Pengaruh Pemberian Curcuminoid dalam Mencegah dan Memperbaiki Kerusakan Fibroblas Koklea Rattus Norvegicus Model Diabetes Mellitus Ditinjau dari Ekspresi Kolagen Tipe IV Chapter III VI

(1)

BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Jenis dan Rancangan Penelitian

Jenis penelitian yang digunakan adalah eksperimental laboratorik ex vivo karena baik sampel maupun perlakuan lebih terkendali, terukur dan pengaruh perlakuan dapat lebih dipercaya. Rancangan penelitian ini menggunakan randomized post test only control group laboratory experimental design untuk mengetahui efek pemberian curcuminoid

terhadap tikus model DM setiap unit eksperimen dengan pengukuran variabel yang hanya dilakukan setelah pemberian perlakuan. Pengambilan sampel dilakukan secara acak dan ada kontrol pembanding.

3.2 Tempat dan Teknik Pengambilan Data Penelitian 3.2.1 Tempat penelitian

Penelitian dilakukan di laboratorium yang terstandarisasi dan mempunyai peralatan lengkap serta pengalaman memadai di Laboratorium Biokimia Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga (Surabaya) untuk pemeliharaan, perlakuan pada hewan coba, pemberian

curcuminoid dan juga pengambilan jaringan koklea. Pembuatan blok serta pemotongan blok jaringan, pewarnaan Hematoxylin dan Eosin (HE), pemeriksaan imunohistokimia dan penghitungan sel dilakukan di Laboratorium Patologi Anatomi Rumah Sakit Umum Daerah dr. Soetomo (Surabaya).

3.2.2 Teknik Pengambilan Data

(2)

3.3 Variabel Penelitian

3.3.1 Variabel bebas (independen)

Variabel bebas adalah stres hiperglikemia yang didapatkan melalui injeksi streptozotocin (STZ) 60 mg/kgbb/ekorserta pemberian curcuminoid

dengan dosis 200 dan 400 mg/kgbb/hari/ekor selama 3 dan 8 hari. 3.3.2 Variabel terikat (dependen)

Respon molekuler pada fibroblas berupa ekspresi kolagen tipe IV. 3.3.3 Variabel terkendali

Tikus Rattus norvegicus galur Wistar, jenis kelamin tikus, kandang tikus terpisah, berat badan tikus, makanan dan minuman tikus, cara pemberian perlakuan injeksi STZ serta curcuminoid, prosedur penelitian dan cara pemeliharaan hewan coba.

3.4 Sampel

Penelitian ini menggunakan tikus karena tikus memiliki kemiripan struktur telinga dalam dengan manusia. Tikus telah digunakan sebagai model hewan coba untuk penelitian penyakit ketulian genetik manusia dan terbukti bermanfaat dalam membantu mengidentifikasi gen yang sesuai pada manusia yang berperan dalam perkembangan sistem auditorius. Tikus dinyatakan homolog (>70%) dengan manusia (Purnami, 2009). Tikus Rattus norvegicus galur Wistar, jenis kelamin jantan, kondisi sehat, umur dewasa (2-3 bulan), dengan berat badan 150-250 gram agar perubahan berat selama penelitian relatif kecil (Haryuna, 2013).

(3)

Rancangan penelitian memiliki kriteria sebagai berikut: 1. Pengambilan sampel dilakukan secara acak,

2. STZ diberikan dalam dosis tertentu sesuai berat badan tikus, 3. Ada kontrol pembanding,

4. Bersifat double blind.

Selanjutnya data yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan uji statistik SPSS untuk mencapai tujuan penelitian.

3.4.1 Besar sampel

Besar sampel ditentukan berdasarkan jumlah ulangan yang dianggap telah cukup baik (Federer, 1955), dengan rumus sebagai berikut:

Keterangan:

k = jumlah kelompok subyek penelitian (k = 6) r = jumlah ulangan

Perhitungan:

(6-1) (r-1) ≥ 15. 5r –5 ≥ 15. 5r ≥ 20. r ≥ 4

Berdasarkan hasil penghitungan r (ulangan) minimal sama dengan 4 kali, maka ditetapkan ulangan tiap kelompok 4.

r = 4; n = r x k; n = 4 x 6 = 24

ditetapkan besar sampel secara keseluruhan yaitu minimal 24 ekor tikus. 3.4.2 Pengelompokan sampel

Berdasarkan rumus di atas maka besar sampel adalah tikus yang diambil peneliti secara random untuk tiap kelompok perlakuan, sehingga sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah 24 ekor tikus yang dibagi menjadi 6 kelompok sebagai berikut:

(4)

R

R : Randomisasi.

K1 : Kelompok kontrol, diberikan injeksi buffer natrium sitrat (1x). K2 : Kelompok perlakuan diberikan injeksi STZ 60 mg/kgbb/ekor

single dose.

K3 : Kelompok perlakuan diberikan injeksi STZ 60 mg/kgbb/ekor

single dose, kemudian diberikan curcuminoid 200 mg/kgbb/hari/ekor dimulai hari ke-3 selama 3 hari.

3.4.3 Teknik pengambilan sampel

Tikus putih jantan Rattus norvegicus galur Wistar didapat dari institusi penyedia yang memiliki kualifikasi standar dan reputasi yang baik (Laboratorium Biokimia Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga).

(5)

Sebelum digunakan sebagai subyek penelitian, hewan coba dilakukan evaluasi klinis dan dikondisikan dalam lingkungan yang sesuai (selama 14 x 24 jam) untuk meyakinkan bahwa hewan tersebut tidak berpenyakit atau tidak berpotensi menularkan penyakit.

Sebelum mendapatkan perlakuan penelitian, dilakukan skrining dengan beberapa kriteria, yaitu:

1. Kriteria inklusi:

Hewan coba berusia 2-3 bulan, jenis kelamin jantan dan berat badan 150-250 gram.

2. Kriteria eksklusi:

a. Hewan dinyatakan oleh dokter hewan konsultan terbukti berpenyakit, baik penyakit menular atau tidak menular atau cedera fisik atau berpotensi menularkan penyakit dalam kurun waktu evaluasi klinis di dalam kondisi lingkungan yang sesuai (selama 14 x 24 jam).

b. Hewan terdeteksi memiliki kelainan bawaan yang dinyatakan oleh dokter hewan konsultan.

c. Hewan berperilaku agresif, dalam pengamatan sering menyerang anggota kelompok lain.

(6)

Selanjutnya tikus diterminasi dan dilakukan pengambilan jaringan koklea untuk dibuat sediaan dan pengecatan imunohistokimia untuk analisis ekspresi kolagen tipe IV.

3.5 Definisi Operasional Variabel Penelitian 1. Induksi DM

Injeksi STZ dengan dosis 60 mg/kgbb/ekor single dose secara intraperitoneal, kemudian kadar gula darah diukur 2 hari pasca injeksi, sampai terjadi kondisi hiperglikemia (KGD >200 mg/dl).

2. Hiperglikemia adalah keadaan dimana kadar gula darah tikus mencapai >200 mg/dl yang diukur menggunakan strip pengukur kadar gula darah merk Gluko DR® Bio Sensor dari allmedicus.

3. Curcuminoid

Zat pigmen kuning yang diekstraksi dari tumbuhan Curcuma domestica Val. atau Curcuma longa Linnaeus. Pada penelitian ini yang digunakan adalah curcuminoid serbuk dengan kadar 80% curcuminoid standar dari Tradimun. Sediaan yang diberikan berupa

curcuminoid serbuk dengan dosis 200 dan 400 mg/kgbb/hari per ekor tikus.

4. Fibroblas: sel yang terdapat pada jaringan dinding lateral koklea. Sel berinti tunggal.

5. Ekspresi kolagen tipe IV

(7)

3.6 Alat dan Bahan Penelitian

3.6.1 Hewan coba yang dikenai perlakuan

Tikus putih jantan Rattus norvegicus galur Wistar yang memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi, kemudian dikelompokkan secara acak.

3.6.2 Bahan perlakuan 1. STZ

STZ merupakan senyawa nitrosourea yang disimpan pada suhu 200 C. Konsentrasi STZ adalah 22,5 mg/l dengan dosis penggunaan 60 mg/kgbb/ekor tikus, disimpan dalam tabung reaksi yang ditutup dengan aluminium foil (karena sensitif terhadap cahaya).

2. Curcuminoid

Curcuminoid yang dipakai berasal dari Curcuma longa Linnaeus dengan kadar curcuminoid 80% yang berasal dari Tradimun. Sediaan yang diberikan berupa curcuminoid serbuk dengan dosis 200 dan 400 mg/kgbb/hari perekor tikus.

3. Buffer natrium sitrat

Buffer natrium sitrat dibuat dengan melarutkan 1,47 gram Natrium sitrat dalam 50 ml dH2O.

4. CMC

CMC dibuat dengan mensuspensikan 0,5 gram CMC dalam 100 cc larutan akuades.

3.6.3 Alat dan bahan pemeriksaan laboratorium

(8)

Bahan untuk pembuatan blok parafin, proses deparafinisasi, HE dan imunohistokimia meliputi Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid (EDTA), formalin 10%, H2O2 3%, xylol, alkohol (30%, 50%, 70%, 80% dan 96%), dH2O, larutan HE, entelan, paraffin lunak dan keras, Fetal Bovine Serum (FBS), Phosphate Buffer Saline (PBS), antibodi primer yaitu polyclonal Anti-COL4A2 dan biotinylated secondary Ab (anti rabbit), Horse Radish Peroxidase (HRP) streptavidin, pewarna Meyer-Hematoxilen, substrat

Diamino Benzidine (DAB) dan entelan.

3.7 Prosedur Penelitian 3.7.1 Tahap persiapan

Untuk menjamin bahwa semua prosedur yang dilakukan pada penelitian ini laik etik, maka sebelum dilakukan penelitian proposal diajukan terlebih dahulu pada Komisi Etik Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara untuk mendapatkan penilaian dan pengesahan kelaikan etik.

3.7.2 Prosedur induksi diabetes menggunakan STZ Membuat tikus model DM :

1. Hewan coba dipuasakan terlebih dahulu selama 4 jam untuk mengosongkan lambung dan mengurangi risiko aspirasi.

2. Hitung kebutuhan induksi dosis STZ 60 mg/kgbb/ekor.

3. Hitung kebutuhan dapar sitrat yang dibutuhkan dengan konsentrasi STZ 22,5 mg/ml dalam dapar sitrat.

4. Siapkan tabung dan bungkus dengan aluminium foil pada bagian luarnya.

5. 15-20 menit sebelum diinduksi, timbang STZ yang dibutuhkan kemudian larutkan ke dalam dapar sitrat yang telah ditentukan.

(9)

7. 30 detik sampai 1 menit sebelum induksi segera pindahkan larutan STZ ke dalam spuit 1 ml.

8. Injeksikan larutan STZ melalui intraperitoneal tikus sesuai dengan kebutuhan dosis per ekor. Induksi dilakukan hanya satu kali.

9. Berikan larutan sukrosa 10% atau dekstrosa 10% sepanjang malam pertama setelah induksi untuk menghindari sudden hypoglycemic post injection.

10. Tikus diperiksa KGD puasa setiap pagi (puasa tikus dengan cara tidak diberi pakan dan kandang dikosongkan dari sekam selama 6 jam). Hiperglikemia yang bermakna akan dijumpai 2 hari setelah induksi. 11. Pada kelompok 2 dilakukan terminasi 3 hari setelah hiperglikemia.

Pada kelompok 3 dan 4, setelah hiperglikemia diberikan curcuminoid

selama 3 hari sebelum terminasi. Pada kelompok 5 dan 6, setelah hiperglikemia diberikan curcuminoid selama 8 hari sebelum terminasi. 3.7.3 Prosedur pemberian curcuminoid

Curcuminoid (kadar curcuminoid80%) dosis 200 dan 400 mg/kgbb/hari perekor tikus disuspensikan dalam CMC 0,5% (CMC dibuat dengan mensuspensikan 0,5 gram CMC dalam 100 cc larutan akuades). Setelah disuspensikan, diberikan ke tikus dengan menggunakan Naso Gastric Tube (NGT).

3.7.4 Perlakuan pada tikus

Setelah tikus putih beradaptasi terhadap lingkungan kandang di laboratorium selama 2 minggu, selanjutnya perlakuan diberikan sesuai dengan kelompok yang direncanakan.

3.7.5 Prosedur pengambilan jaringan koklea tikus

(10)

3.7.6 Pemeriksaan laboratorium

1. Fiksasi jaringan dengan pembuatan paraffin block jaringan.

Jaringan tulang didekalsifikasi dengan menggunakan EDTA selama 4 minggu. Jaringan selanjutnya dicuci dengan PBS 3-5 kali untuk membersihkannya dari kontaminan. Kemudian jaringan difiksasi pada larutan formalin 10%. Setelah itu dilakukan dehidrasi dengan alkohol bertingkat (30%, 50%, 70%, 80%, 96% dan absolut) masing-masing selama 60 menit. Dilakukan clearing menggunakan xylol sebanyak 2 kali masing-masing 60 menit. Kemudian dilakukan impregnasi dengan parafin lunak selama 60 menit pada suhu 480C. Selanjutnya dilakukan

blocking preparat dalam parafin keras pada cetakan dan didiamkan selama sehari.

2. Proses deparafinisasi.

Dilakukan pemotongan blok parafin setebal 4 µm dengan rotary microtome. Jaringan yang sudah dipotong dimasukkan dalam air hangat lalu kemudian diletakkan pada kaca obyek. Kaca obyek selanjutnya diletakkan di atas hot plate dengan suhu 50-60oC hingga mengering.

3. Proses pewarnaan HE

(11)

4. Proses pewarnaan kolagen tipe IV (imunohistokimia).

Masukkan sediaan ke dalam xylol sebanyak dua kali masing-masing selama 5 menit, setelah itu dilakukan rehidrasi dengan alkohol berseri (absolut, 96%, 80%, 70%, 50% dan 30%) masing-masing selama 5 menit, kemudian dibilas dalam dH2O selama 5 menit. Masukkan kembali ke dalam H2O2 3% selama 20 menit, lalu cuci menggunakan PBS pH 7,4 tiga kali, selama 5 menit. Bloking protein non-spesifik dilakukan dengan menggunakan 5% FBS yang mengandung 0,25% Triton X-100 lalu cuci kembali dengan PBS pH 7,4 tiga kali, selama 5 menit. Inkubasi dengan menggunakan antibodi primer yaitu polyclonal Anti-COL4A2 selama 60 menit, cuci menggunakan PBS pH 7,4 tiga kali selama 5 menit. Selanjutnya sediaan direaksikan dengan antibodi sekunder (Biotinylated secondary Ab) selama 60 menit, cuci menggunakan PBS pH 7,4 tiga kali selama 5 menit. Inkubasi dengan HRP steptavidin selama 60 menit, cuci menggunakan PBS pH 7,4 tiga kali, selama 5 menit. Tetesi dengan DAB dan inkubasi selama 30 menit, cuci menggunakan dH2O, selama 5 menit. Masukkan ke dalam Mayer Hematoxilin inkubasi selama 10 menit dan cuci menggunakan

tap water. Bilas menggunakan dH2O dan kering-anginkan. Kemudian mounting menggunakan entelan dan tutup dengan cover glass.

3.7.5 Penghitungan sel

Menggunakan mikroskop Nikon Eclips 100 dengan pembesaran 40x. Penghitungan jumlah fibroblas terekspresi dilakukan oleh 3 orang pemeriksa.

1. Semua slide yang sudah berkode ditutup nomor kodenya dan diberi nomor baru secara acak sehingga pemeriksa dan peneliti yang ikut memeriksa tidak mengetahui slide yang diperiksa milik sampel yang mana (double blind).

(12)

3. Pemeriksaan dan penghitungan sel dilakukan secara terpisah diantara ke-3 pemeriksa, disesuaikan dengan kemampuan / kesediaan waktu pemeriksa.

4. Pemeriksaan dan penghitungan sel dilakukan terhadap masing-masing slide pada dinding lateral koklea yaitu daerah yang ditandai dengan adanya fibroblas dengan pembesaran 40x.

5. Hasil penghitungan sel untuk setiap lapangan pandang sesuai dengan

slide yang diperiksa ditulis di lembar kerja.

(13)

3.8 Alur Penelitian

Gambar 3.1 Alur Penelitian.

3.9 Analisis Statistik

Data penelitian yang diperoleh akan diolah dan dianalisis dengan menggunakan IBM SPSS Statistics. Sebelum dilakukan analisis, terlebih dahulu dilakukan uji normalitas dengan uji Shapiro-Wilk. Analisis univariat

(14)

(15)

BAB IV

HASIL PENELITIAN

4.1 Fibroblas Dinding Lateral Koklea

Gambar pemeriksaan dengan pengecatan HE digunakan untuk melihat potongan dinding lateral koklea dan sebagai pembanding atas pengecatan dengan imunohistokimia (Gambar 4.1).

Gambar 4.1 Penampang Dinding Lateral Koklea Tikus dengan Pengecatan HE (Pembesaran 4x).

4.2 Imunohistokimia Kolagen Tipe IV Setiap Kelompok

Setelah dievaluasi dengan metode imunohistokimia, dijumpai penurunan ekspresi kolagen tipe IV pada kelompok yang hanya diberikan injeksi STZ 60 mg/kgbb/ekor single dose (kelompok 2) [Gambar 4.2 (B)] dibandingkan dengan kelompok lain. Selanjutnya, kelompok DM yang diberi curcuminoid (kelompok 3, 4, 5 dan 6) menunjukkan ekspresi kolagen tipe IV lebih banyak dengan densitas warna coklat lebih kuat yang terekspresi pada fibroblas dibandingkan kelompok DM tanpa pemberian

(16)

Gambar 4.2 Ekspresi Kolagen Tipe IV di Setiap Kelompok (Pembesaran 40x):

(A) Kelompok 1; (B) Kelompok 2; (C) Kelompok 3; (D) Kelompok 4; (E) Kelompok 5 dan (F) Kelompok 6. Panah merah menunjukkan ekspresi kolagen tipe IV pada fibroblas dinding lateral koklea yang ditandai dengan warna coklat.

A

B

C

(17)

4.3 Profil Ekspresi Kolagen Tipe IV

Pada penelitian ini jumlah sampel diambil empat ekor tikus pada setiap kelompok (n=4) dengan karakteristik sampel yang digunakan memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi.

Hasil penelitian yang didapat berdasarkan pemeriksaan histopatologis dengan metode HE dan imunohistokimia didapatkan gambaran ekspresi kolagen tipe IV yang merupakan komponen utama dari MES. Selanjutnya dilakukan analisis statistik untuk mengetahui perbedaan ekspresi tiap kelompok dimana kelompok 1 merupakan kelompok kontrol, diberikan injeksi buffer natrium sitrat (1x) dilanjutkan pemberian CMC (setiap hari); kelompok 2 diberikan injeksi STZ 60 mg/kgbb/ekor single dose, kemudian diterminasi hari ke-5; kelompok 3 diberikan injeksi STZ 60 mg/kgbb/ekor

single dose, kemudian diberikan curcuminoid 200 mg/kgbb/hari/ekor dimulai hari ke-3 selama 3 hari, kemudian diterminasi hari ke-5; kelompok 4 diberikan injeksi STZ 60 mg/kgbb/ekor single dose, kemudian diberikan

curcuminoid 400 mg/kgbb/hari/ekor dimulai hari ke-3 selama 3 hari, kemudian diterminasi hari ke-5; kelompok 5 diberikan injeksi STZ 60 mg/kgbb/ekor single dose, kemudian diberikan curcuminoid 200 mg/kgbb/hari/ekor dimulai hari ke-3 selama 8 hari, kemudian diterminasi hari ke-10; kelompok 6 diberikan injeksi STZ 60 mg/kgbb/ekor single dose, kemudian diberikan curcuminoid 400 mg/kgbb/hari/ekor dimulai hari ke-3 selama 8 hari, kemudian diterminasi hari ke-10.

4.3.1 Diagram rerata kolagen tipe IV

Ekspresi kolagen tipe IV ditemukan menurun pada kelompok yang hanya mendapat perlakuan injeksi STZ 60 mg/kgbb/ekor single dose

(18)

Gambar 4.3 Diagram Rerata Ekspresi Kolagen Tipe IV pada Masing-Masing Kelompok.

4.3.2 Analisis univariat

Analisis univariat dilakukan untuk memperoleh nilai mean dan SD untuk tiap kelompok penelitian sehingga dapat diketahui deskripsi masing-masing variabel dalam penelitian (Tabel 4.1).

Tabel 4.1 Nilai Mean dan SD pada Setiap Kelompok.

Kelompok Kolagen Tipe

IV

Mean SD Nilai Minimal Nilai Maksimal

1 4.00 0.00 4 4

2 1.25 0.50 1 2

3 2.25 1.25 1 4

4 6.25 3.77 1 9

5 5.75 2.36 4 9

(19)

Dari analisis univariat tabel 4.1 di atas, dapat disimpulkan:

1. Ekspresi kolagen tipe IV pada kelompok yang hanya mendapat perlakuan injeksi STZ 60 mg/kgbb/ekor single dose (kelompok 2) menunjukkan hasil lebih rendah dibandingkan kelompok kontrol (kelompok 1) dan kelompok ini memiliki ekspresi terendah dibandingkan kelompok lain.

2. Dijumpai peningkatan ekspresi kolagen tipe IV pada kelompok DM yang diberi curcuminoid (kelompok 3, 4, 5 dan 6) dibandingkan kelompok yang hanya mendapat perlakuan injeksi STZ 60 mg/kgbb/ekor single dose (kelompok 2).

3. Ekspresi kolagen tipe IV pada kelompok mendapat perlakuan injeksi STZ 60 mg/kgbb/ekor single dose, kemudian diberikan curcuminoid

400 mg/kgbb/hari/ekor dimulai hari ke-3 selama 3 hari (kelompok 4) menunjukkan ekspresi yang lebih tinggi dibandingkan kelompok yang mendapat perlakuan injeksi STZ 60 mg/kgbb/ekor single dose, kemudian diberikan curcuminoid 200 mg/kgbb/hari/ekor dimulai hari ke-3 selama 3 hari (kelompok 3) dan ekspresi kolagen tipe IV pada kelompok mendapat perlakuan injeksi STZ 60 mg/kgbb/ekor single dose, kemudian diberikan curcuminoid 400 mg/kgbb/hari/ekor dimulai hari ke-3 selama 8 hari (kelompok 6) menunjukkan ekspresi yang lebih tinggi dibandingkan kelompok yang mendapat perlakuan injeksi STZ 60 mg/kgbb/ekor single dose, kemudian diberikan curcuminoid 200 mg/kgbb/hari/ekor dimulai hari ke-3 selama 8 hari (kelompok 5).

4. Ekspresi kolagen tipe IV pada kelompok mendapat perlakuan injeksi STZ 60 mg/kgbb/ekor single dose, kemudian diberikan curcuminoid

(20)

4.3.3 Analisis bivariat

Analisis bivariat dilakukan untuk menguji hubungan antara variabel independen terhadap variabel dependen, menganalisis kesetaraan antara masing-masing kelompok dan mengetahui perbedaan (penurunan atau peningkatan) yang terjadi pada masing-masing kelompok setelah dilakukan intervensi.

Tabel 4.2 Analisis Bivariat Kelompok 1 dan Kelompok 2. Kelompok Kolagen Tipe IV

Mean SD p. value

1 4.00 0.00

0.011

2 1.25 0.50

Dari analisis tabel 4.2 di atas, dapat disimpulkan bahwa terdapat perbedaan rerata yang bermakna secara statistik (p. value <0.05) antara kelompok kontrol (kelompok 1) dengan kelompok yang hanya mendapat perlakuan injeksi STZ 60 mg/kgbb/ekor single dose (kelompok 2) yaitu terjadi penurunan ekspresi kolagen tipe IV.

2 1.25 0.50

0.155

3 2.25 1.25

Dari analisis tabel 4.3 di atas, dapat disimpulkan bahwa terdapat perbedaan rerata (peningkatan ekspresi kolagen tipe IV) antara kelompok yang hanya mendapat perlakuan injeksi STZ 60 mg/kgbb/ekor single dose

(21)

2 1.25 0.50

0.089

4 6.25 3.77

Dari analisis tabel 4.4 di atas, dapat disimpulkan bahwa terdapat perbedaan rerata (peningkatan ekspresi kolagen tipe IV) antara kelompok yang hanya mendapat perlakuan injeksi STZ 60 mg/kgbb/ekor single dose

(kelompok 2) dengan kelompok yang mendapat perlakuan injeksi STZ 60 mg/kgbb/ekor single dose, kemudian diberikan curcuminoid 400 mg/kgbb/hari/ekor dimulai hari ke-3 selama 3 hari (kelompok 4) namun tidak bermakna secara statistik (p. value >0.05).

2 1.25 0.50

0.010

5 5.75 2.36

Dari analisis tabel 4.5 di atas, dapat disimpulkan bahwa terdapat perbedaan rerata yang bermakna secara statistik (p. value <0.05) antara kelompok yang hanya mendapat perlakuan injeksi STZ 60 mg/kgbb/ekor

single dose (kelompok 2) dengan kelompok yang mendapat perlakuan injeksi STZ60 mg/kgbb/ekor single dose, kemudian diberikan curcuminoid

(22)

2 1.25 0.50

0.015

6 8.25 1.50

Dari analisis tabel 4.6 di atas, dapat disimpulkan bahwa terdapat perbedaan rerata yang bermakna secara statistik (p. value <0.05) antara kelompok yang hanya mendapat perlakuan injeksi STZ 60 mg/kgbb/ekor

single dose (kelompok 2) dengan kelompok yang mendapat perlakuan injeksi STZ60 mg/kgbb/ekor single dose, kemudian diberikan curcuminoid

(23)

BAB V PEMBAHASAN

Penelitian ini dilakukan untuk menjelaskan salah satu mekanisme yang diduga penyebab terjadinya gangguan pendengaran akibat DM dan efek

curcuminoid terhadap perubahan molekuler fibroblas dinding lateral koklea tikus yang mengalami perubahan akibat DM. Informasi yang ditemukan dalam penelitian ini diharapkan dapat menjadi kajian ilmiah dalam melengkapi penelitian yang dilakukan sebelumnya dan memperjelas mekanisme sampai mencegah dan memperbaiki terjadinya kerusakan pada tingkat molekuler.

Pada penelitian ini diberikan perlakuan injeksi STZ 60 mg/kgbb/ekor

single dose yang dapat menimbulkan kerusakan pada fibroblas dinding lateral koklea ditinjau dari ekspresi kolagen tipe IV. Selain itu, penelitian ini juga dilakukan pemberian curcuminoid dalam berbagai dosis dengan harapan dapat mencegah dan memperbaiki kerusakan yang terjadi. Pemecahan masalah penelitian dilakukan dengan menganalisis jalur yang melibatkan ekspresi kolagen tipe IV untuk menjelaskan respon seluler akibat DM dan diberikan curcuminoid.

5.1 Efek Curcuminoid terhadap Ekspresi Kolagen Tipe IV

(24)

dan sel pada jaringan terkait (fibroblas, sel epitel dan sel endotel) akan mengaktifkan MMPs yang akan mengakibatkan kerusakan pada MES dan kolagen (Almeida, et al., 2015). Pada keadaan DM, terdapat sistem plasminogen plasmin yang dapat memecah protein MES seperti kolagen. Selain itu sistem plasminogen plasmin juga dapat meningkatkan risiko tromboemboli dan merupakan faktor penting yang dapat menyebabkan komplikasi vaskuler seperti mikroangiopati diabetik (Kwaan, 1992). Pada penelitian lainnya dilaporkan bahwa keadaan DM berhubungan dengan ketidak seimbangan sistem sirkulasi MMP / Tissue Inhibitors of Metalloproteinase (TIMP), dimana terjadi peningkatan MMP-9 dan TIMP-1 dimana MMP-9 dapat mendegradasi kolagen tipe IV baik pada DM tipe 1 ataupun DM tipe 2 walaupun belum terjadi komplikasi (Ban and Twigg, 2008). Teori-teori di atas mendukung hasil pada penelitian ini dimana telah terjadi degradasi kolagen tipe IV pada fibroblas dinding lateral koklea yang ditunjukkan dengan penurunan ekspresi kolagen tipe IV pada fibroblas dinding lateral koklea pada kelompok DM (kelompok 2) dibandingkan kelompok kontrol (kelompok 1).

Pada penelitian ini, terjadi peningkatan ekspresi kolagen tipe IV (gambar 4.3) pada kelompok DM yang diberi curcuminoid (kelompok 3, 4, 5 dan 6) dibandingkan kelompok DM (kelompok 2). Hal ini mengacu pada penelitian sebelumnya yang melaporkan bahwa curcumin dapat meningkatkan sintesis kolagen seperti pada jaringan luka (Panchatcharam, et al., 2006). Kolagen yang dihasilkan oleh fibroblas mulai bermigrasi ke jaringan luka tiga hari setelah luka muncul dan akan berubah menjadi miofibroblas pada akhir hari ketujuh. Namun curcumin tidak hanya meningkatkan kandungan kolagen, tetapi serat kolagen juga matang lebih awal ketika luka diberikan curcumin (Akbik, et al., 2015). Penelitian sebelumnya melaporkan bahwa curcumin dapat merangsang

(25)

menurunkan ekspresi sitokin / enzim inflamasi seperti MMP-9, sehingga sintesis kolagen lebih bermakna pada penyembuhan luka tikus diabetes (Kant, et al., 2014).

Potensial endokoklea penting dalam fisiologi pendengaran (Mizutari, 2014). Proses transduksi getaran juga penting dalam fisiologi pendengaran dimana getaran yang dapat didengar akan dihantarkan ke impuls syaraf melalui peran sel rambut dalam ketika membran basiler digerakkan oleh gelombang suara (Alberti, 2001). Ketegangan pada membran basiler juga diatur oleh ligamentum spiralis dimana ligamentum spiralis berikatan dengan membran basiler. Ketegangan tersebut akibat ketegangan sel fibroblas pada ligamentum spiralis yang mengandung protein kontraktil. Dalam hal ini kolagen sangat berperan dalam mengatur pergerakan dan elastisitas membran basiler untuk proses transduksi suara (Raphael and Altschuler, 2003). Berdasarkan salah satu manfaat kolagen dalam proses transduksi suara yang disebutkan sebelumnya, kami mendapatkan pemberian curcuminoid mampu meningkatkan ekspresi kolagen tipe IV pada fibroblas dinding lateral koklea (kelompok 3, 4, 5 dan 6) dibanding kelompok DM yang tidak diberi curcuminoid (kelompok 2) dimana pada kelompok ini terjadi penurunan ekspresi dibandingkan kelompok kontrol (kelompok 1). Hal ini menunjukkan bahwa curcuminoid

mampu mencegah dan memperbaiki kerusakan kolagen tipe IV pada sel fibroblas dinding lateral koklea akibat DM.

(26)

curcumin bekerja sebagai nephroprotective pada tikus (Molina-Jijón, et al., 2011). Penelitian lain melaporkan bahwa penggunaan curcumin telah diteliti hingga dosis 2000 mg/hari tanpa efek samping yang jelas (Gaedake, Noble and Border, 2005). Berdasarkan penelitian-penelitian tersebut, kami meneliti perbandingan efek curcuminoid dosis 200 mg/kgbb/hari/ekor dengan curcuminoid dosis 400 mg/kgbb/hari/ekor selama 8 hari karena dinggap aman pada tikus. Dikarenakan dosis tersebut terbukti aman, maka kami juga melakukan penelitian dengan waktu yang lebih singkat yaitu selama 3 hari.

Pada analisis statistik yang kami lakukan dapat disimpulkan bahwa pemberian curcuminoid dengan dosis 200 mg/kgbb/hari/ekor dan

curcuminoid dosis 400 mg/kgbb/hari/ekor selama 3 hari (kelompok 3 dan 4) sudah dapat meningkatkan ekspresi kolagen tipe IV pada fibroblas dinding lateral koklea tikus model DM dibanding kelompok DM yang tidak diberi curcuminoid (kelompok 2), namun peningkatan ekspresi tidak terjadi signifikan secara statistik. Terjadi peningkatan ekspresi yang signifikan secara statistik pada pemberian curcuminoid dengan dosis 200 mg/kgbb/hari/ekor dan curcuminoid dosis 400 mg/kgbb/hari/ekor selama 8 hari (kelompok 5 dan 6) dibanding kelompok DM yang tidak diberi

curcuminoid (kelompok 2). Hal ini menerangkan bahwa pemberian

curcuminoid dengan dosis 200 mg/kgbb/hari/ekor dan curcuminoid dosis 400 mg/kgbb/hari/ekor selama 8 hari lebih baik dibandingkan pemberian selama 3 hari dalam mencegah dan memperbaiki kerusakan sel fibroblas dinding lateral koklea akibat DM melalui mekanisme ekspresi kolagen tipe IV.

5.2 Keterbatasan Penelitian

(27)

BAB VI

KESIMPULAN DAN SARAN

6.1 Kesimpulan

1. Penelitian ini melaporkan adanya penurunan ekspresi kolagen tipe IV yang bermakna secara statistik (p<0.05) pada fibroblas dinding lateral koklea Rattus norvegicus model DM (diberi injeksi STZ 60 mg/kgbb/ekorsingle dose) dibandingkan kontrol.

2. Penelitian ini melaporkan bahwa curcuminoid mampu mencegah dan memperbaiki kerusakan fibroblas pada dinding lateral koklea Rattus norvegicus model DM (diberi injeksi STZ 60 mg/kgbb/ekor single dose) berdasarkan peningkatan ekspresi kolagen tipe IV.

3. Penelitian ini melaporkan bahwa curcuminoid 400 mg/kgbb/hari/ekor mampu mencegah dan memperbaiki kerusakan fibroblas dinding lateral koklea Rattus norvegicus model DM (diberi injeksi STZ 60 mg/kgbb/ekor single dose) lebih baik dibandingkan curcuminoid 200 mg/kgbb/hari/ekor berdasarkan peningkatan ekspresi kolagen tipe IV. 4. Penelitian ini melaporkan bahwa lama waktu pemberian curcuminoid

selama 8 hari lebih baik dibandingkan pemberian curcuminoid selama 3 hari pada Rattus norvegicus model DM (diberi injeksi STZ 60 mg/kgbb/ekor single dose) berdasarkan peningkatan ekspresi kolagen tipe IV pada fibroblas dinding lateral koklea Rattus norvegicus.

6.2 Saran

Penelitian ini merupakan penelitian baru yang membahas efek

curcuminoid terhadap komplikasi DM pada fibroblas dinding lateral koklea

(28)

1. Perlu pembuktian lebih lanjut yang mengindikasikan adanya gangguan pendengaran tipe sensorineural yang disebabkan perubahan ekspresi protein pada fibroblas dinding lateral koklea Rattus norvegicus model DM dan efek pemberian curcuminoid.

2. Curcuminoid sudah terbukti dapat meningkatkan ekspresi kolagen tipe IV pada fibroblas dinding lateral koklea tikus model DM. Pada penelitian lanjutan dari penelitian ini diharapkan curcuminoid mampu mencegah dan berpotensi dalam perbaikan fibroblas dinding lateral koklea pada manusia yang mengalami DM, sehingga curcuminoid