berbagai konsentrasi MIC

Larutan induk 5 x 5 = 25%

5% → _{25/5 = 5 ; 250/5 = 50 µl}

50 µl minyak ; 100 µl media ; 100 µl inokulum

2,5% → _{25/2,5 = 10 µl ; 250/10 = 25 µl}

1% → _{25/1 = 25 µl ; 250/25 = 10 µl}

0,5% → _{25/0,5 = 50 ; 250/50 = 5 µl}

0,25% → _{25/0,25 = 100 ; 250/100 = 2,5 µl}

2,5 µl minyak ; 147,5 µl media ; 100 µl inokulum

0,125% → _{25/0,125 = 200 ; 250/200 = 1,3 µl}

1,3 µl minyak ; 148,7 µl ; 100 µl inokulum

0,0625% → _{25/0,0625 = 400 ; 250/400 = 0,63 µl}

0,63 µl minyak ; 149,37 µl media ; 100 µl inokulum

0,03125% → _{25/0,03125 = 800 ; 250/800 = 0,31 µl}

(26)

73

Lampiran 8. Pertumbuhan bakteri Escherichia coli terhadap fraksi minyak

atsiri daun sirih dengan metode platting.

No Bakteri Uji Hasil MIC Fraksi Minyak Atsiri Daun Sirih 1 Escherichia coli

Fraksi jam ke-1 Fraksi jam ke-2

Fraksi jam ke-4 Fraksi jam ke-6 2 Proteus vulgaris

(27)

74

3 Pseudomonas

aeruginosa

Lampiran 9. Perhitungan Konsentrasi MIC (Fraksi jam ke-1) untuk SEM

Larutan Induk = 5 % x 10 ml = 100 % x v

0,5 ml = v

1 MIC → _{0,5% x 10 ml = 5 x v}

1 ml = v →_{Buffer Posfat = 9 ml}

2 MIC → _{1 % x 10 ml = 5 x v}

(28)

75

Lampiran 10. Analisis kebocoran protein dan asam nukleat bakteri

Escherichia coli

Perlakuan Pembacaan Absorbansi

260 nm 280 nm

Kontrol 0,848 1.023

1 MIC 1,896 2,000

2 MIC 2,197 2,301

Lampiran 11. Analisis kebocoran ion-ion logam Ca2+ dan K+ bakteri

Escherichia coli

Ion Perlakuan Konsentrasi (ppm)

K+ Kontrol 78

1 MIC 88

2 MIC 106,75

Ca2+ Kontrol 3,13

1 MIC 28

(29)

76

Lampiran 12. Data Kadar Ion Ca2+ dan K+ Dengan Menggunakan AAS

(30)

77

Keterangan : a : E. coli Kontrol b : E. coli 1 MIC c : E. coli 2 MIC

a

(31)

78

Lampiran 13. Instrumen yang Digunakan dalam Penelitian

Destilasi Uap dan Air Ketel Destilasi Uap dan Air

Ketel Destilasi Uap dan Air

(32)

79

Inkubator Mikroplate

Autoklaf Shaker Inkubator

(33)

80

Atomic Absorbtion Spectrofotometric (AAS)

Ion Coater