PENAPISAN MIKROB PENDEGRADASI
2-(3-BENZOILFENIL)-PROPIONITRIL DAN KARAKTERISASI NITRILASE
DARI ISOLAT TERPILIH
DEWI SUPARIASIH
PROGRAM STUDI BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2008
2
ABSTRAK
DEWI SUPARIASIH. Penapisan Mikrob Pendegradasi
2-(3-Benzoilfenil)-Propionitril dan Karakterisasi Nitrilase dari Isolat Terpilih. Dibimbing oleh I MADE ARTIKA dan BAMBANG SUNARKO.
Nitril merupakan kelompok senyawa yang toksik karena mengandung gugus CN dalam strukturnya. Senyawa tersebut bersifat karsinogenik, teratogenik, dan mutagenik, sehingga pengetahuan tentang biodegradasi nitril dinilai sangat penting. Senyawa nitril dapat didegradasi dengan tiga macam enzim, yaitu nitrilase (EC 3.5.5.1), NHase (nitril hidratase) (EC 4.3.2.84), dan amidase (EC 3.5.1.4). Nitrilase akan mendegradasi nitril menjadi asam karboksilat dan amonia. Penelitian ini bertujuan mendapatkan isolat mikrob yang dapat menghasilkan nitrilase dan juga bertujuan mengkarakteristik nitrilase dari isolat yang terpilih.
Isolat yang terpilih setelah proses penapisan, yaitu isolat yang mempunyai aktivitas enzim tertinggi dan dapat tumbuh baik dalam asetonitril ialah TPIK 2000. TPIK 2000 yang ditumbuhkan memiliki waktu generasi (td) selama 15 jam dan konstanta laju pertumbuhan (µ) sebesar 0,0476 jam-1. Penentuan karakteristik enzim yang meliputi pH, suhu, Km, dan Vmaks dilakukan dengan menentukan aktivitas enzim dalam sel utuh. Enzim yang didapat dari sel TPIK 2000 memiliki suhu dan pH optimum bagi aktivitasnya pada suhu 25 °C dan pH 7,2 dengan aktivitas enzim masing-masing sebesar 1,1524 U/mL dan 1,2624 U/mL. Energi aktivasi saat kecepatan reaksi maksimum sebesar 0,0357 kJ/mol. Nilai Km dan
Vmaks nitrilase berturut-turut sebesar 1,6970 mM dan 894,2976 µM/mL.min.
3
ABSTRACT
DEWI SUPARIASIH. Screening of 2-(3-Benzoylphenyl)-Propionitrile-Degrading Microbes and Characterization of Nitrilase from a Selected Isolate. Under the direction of I MADE ARTIKA and BAMBANG SUNARKO.
Nitrile is classified as a toxic compound due to the structure contains CN-group. The compound is carcinogenic, teratogenic, and mutagenic, thus information on nitrile biodegradation is very important. Nitrile can be degradated by three enzymes, nitrilase (EC 3.5.5.1), NHase (nitrile hidratase) (EC 4.3.2.84), and amidase (EC 3.5.1.4). Nitrilase catalyses the hydrolysis of nitriles into carboxylic acids and ammonia. The aim of the research is to obtain nitrilase-producing microbes and to determine the nitrilase characteristic from a selected isolate.
The selected isolate after screening was TPIK 2000, the isolate with the highest activity of enzyme and can grow on acetonitrile. The generation time (td) and growth rate constant (µ) of TPIK 2000 was 15 hours and 0,0476 h-1 respectively. Enzymes activity assay was carried out using whole cells to determine characteristic of enzymes (pH, temperature, Km, and Vmax). Enzymes obtained from TPIK 2000 cell showed the optimum temperature and pH of 25 °C and pH 7,2 with enzymes activity was 1,1524 U/mL and 1,2624 U/mL respectively. Activation energy in maximum reaction rate was 0,0357 kJ/mol. Km
and Vmax of nitrilase was 1,6970 mM and 894,2976 µM/mL.min respectively.
4
PENAPISAN MIKROB PENDEGRADASI
2-(3-BENZOILFENIL)-PROPIONITRIL DAN KARAKTERISASI NITRILASE
DARI ISOLAT TERPILIH
DEWI SUPARIASIH
Skripsi
sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Sains pada
Program Studi Biokimia
PROGRAM STUDI BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2008
5
Judul Skripsi : Penapisan Mikrob Pendegradasi 2-(3-Benzoilfenil)-Propionitril dan Karakterisasi Nitrilase dari Isolat Terpilih
Nama : Dewi Supariasih NIM : G44104052
Disetujui
Dr. Ir. I Made Artika, M.App., Sc.
Dr. Ir. Bambang Sunarko Ketua Anggota
Diketahui
Dr. drh. Hasim, DEA
Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
6
PRAKATA
Alhamdulillah, segala puji bagi Allah SWT yang selalu memberikan rahmat bagi makhluk-Nya dan atas ridho-Nya sehingga penelitian ini dapat diselesaikan. Penelitian dengan judul Penapisan Mikrob Pendegradasi 2-(3-Benzoilfenil)-Propionitril dan Karakterisasi Nitrilase dari Isolat Terpilih dilaksanakan pada bulan Februari sampai dengan bulan Agustus 2008 di Laboratorium Biokimia Mikrob, Bidang Mikrobiologi, Puslit Biologi, LIPI Cibinong. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) yang telah mendanai kegiatan penelitian ini.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Dr. Ir. I Made Artika, M.App., Sc dan Dr. Ir. Bambang Sunarko yang telah membimbing penulis selama melakukan penelitian dan menyelesaikan penulisan laporan ini. Terima kasih untuk Pak Edi M dan teman-teman biokimia 41. Terima kasih untuk Intan, Ela, Auline, Tyas, Hanifah, Fitri, Safety dan Ine atas doa dan persahabatan yang terjalin. Ucapan terima kasih juga penulis haturkan kepada teknisi dan staf Laboratorium Biokimia Mikrob, Bidang Mikrobiologi, Puslit Biologi, LIPI Cibinong. Ucapan terima kasih terdalam penulis haturkan untuk kedua orang tua dan kakak tercinta, Mas Anto, untuk segala perhatian dan kasih sayang serta doa yang tulus. Semoga hasil dari penelitian ini dapat bermanfaat bagi semua pihak.
Bogor, September 2008
Dewi Supariasih
7
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 21 Januari 1987 dari pasangan Bapak Toeparno dan Ibu Suwarni. Penulis merupakan anak kedua dari dua bersaudara. Tahun 2004 penulis lulus dari SMUN 77 Jakarta dan pada tahun yang sama penulis lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru (SPMB) pada Program Studi Biokimia, Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama di IPB, penulis aktif di organisasi himpunan keprofesian Community of Research and Education in Biochemistry (CREBs) dan menjadi panitia dalam berbagai kegiatan BEM, seperti panitia Masa Perkenalan Fakultas dan Departemen, panitia Kompetisi Sains SMA-PESTA SAINS Nasional 2007, dan berbagai kegiatan lainnya. Selama mengikuti perkuliahan penulis pernah menjadi asisten praktikum untuk mata ajaran Biokimia Umum tahun ajaran 2007/2008 untuk mahasiswa Biologi dan Teknologi Hasil Perikanan, mata ajaran Pengantar Penelitian Biokimia tahun ajaran 2007/2008 untuk mahasiswa Biokimia, dan mata ajaran Biokimia untuk mahasiswa Akademi Kebidanan. Penulis mengikuti praktik lapangan dengan judul Penapisan Mikrob Penghasil Enzim untuk Biotransformasi Senyawa Nitril di Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Cibinong di bidang Mikrobiologi.
8
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR GAMBAR ... xi DAFTAR LAMPIRAN ... xi PENDAHULUAN TINJAUAN PUSTAKA Nitril... 1
Enzim Pendegradasi Nitril dan Nitrilase (E.C.3.5.5.1)... 1
Karakteristik Enzim... 2
Kinetika Enzim... 3
Fermentasi... 3
Biotransformasi Nitril... 4
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat... 4
Metode... 4
HASIL DAN PEMBAHASAN Penapisan Mikrob Penghasil Nitrilase... 6
Fermentasi Isolat TPIK 2000... 6
Pengaruh Suhu Terhadap Aktivitas Nitrilase dalam Sel Uuh... 7
Pengaruh pH Terhadap Aktivitas Nitrilase dalam Sel Utuh... 8
Km dan Vmaks Nitrilase pada Sel TPIK 2000... 8
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan... 9
Saran... 9
DAFTAR PUSTAKA... 9
LAMPIRAN...11
9
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Sintesis sianida dalam suasana asam... 1
2 Sintesis sianida dalam suasana basa... 1
3 Biokonversi senyawa nitril oleh nitrilase, amidase, dan NHase... 1
4 Kurva pertumbuhan mikrob... 3
5 Biokonversi nitril dengan bantuan mikrob... 4
6 Pola dan pH pertumbuhan TPIK 2000 dalam asetonitril dan logaritma jumlah bakteri terhadap waktu... 6
7 Pengaruh suhu terhadap aktivitas nitrilase dalam sel utuh... 7
8 Hubungan antara kecepatan maksimum reaksi (V) dan suhu (T)... 7
9 Pengaruh pH terhadap aktivitas nitrilase dalam TPIK 2000... 8
10 Pengaruh konsetrasi substrat terhadap kecepatan reaksi nitrilase... 8
11 Kurva Lineweaver-Burk nitrilase... ... 9
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Tahapan penelitian... ... 12
2 Penapisan mikrob penghasil nitrilase………. 13
3 Analisis NH4+ dengan metode Nessler (Svehla 1979) pada panjang gelombang 403 nm dan kurva standar NH4+…... 14
4 Penentuan kadar protein dengan metode Biuret (Layne 1957)... 15
5 Kurva standar protein dan sampel protein... 16
6 Pola pertumbuhan TPIK 2000 dalam asetonitril 100 mM... 17
7 Pengaruh suhu terhadap aktivitas nitrilase pada sel TPIK 2000... 18
8 Pengaruh pH terhadap aktivitas nitrilase pada sel TPIK 2000...19
9 Pengaruh substrat terhadap kecepatan enzimatik pada penentuan Km dan Vmaks... 20
10 Waktu inkubasi optimum nitrilase pada TPIK 2000………… ... 21
11 Pembuatan pereaksi………. 21
PENDAHULUAN
Nitril merupakan kelompok senyawa yang toksik karena mengandung gugus CN dalam
strukturnya. Senyawa tersebut bersifat
karsinogenik, teratogenik, dan mutagenik, sehingga pengetahuan tentang biodegradasi nitril dinilai sangat penting. Sampai saat ini telah banyak penelitian tentang eksploitasi mikrob pendegradasi senyawa nitril dan lintasan reaksi tersebut untuk memproduksi senyawa organik bernilai ekonomis tinggi.
Senyawa organik tersebut antara lain
linamarin (Sorokin et al. 2007), alanin (Pace & Brenner 2001), dan asam salisilat (Zhu et
al. 2007).
Beberapa strain mikrob pendegradasi senyawa nitril yang telah ditemukan antara lain Agrobacterium (Wieser et al. 1997, Pace & Brenner 2001), Pseudomonas (Layh & Willette 1998, Pace & Brenner 2001),
Natronocella, Acetinitrilica (Sorokin et al.
2007), dan Gordona terrae (Favre-bulle et al. 1998). Senyawa nitril dapat didegradasi dengan tiga macam enzim, yaitu nitrilase (EC
3.5.5.1), NHase (nitril hidratase) (EC
4.3.2.84), dan amidase (EC 3.5.1.4).
Enzim dapat diukur secara kinetika
berdasarkan katakteristiknya. Aktivitas
katalitik enzimatik dipengaruhi oleh beberapa faktor, yaitu konsentrasi enzim, konsentrasi substrat, suhu, pH, dan inhibitor serta aktivator. Kecepatan reaksi ini dapat diketahui dengan menentukan kinetika kerja enzim, yaitu dengan mencari nilai Km dan kecepatan maksimum (Vmaks) enzim.
Isolat mikrob yang terpilih untuk
karakteristik nitrilase didapatkan melalui proses penapisan. Penapisan mikrob ini
didasarkan dari aktivitas enzim dan
pertumbuhannya dalam senyawa nitril. Isolat
yang berpotensi menghasilkan enzim
(nitrilase) akan menghasilkan asam
karboksilatnya dan amonia melalui proses biokonversi.
Berdasarkan hasil percobaan sebelumnya,
telah banyak mikrob yang mampu
mendegradasi senyawa-senyawa nitril, seperti
asetonitril, benzonitril, asetamida, dan
benzamida. Penelitian ini bertujuan
mendapatkan isolat mikrob yang dapat menghasilkan enzim (nitrilase). Selain itu juga bertujuan mengkarakterisasi nitrilase dari isolat terpilih, yang mencakup pertumbuhan, pH dan suhu optimum, Km dan Vmaks. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah mengenai isolat mikrob
penghasil nitrilase. Hipotesis yang
mendukung penelitian ini ialah diperolehnya paling tidak satu isolat yang mempunyai aktivitas enzim yang tinggi.
TINJAUAN PUSTAKA
Nitril
Nitril adalah senyawa kimia yang
mengandung gugus siano (C=N), dengan atom karbon terikat-tiga pada atom nitrogen. Kelompok CN dapat ditemukan dalam banyak senyawa. Beberapa senyawa diantaranya berupa gas dan lainnya berupa zat padat atau cair. Gugus siano terdapat juga dalam bentuk garam dan polimer dan juga ada yang bersifat kovalen, molekuler, dan ionik (Hart, Craine, Hart 2003).
Ikatan rangkap tiga karbon-nitrogen dari sianida organik (nitril) dapat dihidrolisis
menjadi gugus karboksil. Reaksi ini
berlangsung dalam keadaan asam maupun basa. Bila dalam suasana asam atom nitrogen dari sianida dikonversi menjadi ion amonium (Gambar 1), sedangkan dalam suasana basa, nitrogen dikonversi menjadi amonia dan produk organik, yaitu garam karboksilat, yang perlu dinetralkan dalam langkah terpisah menjadi asam (Gambar 2) (Hart, Craine, Hart 2003).
R-C=N + 2H2O R-COOH + NH4+ + Cl-
Gambar 1 Sintesis sianida dalam suasana asam.
R-C=N + 2H2O R-COONa + NH3
Gambar 2 Sintesis sianida dalam suasana basa.
Enzim Pendegradasi Nitril dan Nitrilase (EC 3.5.5.1)
Secara umum terdapat dua reaksi hidrolisis senyawa nitril dengan menggunakan aktivitas mikrob yang dapat dilihat pada Gambar 3.
Reaksi pertama, nitrilase (EC 3.5.5.1)
mengubah senyawa nitril menjadi asam karboksilat dan amonia secara langsung. Reaksi kedua, NHase (nitril hidratase) (EC 4.3.2.84) mengubah senyawa nitril menjadi amida dan dilanjutkan oleh amidase (EC 3.5.1.4) yang mengubah menjadi asam karboksilat dan amonia (Ciskanik et al 1995).
Umumnya, nitrilase aktif terhadap
senyawa nitril aromatik, sedangkan NHase cenderung aktif terhadap senyawa nitril
HCl
