Bioesai Anti Tumor/Kanker

Bioesai Anti

Tumor/Kanker

KIMIA BIOESAI 2014

CANCER TUMOR

Penyakit degeneratif dengan pertumbuhan seluler yang tidak dapat dikontrol/diatur dan menyebar dalam tubuh

Keadaan pertumbuhan seluler yang abnormal shg membentuk kelainan benjolan pada tubuh

Membutuhkan pengobatan jangka panjang, spt pembedahan, radiasi, kemoterapi

Cukup dengan pengangkatan tumor.

2

Tipe

Kanker

ADENOMA Kelainan yang terjadi

dari tiroid, pituitary. LEUKEMIA

kelainan yang dimuai dari sumsum tulang LYMPHOMA

Kanker yang berawal dari kelenjar getah bening

PenyebabTUMOR

Bahan kimia: Benzena Minum alkohol

Toksin lingkungan (aflatoxins) Sinar matahari berlebihan Genetik

Obesitas Radiasi Virus

4

Gangguan kontrol pertumbuhan

Kegagalan dalam melakukan bunuh diri sel. Apoptosis atau bunuh diri sel suatu proses normal untuk menghancurkan sel tua atau sel rusak.

Keseimbangan

Pada pembentukan kanker kulit, keseimbangan antara pembelahan sel dan hilangnya sel mengalami perubahan. Sel Basal membelah lebih cepat dibandingkan kematian sel yang lepas pada permukaan

Invasi dan metastasis neoplasma

Pertumbuhan sel yang meningkat menghasilkan suatu massa disebut tumor atau neoplasma. Kalau tiada ada proses bunuh diri maka tumor terus tumbuh,

Kanker bisa tumbuh ke seluruh tubuh, melalui: invasi dan metastasis. Invasi dan penetrasi langsung dari migrasi sel kanker ke jaringan sekitar; melalui pembuluh limfe dan darah, ke jaringan lainnya

6

R

• Tumor Suppressor Genes -ve (p53) • Growth Factors Oncogenes +ve

S

DNA

Synthesis

G

2 Premitotic Interval

M

PROPHASE METAPHASE ANAPHASE TELOPHASE MITOSIS

G

0

G

1 S PHASE SPECIFIC Cytosine Arbinoside Hydroxyurea S PHASE SPECIFIC SELF LIMITING 6-Mercaptpurine Methotrexate.

M

PHASE SPECIFIC vincristine vinblastine paclitaxel PHASE NONSPECIFIC

alkylating agents, cis-platinum nitrosoureas, dacarbazine antibiotics procarbazine G0 Differentiation PENTOSTATIN Inhibits adenosine Deaminase PALA Inhibits Pyrimidine Biosynthesis Purine synthesis Pyrimidine synthesis Ribonucleotides Deoxyribonucleotides DNA HYDROXYUREA Inhibit Ribonucleotide Reductase 6-MERCAPTOPURINE 6-THIOGAUNINE

Inhibit Purine ring biosynthesis Inhibit Neocleotide interconversions 5-FLOUROURACIL Inhibit TMP Synthesis METHOTREXATE Inhibit dihydrofolate reduction, blocks TMP and Purine synthesis

8

DNA

RNA

(Transfer, messenger, ribosomal)

CYTARABINE FLUDARABINE 2-CHLORODEOXY ADENOSINE Inhibit DNA Synthesis ALKYLATING AGENTS MITOMYCETIN CISPLATIN PROCARBAZINE DACARBAZINE Form adducts w/ DNA

BLEOMYCIN ETOPOSIDE TENIPOSIDE Damage DNA and

Prevent repair

DACTINOMYCINE DAUNORUBICIN DOXORUBICIN MITOXANTRONE Intercalate with DNA Inhibit RNA synthesis

PROTEINS Enzymes Microtubules A-ASPARAGINASE Deaminate asparagine Inhibits protein synthesis PACLITAXEL VINCA ALKALOIDS COLCHICINE Inhibit function of Microtubules

Sel hidup dan sel mati

•Esai Fungsi

• Esai penanda DNA • Esai morfologis • Esai reproduktif

• Esai Integritas membran

Kriteria utama untuk esai viabilitas

Category of

viability assay Assays Principles

Membrane

integrity assay -Exclusion dyes _{-Fluorescent dyes}

-LDH leakage -Annexin v assay

The determination of membrane integrity via dye exclusion from live cells

Functional assay

-MTT, XTT assay -Crystal violet/ Acid phosphatase(AP) assay -Alamar Blue oxidation- reduction assay - Neutral red assay -[3H]-thymidin/ BrdU incorporation

Examining metabolic components that are necessary for cell growth

DNA labeling assay -Fluorescent conjugates cell selection and viability assay

Morphological mechanism based

assay

-Microscopic observation -Caspase 3 detection -PARP cleavage assay

Determination of morphological change

Reproductive assay -Colony formation assay Determination of growth rate

10

Prinsip

Trypan Blue dye Exclusion Methods



Memberi gambaran yang membedakan sel hidup dan sel mati

termasuk tidak adanya fungsi transpor zat melalui membran plasma karena hilangnya intergritas membran.



Sel harus dihitung dalam rentang waktu 3-5 min karena berpengaruh pada bertambahnya jumlah warna yang terserap sejalan dengan waktu.

- Sel hidup (Viable cells) : kecil, bulat dan refraktif

- Sel mati (Non-viable cells) : bengkak, lebih besar dan biru tua

Sel hidup vs sel mati ??



Ethidium bromide (EtBr) dan propidium iodide (PI)



PI berikatan denan asam nukleat pada kerusakan membran : teknik flow cytometric tergantung pada fluorescence, PI sangat ideal untuk mengevaluasi sifat permeabilitas dari sel dalam jumlah besar. Hasilnya memberi akurasi statistik yang baik.

PI impermeable terhadap plasma membran yang utuh

Interkalasi dengan DNA or RNA  merah

Pewarna Fluorescen

12



Fluorescein diacetate (FDA) suatu nonpolar ester yang dapat melalui membran plasma dan di hidrolisasi oleh esterase intraseluler untuk hasilkan fluorescein bebas, polar fluorescein berada dalam sel yang masih memiliki membran plasma yang utuh.

Sel hidup (Undamaged cell) : sangat fluorescen

Sel rusak/mati (Damaged cell) : fluorescen lemah



Hijau kekuningan pada 450-480 nm

Intact cell –

PI and FDA ditambahkan Fluorescein dlm sel utuh

Ilustrasi dari prinsip esai sel hidup dengan PI/FDA

● FDA (Fluorescein diacetate)

● PI (Propidium iodide)

Annexin V: Penanda dini suatu Apoptosis

Indikasi apoptosis dengan adanya translokasi membran

fosfolipid fosfatidilserin (PS) dari bagian dalam membran plasma ke bagian luarnya.

Setelah terpapar dg lingkungan luar, tempat berikatan PS makin tersedia utk Annexin V, 35-36 kDa, Ca 2+-dependent, phospholipid binding protein dengan afinitas tinggi terhadapa PS

Translokasi PS, dilanjutkan dengan proses apoptosis yaitu hilangnya integritas membran, fragmentasi DNA, dan kondensasi kromatin.

Annexin V dapat dikonjugasi dengan biotin atau

fluorochrome, cth FITC, PE, APC, Cy5, or Cy5.5. Deteksi dg flow cytometric

14

- Translokasi PS terjadi juga pada kematian sel, maka bukan penanda absolut utk apoptosis.

- Maka ditambahkan dengan pewarna 7-amino-actinomysin (7-AAD) atau propidium iodide (PI), yang berikatan dg asam

nukleat, hanya bisa melewati membran plasma saat masih utuh pada akhir apoptosis maupun nekrosis.

Hasil

annexin-/PI-, annexin +/PI-, annexin+/PI+ and annexin – /PI+

No Apoptosis = Cell Viability

sel negatif terhadap Annexin V dan pewarna vital tidak mengalami apoptosis: translokasi PS belum terjadi dan membran masih utuh.

Early Apoptosis

Sel positif Annexin V dan pewarna vital masih negatif, berarti tahap awal apoptosis dimana translokasi PS telah terjadi, akan tetapi membran plasma masih utuh.

Late Apoptosis or Cell Death

Sel positif terhadap Annexin V dan pewarna vital, berarti tahap lanjut apoptosis atau sudah mati, translokasi PS sudah terjadi dan

Esai LDH

LDH katalisasi reduksi dari NAD+ _{ NADH dan H}+ _{denga oksidasi laktat menjadi}

piruvat. Kedua: diaphorase menggunakan NADH and H+ _{utk katalisasi reduksi garam}

tetrazolium (INT) menjadi formazan (absorbsi 490-520 nm).

Prinsip

Sel tumor memiliki konsentrasi LDH intraseluler yang tinggi dan membelah garam tetrazolium bila LDH ada dalam kultur

16

_

_{Nilai kuantitatifviability}



Aktivitas LDH dapat diukur dg mengukur saat reduksi dari piruvat dan laktat



Reduksi diikat pada oksidasi NADH  NAD+_,

spectrophotometric pada 340nm

LDH

Pyruvate + NADH + H+ _{⇌ NAD}+ _{+ lactate}

Kebocoran LDH

(lactate dehydrogenase)

Esai MTT



Metode ini sensitif, kuantitatif dan uji kolorimetrik cukup baik, mengevaluasi proliferasi sel, sitotoksisitas, dan apoptosis.



Berdasarkan kemampuan enzim dehidrogenase mitokondria pada sel hidup utk konversi warna kuning substrat utk mitokhondria dehidrogenasi, yaitu 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) direduksi menjadi produk formazan berwarna biru gelap yg tidak larut dlm air.



Jumlah formazan yang dihasilkan sebanding dengan jumlah sel yang hidup dalam sampel

18

Uji Kolorimetrik

MTT: 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide akan direduksi menjadi produk formazan yang tidak larut berwarna ungu biru

XTT

(2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide) akan direduksi menjadi suatu derivat formazan yang larut, warna oranye terang.

Keunggulan dg XTT tidak perlu menambahkan zat utk melarutkan formazan.

MTT dan XTT

Culture cells in a MTP for a certain period of time (37℃)

MTT assay XTT assay

Prepare labeling mixture

Incubate cells (0.5-4 h, 37℃)

Add solubilizing solution (Isopropanol) and incubate

Measure absorbance using an ELISA reader 570nm

Add XTT labeling mixture Add MTT labeling reagent

Example:

MTT and XTT

MTT XTT

Jenny G., Mark H., Anna J., Inger K., Douglas Mc., Roland M., 2002. Evaluation of redox indicators and the use of digital scanners and spectrophotormeter for