BAB III
Kromatografi Lapis(an) Tipis (KLT)
Thin Layer Chromatography (TLC)
Kromatografi lapis tipis adalah salah satu contoh kromatografi planar. Fase diamnya (Stationary Phase) berbentuk lapisan tipis yang melekat pada gelas/kaca, plastik, aluminium. Sedangkan fase geraknya (Mobile Phase)
berupa cairan atau campuran cairan, biasanya pelarut organi dan kadang-kadang juga air. Fase diam yang berupa lapisan tipis ini dapat dibuat dengan membentangkan /meratakan fase diam (adsorbent=penjerap=sorbent) diatas plat/lempeng kaca plastik ataupun aluminium.
Fase diam
Sifat fase diam yang satu dengan fase diam yang lain berbeda karena strukturnya, ukurannya, kemurniannya, zat tambahan sebagai pengikat dll. Fasa diam yang digunakan TLC tidak sama dengan yang digunakan untuk kromatografi kolom, terutama karena ukuran dan zat yang ditambahkan. Fase diam dijual dengan spesifikasi tertentu, iaitu ukuran (diameter) dalam mesh atau j^m dan untuk kegunaannya (mis: untuk TLC atau kromatografi kolom). Beberapa fase diam yang banyak dijual dipasaran:
Silika gel
Silika gel merupakan fase diam yang sering digunakan pada TLC. Dalam perdagangan dijual dengan variasi ukuran (diameter) 10-40µm. Makin kecil diameter akan makin lambat kecepatan alir fase geraknya dengan demikian mempengaruhi kualitas pemisahan. Luas permukaan silica gel bervariasi dari 300-1000 m2/g. Bersifat higroskopis, pada kelembaban relatif 45-75% dapat mengikat air 7-20%. Macam-macam silka gel yang dijual dipasaran:
Silika gel dengan pengikat dan indicator flouresensi. Jenis silica gel ini sama seperti silika gel diatas dengan tambahan zat berfluoresensi bila diperiksa dibawah lampu UV A, panjang atau pendek. Sebagai indicator digunakan timah-kadmium sulfida atau mangan-timah silikat. Jenis ini disebut Silika gel GF atau
Silika gel GF254 (berflouresensi pada
ג
, 254nm).Silika gel tanpa pengikat, dikenal dengan nama Silika gel H atau Silika gel N.
Silika gel tanpa pengikat tetapi dengan indicator flouresensi. Silika gel untuk keperluan pemisahan preparative
Alumina
Banyak digunakan setelah silika gel, alumina termasuk kelompok fase diam yang beraktifitas tinggi. Alumina yang digunakan TLC bersifat sedikit basa (pH 9), ada juga yang bersifat netral (pH 7) dan alumina yang bersifat asam (pH 4). Juga digunakan CaSO4 sebagai pengikat yang dapat menurunkan bebasaan pada tinggkat tertentu. Sepertihalnya Silica gel, alumina dikenal dengan atau tanpa pengikat dan bahan indicator. Pemberian namapun identik dengan silika gel dengan code G.H.P.F.
Selulosa
Fase gerak
Yang digunakan sebagai fase gerak biasanya adalah pelarut organik (tabel 1). Dapat digunakan satu macam pelarut organic saja ataupun campuran.
Bilamana fase gerak merupakan campuran pelarut organik dengan air maka mekanisme pemisahan adalah partisi. Pemilihan pelarut organic ini sangat penting karena akan menentukan keberhasilan pemisahan. Pendekatan polaritas adalah yang paling sesuai untuk pemilihan pelarut. Senyawa polar akan lebih mudah terelusi oleh fase gerak yang bersifat polar dari pada fase gerak yang non polar. Sebaliknya, senyawa non polar lebih mudah terelusi oleh fase gerak non polar dari pada fase gerak yang polar.
Tabel 1 : Pelarut organik yang sering digunakan sebagai fase gerak (deret eluotropik)
non polar
polar
Parafin cair Petroleum eter Sikloheksana Karbon tetraklorida Benzena
Pembuatan plat (lempeng) silica gel
30 Gram phase diam berbentuk serbuk (dengan diameter tertentu dijual dengan merk dagang tertentu misalnya Silica gel GF 254) dibuat bubur dengan air atau pelarut lain sejumlah tertentu (lihat tabel 2) diratakan diatas 4-5 lempeng kaca ukuran 20X20 cm, dalam waktu tidak lebih dari 4 menit. Perataan ini dapat menggunakan alat perata Stahl-Desaga untuk plat kaca ukuran 20X20 cm, 20X10 cm dengan ketebalan dapat diatur 0,25-2,0 mm. Bila ukuran plat lebih kecil dapat dibuat dengan mencelupkan ke dalam bubur adsorbent. Setelah lapisan bubur ini mengering diruangan kemudian dipanaskan di dalam oven pada 100-120°C selama 60 menit, dengan tujuan semua air akan menguap. Proses pengeringan atau penghilangan air disebut proses mengaktifkan plat kromatografi (fase diam), selanjutnya didalam rak penyimpan plat-plat ini dimasukkan kedalam dexicator. Sehingga pada waktu penyimpanan plat-plat tadi tidak menyerap lembab (air) dari udara. Dengan demikian mekanisme pemisahan komponen (senyawa-senyawa) yang ditahan fase diam adalah mekanisme absorption.
Tabel 2: Perbandingan berat fase diam dan cairan untuk pembuatan plat.
Fase diam Cairan Perbandingan
Fase diam : cairan = (g : ml)
1. Silika gel G atau GF Air 30:60-65
2. Silika gel H Air 30:80-90
3. Alumina G Air 30:40
4. Alumina H Air 30:80-90
5. Kiselgur Air 30:60-65
6. Serbuk selulosa MN 300 Air 1:5
7. Serbuk poliamida Kloroform: metanol = 2:3 1:9
Penyiapan dan penotolan sampel
Sampel atau cuplikan dilarutkan dalam pelarut yang sesuai (hampir pelarut organik dapat digunakan dan biasanya dipilih yang mudah menguap), air digunakan hanya bila tidak dapat dicari pelarut organik yang sesuai. Untuk keperluan analisis kuantitatif sample harus ditimbang demikian juga pelarut yang digunakan. Kemudian larutan sample disimpan dalam wadah yang tertutup rapat untuk menghindari penguapan. Pada umumnya ditotolkan 1-20 µl larutan yang mengandung 50-100 µg sample tiap bercak untuk kromatografi absorbsi dan
5-2Qµg sample untuk kromatografi partisi. Penotolan dapat dilakukan dengan gelas kapiler yang dibuat sendiri atau dengan pipet mikro. Untuk keperluan kuantitatif digunakan quantitative microsyringe. Kepada plat TLC konvensional (20X20 cm, 5X20 cm, tebal 0,2 mm) sample ditotolkan sebagai bercak bulat atau garis, 1,5-2,0 cm dari tepi bawah. Untuk memudahkan penotolan dibuat garis lemah dengan pensil, disebut garis awal. Pada garis awal ini biasanya ditotolkan bercak-bercak dengan garis tengah 3-6 mm, bercak-bercak tadi diusahakan diameternya seragam. Penotolan bercak pada plat TLC dapat dilakukan berulang-ulang dan haras berhati-hati dijaga plat tidak rusak. Penotolan sample yang terlalu banyak (over loaded) menyebabkan bercak hasil pengembangan berbentuk tidak bulat (asimetri) dan perubahan harga Rf. Bila totolan sample sample telah kering maka plat siap untuk dielusi / dikembangkan.
Pengembangan (Elusi)
Hampir semua TLC dikembangkan dengan cara menaik dalam bejana
terjadi antara fase diam-senyawa (komponen)-fase gerak. Komponen yang membentuk ikatan hydrogen lebih kuat dengan fase gerak akan terelusi lebih cepat atau merambat lebih cepat. Sebaliknya kalau ikatan hidrogennya lebih kuat dengan fase diam, komponen akan lebih lama tertahan fase diam atau merambat lambat. Pengembangan dihentikan pada saat fase gerak mencapai jarak tertentu, biasanya 1 cm sebelum ujung akhir plat. Batas dicapainya fase gerak segera ditandai dengan pensil sebagai garis akhir. Lebih baik batas akhir ini dibuat dahulu sebelum pengembangan, bila pelarut mencapai garis akhir, plat segera diangkat dan dikeluarkan dari bejana.
Cara-cara pengembangan yang lain adalah : 1. Pengembangan berulang
Yaitu plat yang baru saja dielusi dikeringkan kemudian dielusi kembali dengan fase gerak yang sama.
2. Pengembangan dua dimensi
Yaitu plat dikembangkan seperti biasa, setelah itu dikeringkan dan pelat diputar 90° kemudian dikembangkan dengan fase gerak berbeda (pemisahan flavone "Harbone")
Pengembangan sirkular
3. Contoh cara pengembangan ini adalah pada kromatotorn, sebenarnya termasuk kromatografi planar juga. Perbedaan dengan KLT adalah cara pengembangannya yaitu kromatotorn dikembangkan dengan cara dipusingkan pada kecepatan tertentu. Sampel ditotolkan pada daerah dekat sumbu putar, kemudian sambil dipusingkan fase gerak diteteskan dan diatur kecepatannya, fase gerak ini akan keluar menetes dibagian tepi pelat yang dipusing tersebut.
Pengamatan (mendeteksi) bercak / visualisasi
Cara mengamati bercak pada TLC dapat digolongkan menjadi dua : Pertama dengan cara merusakkan / mereaksikan komponen/senyawa yang ada bercak itu dan Kedua tanpa merusakkan komponen / senyawa. Cara pertama dengan menyemprotkan pereaksi penanda.
organik adalah asam sulfat dalam metanol, selanjutnya bercak dipanaskan di dalam oven, sebaiknya digunakan oven yang ada jendela kacanya sehingga dapat diikuti perubahan bercak selama pemanasan menjadi bercak warna hitam. Pada dasarnya adalah reaksi oksidasi pada senyawa organic oleh asam sulfat. Pereaksi lain adalah dengan disemprot dengan larutan lodium dan paling mudah adalah dengan memasukkan plat kedalam bejana yang berisi uap lodium (kristal lodium diletakkan dalam bejana, tidak merusak 75% senyawa). Contoh pereaksi semprot dan penggunaannya dapat dilihat pada tabel 3.
Cara ke dua, yang tidak merusak komponen/ senyawa di bercak. Untuk senyawa berwarna atau berpendar dibawah lampu UV (berfluoresensi) tidak ada masalah menggunakan silika tanpa tambahan zat berpendar. Sedang untuk senyawa yang tidak berpendar dibawah lampu UV digunakan fase diam dengan tambahan zat berpendar.
Tabel 3 : Macam pereaksi warna / penanda dan penggunaannya
No. Pereaksi warna Jenis senyawa Warna
1. Anilina ftalat Gula mereduksi Berbagai warna 2. Anisaldehida dalam H2SO4
dan asam asetat
Karbohidrat Berbagai warna
3. Stibium triklorida dalam kloroform
Steroid, glikosida steroid. Lipid alifatik, vit. A dll.
Berbagai warna
4. Hijau brom kresol Asam karboksilat Bercak kuning pada dasar hijau
5. 2,4-Dinitrofenilhidrazin Aldehida dan keton Bercak kuning sampai merah
6. Deagendorf Alkaloid dan basa organic Jingga
7. Besi III klorida Fenol Berbagai warna
8. Flourescein;Br2 Senyawa tak jenuh Bercak kuning pada dasar merah jambu
9. Ninhidrin Asam amino, gulaamino, asamfosfatida
Analisis Kualitatif
KLT mempunyai kontribusi yang signifikan pada analisis kualitatif, walaupun masih perlu data pendukung lainnya. Untuk analisis kualitatif diperlukan senyawa murni pembanding. Sampel dan senyawa pembanding dilarutkan pada pelarut yang sama, Kemudian laratan sampel ditotolkan pada ujung pelat KLT, 2 cm sejajar dengannya ditotokan larutan senyawa murni dan disebelahnya lagi ditotolkan campuran sampel dan senyawa pembanding. Kromatogram diangkat diberi tanda batas akhir yang ditempuh fase gerak.
Diinventarisasi nilai Rf dan Rr. Senyawa yang mempunyai nilai Rf yang sama dengan nilai Rf senyawa pembanding dan pada pengulangan elusi dengan sistim berbeda tetap memberikan nilai Rf yang sama, maka dapat disimpulkan sementara senyawa tersebut identik dengan senyawa pembanding.
Rf adalah jarak yang ditempuh senyawa (bercak) dibagi dengan jarak yang ditempuh fase gerak.
hRf adalah Rfx 100.
Rr adalah jarak yang ditempuh senyawa sample dibagi dengan jarak yang ditempuh senyawa pembanding menggunakan sistim yang sama.
Untuk keperluan mencari sistim KLT yang dapat digunakan untuk senyawa obat dapat dicari pada beberapa literature. Satu diantaranya adalah dari buku:
Isolation and Identification of drugs Oleh:
E.G.C.Clarke, Judith Berle, M.Sc.
The Pharmaceutical Press, London, (1974)
Tabel 4: Contoh Sistim Elusi Untuk Senyawa Obat
No Sistem Golongan senyawa obat
1 T1 Basa nitrogen (alkaloid) 2 T2 Antihistamin &
klordiazepoksid 9 T9 Alkaloid ergot
10 T10 Barbiturat Fase gerak :
Aseton 1
timbul Pink atau hijau
11 T11 Barbiturat
Larutan amoniak pekat 5 Benzen 75 Dioksan 20 13 T13 Barbiturat
17 T17 Aspirin
22 T22 Golongan sulfa Sample dilarutkan dalam aseton Fase gerak:
CHC13 1 Etanol 1 Heptana 1 Air 1,5% Kesetimbangan 3 jam
Tabel: 5, Obat-obat Sulfa dan Nilai Rf pada T22
mempunyai Rf terkecil dari ketiga sulfa itu.
Tabel: 6, Senyawa Barbiturat dengan Nilai Rf pada TI
berikatan rangkap.
Analisis Kuantitatif
Ketepatan dan ketelitian KLT untuk analisis kuantitatif lebih rendah bila dibandingkan dengan kromatografi gas dan kromatografi kinerja tinggi. Namun untuk keperluan tertentu sudah memadahi. Dibedakan dua cara:
1. Bercak langsung diukur 2. Bercak diambil (dikerok)
Ad 1.
Dengan dasar adanya hubungan antara luas bercak dengan banyaknya senyawa terlarut maka senyawa dapat diukur kadarnya dengan mengukur luas bercak. Cara dibedakan lagi:
a. Tanpa menggunakan kurva baku
Menurut Purdy & Truter: akar luas bercak berbanding lurus dengan logaritma(lO) berat senyawa yang ada. Untuk menghitung dengan cara ini maka perlu dibuat tetapan untuk senyawa pada sistem yang tertentu.
b. Menggunakan kurva baku
Dibuat kurva hubungan kadar dan luas bercak dari senyawa murni pembanding.
Akan diperoleh persamaan garis lurus Y = bX + a. Selanjutnya luas bercak sampel dapat dihitung. Adapun urutan kerja dapat disusun sbb :
1* Dibuat larutan mengandung senyawa murni yang akan dianalisis dengan 3 macam konsentrasi yang diketahui.
2* Dibuat larutan sample pada kadar tertentu sehingga setelah dielusi memberikan
bercak yang bulat (ideal).
3* Ke 4 larutan ( 1 sampel, 3 lart baku) ditotolkan secara duplo pada lempeng yang sama (20X20 cm).
Perlu diperhatikan:
- penotolan tegak lurus dengan alat suntik mikro, gelas kapiler. - banyak larutan 5-10 pi.
- sekali penotolan saja dengan volume yang sama.
5* Luas bercak diukur pada alat densitometer. Dibuat kurva hubungan kadar dan luas kemudian dibuat persamaan garis lurus. Kadar senyawa dalam dapat ditetapkan.
Ad 2. Mengukur kadar dengan cara elusi.
Cara ini akan memberikan ralat yang timbul karena memindahkan / mengerok dan
elusi. Ditentukan letak bercak dengan cara yang tidak merusak, mengerok bercak
beserta fase diam, kemudian diekstraksi dengan alat yang diperoleh diukur kadarnya dengan spektrometri atau cara lain yang sesuai.
Urutan kerja dapat disusun sebagai berikut:
1*Sampel dilarutkan dalam pelarut yang sesuai, demikian juga senyawa murni (pembanding) dilarutkan dalam pelarut yang sama dengan pelarut untuk sample. 2*Banyak sample yang ditotolkan harus diketahui dengan tepat.
3*Dikembangkan secara biasa dan divisualisasikan dengan cara yang tidak merusak.
4*Bercak yang dikehendaki diberi tanda dengan alat tajam, dibandingkan dengan bercak baku.
5*Bercak beserta fase diam dikerok kemudian dilarutkan dalam pelarut yang sesuai secara kuantitatif.
6*Larutan yang diperoleh bila perlu diuapkan dibawah rotary evaporator dimasukkan ke dalam labutakar, ditetapkan kadarnya dengan cara yang sesuai.
KLT preparatif
adalah silikagel dengan atau tanpa indicator flouresensi 254 nm. Tersedia TLC preparative dijual dengan kualitas lebih baik daripada lapisan fase diam yang dibuat sendiri. Tebal optimum lapisan preparative berkisar antara 1-1,5 mm. Lapisan yang terlalu tebal kurang memberikan pemisahan yang baik. Lapisan preparative dapat dibuat dengan ketebalan yang diinginkan dengan alat dari Desaga.
Kromatografi Lapisan Tipis Kinerja Tinggi (KLTKT=HPTLC)
