Kanker payudara merupakan kanker yang menjadi penyebab kematian kedua pada wanita di dunia. Reseptor estrogen alfa (REα) yang berikatan dengan estrogen adalah pemicu proliferasi pada sel kanker payudara, oleh karena itu REα merupakan salah satu target untuk terapi kanker payudara. Penelitian ini bertujuan untuk menguji secara in silico kemampuan senyawa quinocide sebagai ligan REα dan mengetahui pose ikatan quinocide pada REα. Uji in silico dilakukan menggunakan metode penambatan Penapisan Virtual Berbasis Struktur (PVBS) dengan protokol Setiawati et al. (2014) yang telah dimodifikasi oleh Istyastono (2015) dan divisualisasikan dengan PyMol versi 1.8.4.
Breast cancer is the second major cause of women’s death in the world. Estrogen receptor alpha (ERα) that binds to estrogen is a trigger of proliferation in breast cancer cells. Therefore, ERα was one of targets used in breast cancer therapy. The aim of this study was to carry out in silico test by examining the ability of the quinocide as a ligand for ERα and to determine the binding pose of quinocide on ERα. The in silico test was performed using Structure Based Virtual Screening (SBVS) method utilizing protocol developed by Setiawati et al. (2014) which had been appended by Istyastono (2015) and visualized by PyMOL version 1.8.4.
The results showed that quinocide inactive ligand for ERα. Quinocide has no interaction with GLY521. Therefore, the quinocide should be modified into new model that can interact with GLY521 residues.
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Fenny Marisza Sihaloho
NIM: 138114128
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
i
UJI IN SILICO SENYAWA QUINOCIDE SEBAGAI LIGAN PADA RESEPTOR ESTROGEN ALFA
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Fenny Marisza Sihaloho
NIM: 138114128
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA
iv
HALAMAN PERSEMBAHAN
“
See what great love the Father has given us in naming
us the children of God; and such we are. For this
reason the world does not see who we are, because it
did not see who he was.
”
-
1 John 3:1
KARYA INI KUPERSEMBAHKAN UNTUK TUHAN YESUS, KEDUA ORANG TUA, SANAK SAUDARA KELUARGA SIHALOHODAN GURNING,
vii PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa, Karena atas berkat, rahmat, dan cinta kasih-Nya, penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Uji In Silico Senyawa Quinocide sebagai Ligan pada Reseptor Estrogen
Alfa” sebagai syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) di Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
Pada penyusunan naskah, penulis hendak menyampaikan ungkapan terimakasih kepada banyak pihak yang telah membantu dalam penyusunan naskah penelitian ini. Ungkapan terimakasih ini disampaikan kepada:
1. Enade Perdana Istyastono, Ph.D., Apt. selaku dosen pembimbing yang tiada henti membimbing, memberikan saran, dan motivasi selama penelitian. 2. Maywan Hariono, Ph.D., Apt. selaku dosen penguji yang memberikan
masukan dan saran pada penelitian ini.
3. Damiana Sapta Candrasari, S.Si., M.Sc. selaku dosen penguji yang memberikan masukan dan saran pada penelitian ini.
4. Pak Dwi, Pak Sarwanto, dan Pak Narto, selaku karyawan bagian Sekretariat Fakultas Farmasi yang telah mempermudah dalam urusan berkas-berkas. 5. Kakak Felicia Frauline, S.Farm. (yang sebentar lagi Apt.), yang sudah sangat
sabar memberikan pelajaran dan bantuan selama penelitian berlangsung. 6. Almarhum papah tercinta Bentua Sihaloho yang meskipun sudah tidak ada di
dunia ini, tetapi selalu menjadi sosok yang menginsiprasi dan memotivasi penyusunan skripsi ini.
7. Untuk mamah terkuat didunia yang sabar memberikan motivasi dan mengurus segala sesuatu dari saya lahir di dunia hingga saat ini.
8. Keluarga besar tercinta yang selalu memberikan motivasi dan bantuan materil selama penelitian.
9. Rekan penelitian, Evo, Indra, Donny, Lala, Rency yang senantiasa membantu menyelesaikan penelitian ini.
ix ABSTRAK
Kanker payudara merupakan kanker yang menjadi penyebab kematian kedua pada wanita di dunia. Reseptor estrogen alfa (REα) yang berikatan dengan estrogen adalah pemicu proliferasi pada sel kanker payudara, oleh karena itu REα merupakan salah satu target untuk terapi kanker payudara. Penelitian ini bertujuan untuk menguji secara in silico kemampuan senyawa quinocide sebagai ligan REα dan mengetahui pose ikatan quinocide pada REα. Uji in silico dilakukan menggunakan metode penambatan Penapisan Virtual Berbasis Struktur (PVBS) dengan protokol Setiawati et al. (2014) yang telah dimodifikasi oleh Istyastono (2015) dan divisualisasikan dengan PyMol versi 1.8.4.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa senyawa quinocide bukan merupakan ligan aktif di REα. Tidak terjadi interaksi antara senyawa quinocide dengan GLY521. Perlu dilakukan modifikasi senyawa agar dapat terjadi interaksi antara quinocide dengan residu GLY521.
x ABSTRACT
Breast cancer is the second major cause of women’s death in the world.
Estrogen receptor alpha (ERα) that binds to estrogen is a trigger of proliferation in breast cancer cells. Therefore, ERα was one of targets used in breast cancer therapy. The aim of this study was to carry out in silico test by examining the ability of the quinocide as a ligand for ERα and to determine the binding pose of
quinocide on ERα. The in silico test was performed using Structure Based Virtual Screening (SBVS) method utilizing protocol developed by Setiawati et al. (2014) which had been appended by Istyastono (2015) and visualized by PyMOL version 1.8.4.
The results showed that quinocide inactive ligand for ERα. Quinocide has no interaction with GLY521. Therefore, the quinocide should be modified into new model that can interact with GLY521 residues.
xi
Preparasi senyawa quinocide secara molekuler ...3
xii
DAFTAR TABEL
xiii
DAFTAR GAMBAR
xiv
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Proposal skripsi ... 11 Lampiran 2. Script untuk melakukan preparasi ligan quinocide dan untuk
melakukan penambatan ligan quinocide. ... 21 Lampiran 3. Konfigurasi protokol penambatan PLANTS ... 24 Lampiran 4. Shell script untuk analisa pasca penambatan dengan mengacu
1
Kanker merupakan penyebab kematian kedua di dunia setelah penyakit kardiovaskular. Diperkirakan 7,5 juta orang meninggal dunia akibat kanker, dan lebih dari 70% kematian terjadi di negara miskin dan berkembang. Berdasarkan hasil estimasi provider deteksi dini kanker payudara di Indonesia pada tahun 2013, terdapat 61.682 kasus kanker payudara. Dengan persentase tiga tertinggi ditempati provinsi Jawa Tengah dengan 11.511 kasus, Jawa Timur 9.688 kasus, dan Jawa Barat 6.701 kasus (Kementerian Kesehatan Republik Indonesia, 2013).
Dengan pendalaman yang benar mengenai penyebab kanker payudara, target obat secara molekuler telah dikembangkan dan diujikan sebagai pengobatan dan pencegahan terhadap kanker payudara (Hollander et al., 2013). Pada penelitian ini dilakukan uji in silico yang merupakan salah satu metode efektif dan efisien untuk penemuan obat baru. Selain itu uji ini juga dapat digunakan untuk mengetahui ada tidaknya interaksi antara senyawa dengan molekul target, salah satunya REα (Ekins et al., 2007).
Pada tahun 2012, Anita et al. mengembangkan sebuah protokol penapisan virtual untuk mengidentifikasi senyawa yang berpotensi sebagai ligan pada reseptor estrogen alfa dengan hasil nilai enrichment factor 1% (EF1%) sebesar 21,2. Parameter kualitas penapisan virtual secara obyektif diukur dengan nilai EF1% yang menggambarkan kemampuan protokol pada validasi retrospektif memilah senyawa aktif dari pengecoh (Anita et al., 2012; Istyastono, 2013). Nilai EF1% merupakan persentase senyawa aktif (true positive) yang diidentifikasi saat pengecoh yang teridentifikasi sebagai senyawa aktif (false positives) sejumlah 1%. Kemudian pada tahun 2013, Radifar et al. mengembangkan sebuah perangkat lunak PyPLIF (Python-based Protein-Ligan Interaction Fingerprinting) yang berguna untuk mengetahui interaksi sidik jari antara protein dengan ligan. PyPLIF melaksanakan interaksi sidik jari dengan mengubah interaksi protein-ligan menjadi sekumpulan data bit berdasarkan residu yang dipilih dan jenis interaksi (Radifar et al., 2013). Dalam pengujiannya, validasi PyPLIF menggunakan input protokol penambatan yang telah dikembangkan Anita et al. (2012) dan nilai EF1% meningkat menjadi 53,84.
2
dan ternyata aktif, artinya ini meningkatkan confidence untuk menguji 59 senyawa obat lainnya (Istyastono et al., 2015). Salah satu senyawa obat yang diuji disini adalah quinocide (Istyastono, 2013). Quinocide adalah obat 8-aminoquinoline yang memiliki masa molekul relatif sama dengan primaquine karena keduanya merupakan isomer posisi, dimana gugus metil pada rantai samping alifatik senyawa quinocide berada pada posisi empat dan senyawa primaquine pada posisi satu (Gambar 1) (Recht et al., 2014).
Kemudian pada tahun 2014 Setiawati, et al. (2014) mengembangkan protokol penapisan virtual dan menunjukkan nilai EF1% nyaturun drastismenjadi 18,54. Selanjutnya Istyastono (2015) mengembangkan protokol penapisan virtual dengan menggunakan metode recursive partition and regression tree (RPART) dan menghasilkan nilai EF sebesar 247,9. Hal inilah yang menjadi pertimbangan dilakukannya pengujian ulang terhadap quinocide dengan protokol yang telah dikembangkan oleh Istyastono (2015) sebelum dilakukan pengujian di laboratorium yang pasti akan menghabiskan biaya yang tidak sedikit dan waktu yang juga lama.
A B
Gambar 1. Isomer posisi primaquine dan quinocide
3 Bahan
Penelitian ini menggunakan konfigurasi protokol penambatan (Lampiran 4) yang telah dikembangkan dan divalidasi oleh Setiawati, et al. (2014), struktur tiga dimensi quinocide (diperoleh dari zinc.docking.org dengan kode ZINC01682298), perangkat lunak penambatan PLANTS 1.2 (Korb et al., 2007) untuk simulasi penambatan molekuler, PyPLIF (Radifar, et al., 2013) untuk identifikasi protein-ligan interaction fingerprint, shell script yang mengacu decision tree untuk analisis pasca penambatan (Lampiran 5), Microsoft Excel 2010 untuk mengolah data luaran penambatan dan PyMol 1.8.4 (Lill and Danielson, 2010) untuk visualisasi pose ikatan quinocide dalam kantung REα.
Instrumentasi
Server Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma dengan alamat IP 103.247.10.66 (pharcomp.web.id) dan Asus-PC dengan spesifikasi: Intel® Core™ i5-3317U CPU @1.70 GHz, RAM 4.00 GB, 64-bit Operating System, Linux Ubuntu 16.04 LTS.
Metode
Pengunduhan struktur senyawa quinocide
Struktur quinocide diunduh dari zinc.docking.org dengan kode ZINC01682298 dan disimpan dengan format .mol2. Kemudian nama file diubah menjadi ligand.mol2 (Setiawan dan Istyastono,2015).
Preparasi senyawa quinocide secara molekuler
Struktur quinocide yang telah diunduh dan disimpan dalam format .mol2 dipreparasi dengan menggunakan SPORES (mode: settypes) Setiawati et al. (2014). Selanjutnya didapat luaran berupa file ligand_spores.mol2 dari preparasi ini yang akan ditambatkan pada target virtual menggunakan aplikasi PLANTS 1.2.
Penambatan molekuler senyawa quinocide
4
terbaik untuk setiap replikasi yang dilakukan. Data seribu terbaik disimpan dengan nama all_pyplif.csv. (Setiawati et al., 2014).
Analisis Hasil
Analisis hasil dilakukan menggunakan shell script (Lampiran 5) pada Linux Ubuntu 16.04 LTS yang mengacu decision tree yang telah dikembangkan oleh Istyastono (2015). Kemudian dibuat jalur ligan aktif pad.a decision tree tersebut. Setiap jalur yang dibuat pada decision tree menghasilkan skor persen kesesuaian yang menunjukkan perbandingan kesesuaian quinocide sebagai ligan REα. Data hasil analisis menampilkan senyawa quinocide aktif sebagai ligan yang ditunjukkan dengan angka 1 atau tidak aktif sebagai ligan yang ditunjukkan dengan angka 0.
Visualisasi
Visualisasi pose quinocide dilakukan dengan memilih satu pose replikasi sebagai perwakilan yang representatif dengan nilai ChemPLP terkecil. Kemudian dibuat visualisasi pose ikatan antara ligan dan kantung ikatan REα menggunakan perangkat lunak PyMOL 1.8.4.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui apakah senyawa quinocide yang secara alami merupakan kontaminan dalam preparasi primaquine sebagai obat antimalaria adalah
ligan aktif pada REα berdasarkan protokol yang dikembangkan Setiawati et al. (2014), serta mengetahui secara atomik pose ikatan quinocide pada kantung ikatan REα. Analisis pasca penambatan dilakukan dengan menerapkan Recursive Partition and Regression Tree (RPART). Metode ini merupakan penentu apakah suatu senyawa berperan sebagai ligan atau pengecoh (decoy).
Hasil analisis berdasarkan pohon keputusan yang dikembangkan oleh Istyastono (2015) menunjukkan bahwa dari seribu replikasi penambatan, tidak ditemukan satupun pose yang aktif. Dengan demikian berarti senyawa quinocide tidak berikatan dengan residu-residu yang berperan penting dalam interaksi ligan-protein pada kantung ikatan
5
Gambar 2. Analisis dengan pohon keputusan
Ket: Garis biru menunjukkan alur pembuatan keputusan apakah senyawa merupakan ligan atau pengecoh. Pose yang digunakan adalah pose yang divisualisasikan
Senyawa uji dapat dikatakan sebagai ligan apabila memenuhi salah satu dari tujuh jalur deskripsi berikut:
1. Senyawa berikatan hidrogen dengan GLY420 dan memiliki skor ChemPLP kurang dari -84,82.
2. Senyawa tidak berikatan hidrogen dengan GLY420, memiliki skor ChemPLP kurang dari -118,40 dan berikatan hidrogen dengan GLU353.
3. Senyawa tidak berikatan hidrogen dengan GLY420 dan GLU353, memiliki skor ChemPLP kurang dari -118,40 dan berikatan hidrogen dengan LEU387.
6
dengan ARG394 dan GLU353, memiliki interaksi non polar dengan MET421, dan memiliki skor ChemPLP lebih kecil dari -85,23
6. Senyawa tidak berikatan hidrogen dengan GLY420 dan ARG394, berikatan hidrogen dengan GLY521 dan ASP351, dan memiliki skor ChemPLP lebih besar dari -118,40. 7. Senyawa tidak berikatan hidrogen dengan GLY420, ARG394, dan GLY521, berikatan
hidrogen dengan CYS530, memiliki interaksi non polar dengan CYS530, berinteraksi aromatis muka-muka dan muka-sisi dengan TRP383 dan memiliki skor ChemPLP lebih besar dari -118,40.
Kemudian hasil dari setiap jalur yang dikelompokkan kemudian dibuat tabel untuk mengetahui nilai persen kesesuaian quinocide sebagai ligan REα berdasarkan decision tree dan nantinya hasil dari analisis ini di visualisasikan. Nilai persen kesesuaian didapatkan berdasarkan banyaknya aturan yang terpenuhi dibagi jumlah seluruh aturan yang ada pada setiap jalur di decision tree. Berdasarkan persen kesesuaian pada Tabel I, diketahui persen kesesuaian terendah adalah 25% pada jalur ke-4 dengan jumlah pose yang memenuhi syarat adalah 34 dan persen kesesuaian yang tertinggi yaitu sebesar 80% pada jalur ke-6 dengan jumlah 1000 pose yang memenuhi syarat. Dari hasil inilah kemudian dapat diketahui residu-residu penting apa sajakah yang berperan penting dalam interaksi yang terjadi antara quinocide dan REα. Terdapat empat residu asam amino penting yang berinteraksi dalam kantung ikatan REα, yaitu ASP351, GLY420, GLY521, dan ARG394.
Tabel I. Data Jalur Persen Kesesuaian Ligan Berdasarkan Pohon Keputusan
Jalur
% Kesesuaian Jumlah yang Memenuhi Syarat
Terendah Tertinggi Terendah Tertinggi
7
Gambar 3. Visualisasi pose quinocide di REα
Pada visualisasi pose quinocide (Gambar 3), senyawa quinocide ditunjukkan oleh struktur berwarna kuning. Interaksi elektrostatik ditunjukkan dengan garis putus-putus berwarna kuning. Rantai utama ditampilkan dalam mode cartoon sementara residu ditampilkan dalam mode stick. Lingkaran merah menunjukkan tidak adanya interaksi hidrogen antara residu GLY521 dengan ligan quinocide, dimana seharusnya menurut bitstring PLIF yang digunakan dalam pohon keputusan Istyastono (2015), terjadi ikatan hidrogen antara residu GLY521 dengan ligan quinocide.
Visualisasi pose quinocide dilakukan dengan menggunakan pose replikasi ke 881, iterasi ke-3 yang memiliki skor ChemPLP terkecil yaitu -86,7941 pada perangkat lunak PyMOL 1.8.4. Hasil visualisasi menggambarkan interaksi quinocide dengan residu yang
8 KESIMPULAN DAN SARAN
9
DAFTAR PUSTAKA
Anita, Y., Radifar, M., Kardono, L.B.S., Hanafi, M., Istyastono, E.P., 2012. Structure-based Design of Eugenol Analogs As Potential Estrogen Receptor Antagonists, Bioinformation, 8 (19), 901-906.
Ekins, S., Mestres, J., and Testa, B., 2007. In silico Pharmacology For Drug Discovery: Methods For Virtual Ligand Screening And Profiling. British Journal of Pharmacology, 152, 9–20.
Hayashi, S.-I., Eguchi, H., Tanimoto, K., Yoshida, T., Omoto, Y., Inoue, a, Yoshida, N., and Yamaguchi, Y., 2003. The Expression And Function Of Estrogen Receptor Alpha And Beta In Human Breast Cancer And Its Clinical Application. Endocrine-related cancer, 10 (2), 193–202.
Hollander, P.D., Savage, M.I., Brown, P.H., 2013. Targeted Therapy For Breast Cancer Prevention. Departement of Clinical Cancer Prevention, 3 (250), 1-11.
Istyastono, E.P., 2013. Aplikasi Penapisan Virtual Pada ZINC Drug Database Guna Penemuan Senyawa Antagonis Reseptor Estrogen α Baru: Laporan Hasil Penelitian, Lembaga Penelitian dan Pengembangan Masyarakat, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
Istyastono, E.P., 2015. Employing Recursive Partition And Regression Tree Method To Increase The Quality Of Structure-Based Virtual Screening In The Estrogen Receptor Alpha Ligands Identification, Asian Journal of Pharmaceutical and Clinical Research, 8(6), 207-210.
Istyastono, E.P., Riswanto, F.D.O., and Yuliani, S.H., 2015. Computer-Aided Drug Repurposing: A Cyclooxygenase-2 Inhibitor Celecoxib As A Ligand For Estrogen Alpha , Indones. J. Chem, 15 (3), 274 – 280.
Kementrian Kesehatan Republik Indonesia, 2015. Deteksi Dini Kanker Leher Rahim Dan Kanker Payudara di Indonesia 2007-2014. Buletin Jendela Data & Informasi Kesehatan, 13.
Korb, O., Stützle, T., and Exner, T.E., 2007, An Ant Colony Optimization Approach To Flexible Protein-Ligand Docking, Swarm Intell, 1, 115-134.
Liao, X.H., Lu, D.L., Wang, N., Liu, L.Y., Wang, Y., Li, Y.Q., Yan, T.B., Sun, X.G., Hu, P., and Zhang, T.C., 2014. Estrogen Receptor Alpha Mediates Proliferation Of Breast Cancer MCF-7 Cells Via a p21/PCNA/E2F1-dependent Pathway. Febs J, 281, 927– 942.
Lill, M.A., and Danielson, M.L., 2010, Computer-aided Drug Design Platform Using PyMOL, Journal of Computer-Aided Molecular Design, 25 (1), 13-19.
Radifar, M., Yuniarti, N., and Istyastono, E.P., 2013, PyPLIF: Python-based Protein-Ligand Interaction Fingerprinting, Bioinformation, 9 (6), 325-328.
Recht, J., Ashley, E., and White, N., 2014. Safety of 8-Aminoquinoline Antimalarial Medicines. World Health Organization, (MAY 2014), 1–224.
Setiawan F.F., and Istyastono, E.P., 2015. Uji In Silico Senyawa 2,6-Dihidroksiantraquinon Sebagai Ligan Pada Reseptor Estrogen Alfa. Jurnal Farmasi Sains dan Komunikasi, 12 (2),77-80.
10
11 Lampiran 1. Proposal skripsi.
UJI IN SILICO SENYAWA QUINOCIDE SEBAGAI LIGAN PADA RESEPTOR ESTROGEN ALFA
Proposal Skripsi
Diajukan oleh: Fenny Marisza Sihaloho
NIM: 138113128
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
12
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Kanker merupakan penyebab kematian nomor 2 di dunia setelah penyakit kardiovaskular. Diperkirakan 7,5 juta orang meninggal akibat kanker, dan lebih dari 70% kematian terjadi di negara miskin dan berkembang. Rata-rata jumlah penderita kanker tertinggi pada perempuan di dunia adalah kanker payudara yaitu 38 per 100.000 perempuan dan kanker leher rahim yaitu 16 per 100.000 perempuan. Sedangkan jumlah penderita kanker payudara di Indonesia sebesar 40 per 100.000 perempuan dan kanker leher rahim 17 per 100.000 perempuan. Kanker payudara adalah penyakit di mana sel-sel payudara menjadi tidak normal dan berkembang biak membentuk sebuah tumor ganas (Wahidin 2015).
Salah satu faktor yang mempengaruhi terjadinya kanker payudara adalah reseptor estrogen (RE). Estrogen berfungsi sebagai hormon endokrin yang berdifusi ke dalam jaringan payudara dan beredar secara sistemik dengan berinteraksi dengan reseptor steroid, khususnya reseptor estrogen alfa (REα) dan reseptor estrogen beta (REβ). Kedekatan korelasi antara ekspresi reseptor estrogen alfa dengan proliferasi sel dari kanker payudara menjadikan REα sebagai target yang sangat potensial untuk terapi kanker payudara (Liao et al. 2014).
Quinocide atau 1-N-(6-methoxyquinolin-8-yl)pentane-1,4-diamine merupakan senyawa 8-aminoquinoline yang memiliki struktur molekul relatif sama dengan primaquine dan digunakan sebagai obat anti malaria. Quinocide adalah kontaminan yang didapatkan pada proses preparasi primaquine. Baru sedikit kelompok penelitian yang mampu memisahkan dan mengukur dua obat ini pada preparasi primaquine (Recht et al. 2014).
Uji in silico merupakan salah satu metode yang efektif dan efisien untuk penemuan obat baru. Selain itu uji ini juga dapat digunakan untuk mengetahui ada atau tidaknya interaksi antara senyawa dengan molekul target, salah satunya reseptor. Interaksi senyawa dengan reseptor dapat divisualisasikan dengan metode komputasi dan dapat digunakan untuk mengetahui pharmacophore dari suatu senyawa (Ekins et al. 2007).
13
Sebelumnya telah dikembangkan sebuah protokol untuk mengidentifkasi pose ikatan alfa mangostin di kantung ikatan reseptor estrogen alfa (Setiawati et al. 2014) dan analisa pasca penambatan oleh Istyastono (2015). Sejauh pengetahuan penulis, dengan metode yang ada belum pernah dilakukan uji in silico senyawa quinocide terhadap RE-α pada kanker payudara, oleh karena itu akan dilakukan uji in silico senyawa quinocide sebagai ligan pada RE-α dengan menggunakan protokol yang di kembangkan oleh Setiawati et al. (2014) dan analisa pasca penambatan oleh Istyastono (2015).
C. Urgensi Penelitian
Penelitian ini penting untuk memberi informasi terkait uji in silico senyawa quinocide terhadap RE-α untuk selanjutnya dapat dikembangkan dalam pengobatan kanker payudara agar potensi peningkatan penderita kanker payudara di Indonesia dan dunia berkurang.
D. Luaran Penelitian
Luaran berupa naskah untuk publikasi tentang uji in silico senyawa quinocide sebagai ligan terhadap reseptor estrogen alfa.
E. Manfaat Penelitian 1. Manfaat teoretis
Memberikan tambahan pengetahuan mengenai ikatan antara quinocide dan reseptor estrogen alfa, serta kemampuan quinocide sebagai ligan terhadap RE-α sehingga dapat dijadikan acuan untuk penelitian selanjutnya.
2. Manfaat praktis
Hasil penelitian ini diharapkan mampu digunakan sebagai pengaplikasian dan pengembangan protokol penambatan virtual sebagai penemuan obat baru.
F. Tujuan Penelitian 1. Tujuan umum
Tujuan umum penelitian ini adalah untuk menguji senyawa quinocide sebagai ligan pada reseptor estrogen alfa secara in silico menurut protokol yang telah dikembangkan oleh Setiawati et al., (2014) dan metode analisa pasca penambatan oleh Istyastono (2015).
2. Tujuan khusus
14
PENELAAHAN PUSTAKA
A. Kanker Payudara
Kanker payudara berasal dari sel payudara yang mengalami proliferasi abnormal. Penyakit ini dapat ditandai oleh munculnya benjolan, penebalan, atau perubahan karakteristik kulit di daerah payudara. Kanker payudara invasif dapat dibedakan menjadi 2 subtipe yaitu kanker yang mengekspresikan reseptor estrogen (RE) atau sel kanker RE positif dan kanker yang tidak mengekspresikan RE atau sel kanker RE negatif (Pinsky et al. 2001).
Faktor yang paling mempengaruhi risiko terkena kanker payudara adalah jenis kelamin. Angka kejadian kanker payudara pada wanita lebih tinggi seratus kali lipat dibandingkan pada pria. Faktor genetik juga memiliki pengaruh yang terbatas tetapi penting terkait risiko kanker payudara. Hanya 5-6% dari kasus kanker payudara yang disebabkan oleh keturunan, tetapi sekitar 80% dari pasien dengan kanker payudara turunan memiliki gen BRCA-1 (BReast CAncer genes 1) dan/atau BRCA-2 (BReast CAncer genes 2) (Pinsky et al. 2001).
Sebagian besar kasus kanker payudara bergantung pada signal yang diterima oleh reseptor estrogen, maka strategi pengobatan sebagian besar difokuskan dengan memblokir sinyal yang melewati reseptor estrogen (Chien et al. 2016).
B. Reseptor Estrogen Alfa
Reseptor estrogen merupakan salah satu reseptor intrasel yang terdiri dari dua isoform yaitu reseptor estrogen alfa dan reseptor estrogen beta yang merupakan G-protein coupled receptor. Pada kanker payudara, REα berperan dalam proses pembelahan sel, peningkatan pertumbuhan tumor dan stres oksidatif. Sedangkan REβ berperan dalam penurunan pembelahan sel yang dipicu oleh REα, dan memicu diferensiasi kelenjar payudara. Peran penting reseptor estrogen alfa dalam regulasi dan ekspresi jaringan payudara inilah yang dibutuhkan dalam perkembangan payudara dan aktivasi sinyal proliferasi pada payudara normal dan payudara yang menderita kanker (Caldon 2014, Ma and Gollahon 2016) (Serrano et al. 2012).
Overekspresi dari REα sering diamati pada tahap awal kanker payudara. Promotor
15
Gambar 1. Struktur Senyawa Quinocide
Quinocide adalah isomer posisi dari primaquine yang dikembangkan di bekas Uni Soviet dan memiliki sifat yang sama. Quinocide ini adalah kontaminan dari sediaan primaquine tapi tidak terdeteksi selama beberapa dekade. Saat ini sudah ada kelompok penelitian yang mampu memisahkan dan mengukur kadar quinocide dalam sediaan primaquine. Jumlah quinocide dalam primaquine pada dua produsen tersebut adalah 2,12% dan 2,71% (Recht et al. 2014).
D. Uji In Silico
Uji in silico adalah metode yang dapat membantu dalam mengidentifikasi target obat, mengetahui kemiripan obat dan menganalisis struktur target untuk kemungkinan mengikat sisi yang aktif lalu menghasilkan molekul diinginkan. Selain itu juga mampu memprediksi interaksi antar molekul, mengurutkan molekul senyawa berdasarkan afinitas pengikat, dan lebih mengoptimalkan molekul untuk meningkatkan karakteristik pengikat. Terminologi in silico di antaranya dikenal sebagai penapisan virtual. Untuk melakukan penapisan senyawa biologis terhadap milyaran senyawa masih sangat sulit, oleh karena itu pendekatan secara virtual menjadi alternatif. Karena metode ini relatif lebih cepat bahkan mampu mengetahui ribuan senyawa dalam satu hari dan bergantung pada senyawa yang diuji dan kecepatan computer (Shoichet 2004)
Proses penapisan virtual digunakan untuk membantu menemukan senyawa yang kemungkinan besar berpotensi sebagai obat, dengan membutuhkan waktu yang relatif singkat. Jika target telah diketahui, algoritma docking dapat digunakan untuk menempatkan kandidat obat ke dalam sisi aktif dari target seperti enzim atau reseptor. Interaksi senyawa-senyawa yang telah diikatkan kemudian diurutkan berdasarkan hasil analisis secara komputasi komponen sterik dan elektrostatiknya (Vyas et al. 2008).
E. Protokol Penambatan Molekuler
16
untuk masing-masing senyawa. Senyawa dinyatakan sebagi ligan aktif bila memiliki
afinitas di bawah 1μM. Sementara senyawa pengecoh adalah senyawa-senyawa yang tidak
memiliki afinitas pada konsentrasi >30 μM. Senyawa yang memiliki afinitas di antara 1-30
μM dinyatakan sebagai senyawa marginal (Mysinger et al. 2012).
Istyastono (2015) telah mengembangkan suatu metode analisis pasca penambatan untuk penentuan aktif tidaknya suatu ligan pada reseptor estrogen alfa. Metode ini dilakukan dengan menerapkan Recursive Partition and Regression Tree (RPART). Metode ini menentukan apakah suatu senyawa berperan sebagai ligan atau sebagai senyawa pengecoh yang didasarkan pada skor penambatan dan bitstring PLIF.
Gambar 2. Pohon keputusan RPART (Istyastono, 2015). Jika jawaban “ya” menuju ke
17
Nomor bitstring Residu Jenis interaksi
320 GLY 420 Ikatan hidrogen (protein sebagai akseptor) 242 ARG 394 Ikatan hidrogen (protein sebagai donor) 117 GLU 353 Ikatan hidrogen (protein sebagai akseptor) 411 GLY 521 Ikatan hidrogen (protein sebagai akseptor) 473 CYS 530 Ikatan hidrogen (protein sebagai donor) 105 ASP 351 Interaksi elektrostatik (protein sebagai anion) 201 LEU 387 Ikatan hidrogen (proein sebagai akseptor)
470 CYS 530 Interaksi non polar
170 TRP 383 Aromatis (face to face)
171 TRP 383 Aromatis (edge to edge)
323 MET 421 Interaksi non-polar
F. Landasan Teori
Kanker payudara berasal dari sel payudara yang mengalami proliferasi abnormal. Penyakit ini dapat ditandai oleh munculnya benjolan, penebalan, atau perubahan karakteristik kulit di daerah payudara. Kanker payudara invasif dapat dibedakan menjadi 2 subtipe yaitu kanker yang mengekspresikan reseptor estrogen (RE) atau sel kanker RE positif dan kanker yang tidak mengekspresikan RE atau sel kanker RE negatif. Aktivitas
REα berkaitan erat dengan kanker payudara. Ekspresi REα yang berlebih dapat menjadi penanda awal terkena kanker payudara.
Quinocide adalah senyawa yang didapatkan dari kontominan sediaan primaquine. Tujuan digunakannya senyawa quinocide agar ditemukan terapi yang baru dari sebuah obat non-anti kanker yang memiliki aktivitas antikanker.
18
19
METODOLOGI PENELITIAN
A. Bahan
Pada penelitian ini menggunakan protokol yang telah dikembangkan dan divalidasi oleh Setiawati, et al. (2014), struktur tiga dimensi Quinocide (diperoleh dari zinc.docking.org dengan kode ZINC01682298), perangkat lunak penambatan PLANTS 1.2 (Korb et al. 2006) untuk simulasi penambatan molekuler, PyPLIF (Radifar, et al., 2013) untuk identifikasi protein-ligan interaction fingerprint, R 3.0.1 (R Development Core Team 2013) untuk perhitungan dan analisis statistik dan PyMol 1.2rl (Lill dan Danielson, 2010) untuk visualisasi pose ikatan quinocide.
B. Alat
Server Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma dengan alamat IP 6103.247.10.66 dengan sistem operasi Ubuntu 12.04 LTS, ASUS Intel® Atom™ CPU 2600 @1.60 GHz, RAM 2.00 GB, 64-bit Operating system, dan sistem operasi Linux Ubuntu 16.04 LTS.
C. Prosedur penelitian 1. Pengunduhan struktur senyawa quinocide
Struktur quinocide diunduh dari zinc.docking.org dengan kode ZINC01682298 dan disimpan dengan format .mol2.
2. Preparasi senyawa quinocide secara molekuler
Struktur quinocide yang telah diunduh dan disimpan dalam format .mol2, dipreparasi dengan menggunakan aplikasi SPORES (modul : settypes) agar selanjutnya dapat digunakan untuk ditambatkan pada target virtual menggunakan aplikasi PLANTS 1.2.
3. Penambatan molekuler senyawa quinocide
20
Analisis hasil dilakukan menggunakan perangkat lunak statistik R versi 3.0.2 (R Development Team, 2015) dan dengan protokol analisis yang telah dikembangan oleh Istyastono (2015). Hasil penambatan berupa skor ChemPLP dan PLIF bitstring yang selanjutnya dimasukkan pada decision tree melalui metode RPART dengan aplikasi statistik R 3.0.2 (R Development Team, 2015). Data dari hasil analisis akan menampilkan senyawa quinocide aktif sebagai ligan yang ditunjukkan dengan angka 1 atau tidak aktif sebagai ligan yang ditunjukkan dengan angka 0.
Selanjutnya visualisasi pose senyawa quinocide pada reseptor estrogen alfa menggunakan PyMOL 1.2 (Lill dan Danielson, 2011) dilakukan dengan memilih pose ikatan dengan kriteria :
1. Pose dengan bitstring 320 aktif dan skor ChemPLP terkecil. 2. Pose dengan skor ChemPLP terkecil.
21
> rm protein.mol2 water.mol2 plants.config ligand_input.mol2
22
> echo "iterasi_$j `cat iterasi_$j.pyplif.tmp`" >
iterasi_$j.pyplif.csv
> sort -k3,3n pyplif.tmp | head -1 > pyplif.csv
> cat pyplif.csv >> ../all_pyplif.csv
> cd ..
> tar -zcf replikasi_$i.tar.gz replikasi_$i
> rm -rf replikasi_$i
> done
> for l in $(seq 1 1000)
> do echo $l >> data.lst
> done
> paste data.lst all_pyplif.csv > data_list_pyplif.csv
> sed "s/results\///g" data_list_pyplif.csv > tmp1.csv
> awk '{print $1","$2","$3","$4","$5}' tmp1.csv > col1_5.csv
> awk '{print $6}' tmp1.csv | sed "s/0/0,/g" | sed "s/1/1,/g"
> bitstring.csv
> paste -d, col1_5.csv bitstring.csv > data.csv
> awk -F, 'BEGIN {OFS=","};{if($4<-84.82 && $325==1)
hasil="aktif";
> else if($4<-118.40 && $325==0 && $122==1) hasil="aktif";
> else if($4<-118.40 && $325==0 && $122==0 && $206==1)
hasil="aktif";
> else if($4<-85.23 && $325==0 && $247==1 && $206==1)
hasil="aktif";
> else if($4<-85.23 && $325==0 && $247==1 && $206==0 &&
23
$110==1) hasil="aktif";
> else if($4>=-118.40 && $325==0 && $247==0 && $416==0 &&
$478==1 && $475==0 && $175==1 && $176==1) hasil="aktif";
> else hasil="inaktif"} {print $1,hasil}' data.csv >
analisis_dectree.csv
> rm data.lst all_pyplif.csv data_list_pyplif.csv tmp1.csv
col1_5.csv bitstring.csv
> cd ..
> tar -zcf data_skripsi.tar.gz data_skripsi
24
# scoring function and search settings
> scoring_function chemplp
> search_speed speed2 # input
> protein_file protein.mol2
> ligand_file ligand_input.mol2
# output
> output_dir results
# write single mol2 files (e.g., for RMSD calculation)
> write_multi_mol2 0
# cluster algorithm
> cluster_structures 50
> cluster_rmsd 1.0
# binding site definition
> bindingsite_center 31.5746 -1.59038 25.5995
> bindingsite_radius 12.8348 # water
> water_molecule 22.565 -0.072 25.818 1 0 1
25
#!/bin/sh
> awk -F, 'BEGIN {OFS=","};{if($4<-84.82 && $325==1)
hasil="aktif";
> else if($4<-118.40 && $325==0 && $122==1) hasil="aktif";
> else if($4<-118.40 && $325==0 && $122==0 && $206==1)
hasil="aktif";
> else if($4<-85.23 && $325==0 && $247==1 && $206==1)
hasil="aktif";
> else if($4<-85.23 && $325==0 && $247==1 && $206==0 &&
$122==1 && $328==1) hasil="aktif";
> else if($4>=-118.40 && $325==0 && $247==0 && $416==1 &&
$110==1) hasil="aktif";
> else if($4>=-118.40 && $325==0 && $247==0 && $416==0 &&
$478==1 && $475==0 && $175==1 && $176==1) hasil="aktif";
> else hasil="inaktif"} {print $1,hasil}' data.csv >
26
