13 III. METODE PENELITIAN
3.1 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Teknologi Pangan, Fakultas Pertanian Peternakan, Universitas Muhammadiyah Malang. Waktu penelitian dilaksanakan pada bulan September 2020 sampai dengan bulan Agustus 2021.
3.2 Alat dan Bahan
Alat-alat untuk penelitian, antara lain: alumunium foil, kertas whatman no.
41, baskom, pisau, gelas ukur, beaker glass, batang pengaduk, termometer, botol kaca gelap, corong buchner, mortal-martil, loyang, panci, wajan, peniris minyak, kompor gas, spatula, timbangan analitik, penyaring pompa vakum, cabinet dryer, rotary evaporator, dan showcase. Alat-alat untuk analisa, antara lain: alumunium foil, yellow tip, tube, labu ukur, beaker glass, gelas ukur, tabung reaksi, erlenmeyer, corong kaca, botol kaca gelap, pipet ukur, batang pengaduk, mortal- martil, cawan, desikator, ruber bulb, rak tabung, sarung tangan kain, sarung tangan karet, spatula, mikropipet, vortex, timbangan analitik, waterbath, centrifuge, oven sterilisator, pH meter, showcase, dan spektrofotometer uv-vis.
Bahan-bahan untuk penelitian, antara lain: batang dan bunga brokoli segar, berwarna hijau (Brassica oleraceae) yang diperoleh dari Pasar Landungsari, Dau, Kabupaten Malang, aquades (H2O), etanol 96% (C2H5OH), n-heksana (C6H14) p.a, etil asetat (C4H8O2) p.a, dan nitrogen (N). Bahan-bahan untuk analisa, antara lain:
aquades (H2O), etanol 96% (C2H5OH), 2.2-diphenyl-1-pycrilhidrazil (DPPH), feri sianida (FeCl3) p.a, sodium asetat (CH3COONa) teknis, alumunium klorida (AlCl3)p.a, sodium hidroksida (NaOH) teknis, kuersetin (C15H10O7), Bovin Serum Albumin (BSA) 1%, dan disodium fosfat (Na2HPO4) p.a.
3.3 Metode Penelitian
Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian adalah rancangan nested. Rancangan nested terdiri dari 2 faktor, yakni faktor penyarang adalah bagian brokoli (B), terdiri dari batang (B1) dan bunga (B2), serta faktor tersarang adalah pre-treatment (P), terdiri dari segar (P1), blanching (P2), dan frying (P3).
Desain rancangan nested sebagaimana ditampilkan pada Gambar 3.
14 Gambar 3. Desain Rancangan Nested
Penelitian ini diulang sebanyak 3 kali, sehingga total terdapat 18 unit percobaan. Adapun variabel percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut:
1. Variabel Bebas
Variabel bebas yang digunakan dalam penelitian ini adalah bagian brokoli (batang, bunga) dan pre-treatment (segar, blanching, frying).
2. Variabel Terikat
Variabel terikat yang digunakan dalam penelitian ini adalah kadar air, rendemen, total flavonoid, aktivitas antioksidan dan antiinflamasi.
3. Variabel Kontrol
Variabel kontrol yang digunakan dalam penelitian ini adalah varietas dan umur panen brokoli.
3.4 Pelaksanaan Penelitian
3.4.1 Proses Pembuatan Simplisia Batang dan Bunga Brokoli
Penelitian dilakukan terhadap batang dan bunga brokoli yang diperoleh dari Pasar Landungsari, Dau, Kabupaten Malang. Sampel tersebut dikumpulkan dan dicuci dengan air mengalir untuk menghilangkan kotoran-kotoran yang menempel. Selanjutnya, dilakukan pre-treatment (segar, blanching, frying) terhadap sampel (batang, bunga brokoli). Blanching menggunakan metode water blanching pada suhu 70oC selama 7 menit, sedangkan frying menggunakan metode deep frying dengan sebelumnya sampel telah diberikan tepung. Memasuki tahap pengeringan, sampel dikeringkan dengan menggunakan cabinet dryer pada suhu 50oC selama 72 jam. Setelah kering, dilanjutkan penghalusan menggunakan mortal-martil sehingga dihasilkan serbuk sampel/simplisia. Serbuk simplisia tersebut diambil sedikit untuk keperluan analisis kadar air. Adapun diagram alir pembuatan serbuk simplisia sebagaimana ditampilkan pada Gambar 4.
P2
P1 P3
B2
B1
P1 P2 P3
15 Gambar 4. Diagram Alir Pembuatan Simplisia dengan pre-treatmetn pada Batang
dan Bunga Brokoli (Sumber: Khoerunisa, 2018).
3.4.2 Proses Ekstraksi Metode Maserasi Simplisia Batang dan Bunga Brokoli Proses ekstraksi menggunakan metode maserasi karena sederhana, murah, dan tidak perlu pemanasan sehingga senyawa-senyawa aktif tidak rusak atau tidak terurai (Khoerunisa, 2018). Proses ekstraksi diawali dengan cara serbuk simplisia 40 gram dimasukkan ke dalam botol kaca gelap dan ditambahkan dengan pelarut etanol 96% sebanyak 200 mL. Etanol dipilih karena mampu melarutkan senyawa polar dan beberapa senyawa nonpolar. Pada 6 jam pertama dilakukan pengocokan, kemudian didiamkan selama 18 jam berikutnya. Proses ini dilakukan berulang
Batang/bunga brokoli
Pencucian
Pengecilan ukuran
Water Blanching (t = 7menit, T=70oC)
Segar Penambahan tepung
Penggorengan (7 menit , T=100oC)
Pengeringan (T: 50oC, t: 72 jam)
Penghalusan
Bubuk simplisia
Analisa :
Kadar air, Rendemen, Antioksidan, Flavonoid Antiinflamasi
16 selama 3 hari. Proses penyaringan menggunakan penyaring pompa vakum dan kertas whatman no. 41. Sebelumnya, ampas yang ada dilakukan remaserasi sebanyak 2 kali. Filtrat dipisahkan dari pelarut etanol 96% dengan menggunakan rotary evaporator pada suhu 55oC. Adapun diagram alir proses ekstraksi simplisia batang dan bunga brokoli sebagaimana ditampilkan pada Gambar 4.
3.5 Prosedur Analisis
3.5.1 Prosedur Analisis Kadar Air (AOAC, 2005 dalam Ukhty, 2017) 1. Cawan dikeringkan dengan oven pada suhu 100-105°C selama 24 jam.
2. Cawan didinginkan pada suhu ruang dan dalam desikator selama 15 menit, kemudian cawan ditimbang.
3. Sampel dihaluskan, kemudian ditimbang 2 gram dalam cawan kering.
4. Cawan berisi sampel dioven pada suhu 100-105°C selama 6 jam.
5. Cawan berisi sampel didinginkan pada suhu ruang, dan dalam desikator selama 15 menit, kemudian ditimbang.
6. Kadar air dihitung dengan menggunakan rumus:
Keterangan :
A: berat cawan + sampel (gram) B: berat sampel (gram)
C: berat cawan + sampel kering (gram)
3.5.2 Prosedur Analisis Rendemen (Kusnadi, 2017)
1. Penimbangan ekstrak brokoli untuk mendapatkan berat awal.
2. Hasil ekstrak brokoli setelah didalam nitrogen dilakukan penimbangan kembali untuk mendapatkan berat akhir.
3. Rendemen dihitung dengan rumus:
Keterangan :
A: berat ekstrak pekat (gram) B: berat simplisia (gram)
17 3.5.3 Prosedur Analisis Aktivitas Antioksidan DPPH (Maesaroh, 2018)
1. Pembuatan Larutan DPPH 0,25 mM.
a. Sebanyak 5 gram DPPH dimasukkan dalam labu ukur 50 mL.
b. Pelarut etanol 96% dimasukkan dalam labu ukur berisi DPPH tersebut hingga batas tera dan kemudian homogenkan.
c. Sehingga diperoleh larutan DPPH dengan konsentrasi 0,25 mM.
d. Larutan DPPH disimpan dalam ruang tertutup dan dikeluarkan saat akan digunakan untuk keperluan penelitian.
2. Penetapan larutan Blanko
a. Sebanyak 1 mL larutan DPPH 0,25 mM dimasukkan dalam tabung reaksi yang berlapis alumunium foil.
b. Tambahkan dengan 4 mL etanol 96% dan setelah itu homogenkan dengan menggunakan vortex.
c. Inkubasi pada suhu ruang dan ruang gelap selama 30 menit.
d. Absorbansi larutan blanko diukur menggunakan instrumen Spektrofotometer UV pada pada λ 517 nm.
e. Hasil absorbansi yang muncul di monitor kemudian dicatat.
3. Penetapan Aktivitas Antioksidan
a. Sebanyak 9 mL etanol dimasukkan pada tabung reaksi yang telah berisi 1 gram sampel.
b. Larutan dihomogenkan tersebut dengan menggunakan vortex.
c. Larutan disentrifugasi dengan kecepatan 4000 rpm selama 10 menit untuk memisahkan ekstrak.
d. Supernatan diambil 4 mL dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi berlapis alumunium foil yang telah berisi 1 ml larutan DPPH 0,25 mM.
e. Campuran diinkubasi pada suhu ruang dan ruang gelap selama 30 menit.
f. Absorbansi larutan sampel diukur menggunakan instrumen Spektrofotometer UV pada pada λ 517 nm.
f. Hasil absorbansi yang muncul di monitor kemudian dicatat.
g. Persentase aktivitas antioksidan dihitung dengan menggunakan rumus:
18 Keterangan:
Abs. blanko: serapan radikal DPPH
Abs. sampel: serapan sampel dalam radikal DPPH (Tristantini, 2016)
3.5.4 Prosedur Analisis Total Flavonoid (Haeria, 2016) 1. Pembuatan Larutan Reagen
a. Pembuatan Larutan AlCl3 10%
Sebanyak 1 gram AlCl3 dilarutkan dengan aquades dalam labu ukur 10 mL dan dicukupkan hingga tanda tera.
b. Pembuatan Larutan CH3COONa 1 M
Sebanyak 0,8203 gram CH3COONadilarutkan dengan aquades dalam labu ukur 10 mL, dicukupkan hingga tanda tera sehingga diperoleh larutan CH3COONa1 M (Mr CH3COONa = 82,03) .
2. Pembuatan Larutan dan Kurva Standar
a. Sebanyak 0,010 gram kuersetin dilarutkan dalam labu ukur 10 mL dengan etanol 96%, dicukupkan hingga batas tera sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 1.000 g/mL.
b. Larutan standar kuersetin 1.000 g/mL diencerkan dengan etanol 96%
menjadi konsentrasi 100 g/mL dalam labu ukur 50 mL dengan diambil sebanyak 5 mL.
c. Larutan standar kuersetin 100 g/mL diencerkan dengan etanol 96%
menjadi konsentrasi 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, dan 70 g/mL masing- masing dalam labu ukur 10 mL dengan diambil sebanyak 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, dan 7 mL larutan.
d. Masing-masing konsentrasi standar tersebut diambil sebanyak 0,5 mL, kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi.
e. Larutan standar ditambahkan dengan 0,1 mL AlCl3 10%, 0,1 mL CH3COONa 1 M, dan aquades 2,8 mL, lalu diinkubasi selama 30 menit pada suhu ruang.
f. Larutan standar tersebut diukur serapan dengan instrumen spektrofotometer UV-Vis (λ=438 nm).
19 g. Berdasarkan absorbandi larutan kebudian digunakan untuk membuat kurva hubungan antara konsentrasi dengan absorbansi larutan. Kriteria penerimaan koefisien korelasi adalah r ≥ 0,95
3. Pengukuran Kadar Total Flavonoid Sampel
a. Sebanyak 0,050 gram sampel dilarutkan dengan etanol 96% dalam labu ukur 10 mL, dicukupkan hingga tanda tera sehingga terbentuk larutan sampel konsentrasi 5.000 g/mL.
b. Larutan sampel tersebut diambil sebanyak 0,5 mL, kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi.
c. Larutan standar kemudian ditambahkan dengan 0,1 mL AlCl3 10%, 0,1 mL CH3COONa 1 M, dan aquades 2,8 mL, lalu diinkubasi selama 30 menit pada suhu ruang.
d. Larutan yang telah diabsorbandu kemudian diukur serapan pada λ=438 nm dengan menggunakan instrumen spektrofotometer UV-Vis.
e. Konsentrasi flavonoid (x) dihitung dari persamaan garis pada kurva standar yaitu y = bx + a, dengan y adalah nilai absorbansi, x adalah konsentrasi flavonoid, dan R adalah koefisien regresi linier.
f. Jumlah kuantitatif flavonoid dalam sampel (x) ditentukan menggunakan kurva standar. Kandungan flavonoid sampel dinyatakan sebagai gQAE/mg bahan. Rumus perhitungan total flavonoid adalah sebagai berikut.
Keterangan :
x: konsentrasi flavonoid ( g/mL) m: berat sampel (mg) v: volume kuvet (mL)
3.5.5 Prosedur Analisis Aktivitas Antiinflamasi (Bindu, 2015) 1. Pembuatan Larutan BSA (Bovin Serum Albumin) 1%
a. Sebanyak 1 gram serbuk BSA ditimbang, masukan kedalam gelar beker.
b. BSA yang telah ditimbang, kemudian ditambahkan dengan 100 mL aquades, kemudian dihomogenkan
c. Larutan BSA 1% disimpan pada suhu ruang, kemudian siap untuk digunakan.
20 2. Pembuatan Larutan Buffer Phospat pH 6,9 ; 0,1 M
a. Sebanyak 1,43 g Na2HPO4 (268 g/mol) ditimbang, kemudian dimasukkan ke dalam Erlenmeyer
b. Na2HPO4 yang telah ditimbang kemudian ditambahkan 0,644 g Na2HPO4 (138 g/mol), diatur rata.
c. Campuran yang telah diataduk rata kemudian diitambahkan 100 ml aquades dan dihomogenkan
d. Larutan tersebut kemudian diukur pH menggunakan pH meter.
3. Analisis Aktivitas Antiinflamasi
a. Sampel sebanyak 50 μl dimasukkan dalam tabung reaksi.
b. Larutan BSA 1% ditambahkan sebanyak 450 μl.
c. waterbath.
d. Sampel dipanaskan waterbath.
e. Sampel yang akan diuji didinginkan dalam suhu ruang.
f. Sampel ditambahkan 2,5 ml buffer fosfat pH 6,9; 0,1 M.
g. Absorbansinya diukur pada panjang gelombang λ= 278 nm dan dihitung dengan menggunakn rumus:
Keterangan :
A: absorbansi kontrol B: absorbansi sampel
3.6 Pengolahan Data Penelitian
Pengolahan data penelitian dilakukan secara statistik parametrik dengan menggunakan Analysis of Variance Test (ANOVA). Data yang didapat jika berpengaruh nyata (p < 0,05) atau berpengaruh sangat nyata (p < 0,01) dilanjutkan dengan uji lanjut Tukey dengan taraf kepercayaan 95%. Penyimpulan hasil penelitian berdasarkan hasil uji ANOVA dan uji lanjut Tukey dengan kepercayaan 95%. Analisis data dilakukan menggunakan program Minitab versi 19.
