EFEK EKSTRAK DAUN GAMBIR (Uncaria gambir Roxb.) SEBAGAI ANTIINFLAMASI TERHADAP KOLITIS YANG DIINDUKSI DEXTRAN SULPHATE SODIUM TESIS.

DEXTRAN SULPHATE SODIUM

TESIS

Oleh :

Rizky Amalia Siregar 187008002

PROGRAM STUDI MAGISTER ILMU BIOMEDIK FAKULTAS KEDOKTERAN

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA 2021

l-

I

I1

AruTgXNp.X,,q&€ASg T&ffig$,eglAp K#LKY'$$ y,&N# ffixHlqffi {.J&{sg

#gxr"tr"€,v,$'alg.s"sg4F"K,S#trg€'/&g

YK$K$

43&etuc

ffignffi

A&s.qtKA saffii*G,qR

IqE&g. RS?{}&#S*?

pRsGffiA&,g STAj&g e€AsgsTffiK gtu&ggJ ffiH€Frd&ffigK FAKff X,TAS KC &SH{?' tr Kq*{

{ JrumwRsg gA$ sa}&,€.e?"gffiA wx'A&._q 3&?$

Ll/

DEXTRAN SALPHATE SODIUM

TESIS

Diajukan Sebagai Salah Satu Syarat Untuk Memperoleh Gelar Magister Biomedik dalam Program Studi Magister Ilmu Biomedik

Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara

Oleh:

RIZKY AMALIA SIREGAR NIM. 187008002

PROGRAM STUDI MAGISTER ILMU BIOMEDIK FAKULTAS KENOKTERAN

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA 2A2l

Nama Mahasiswa

Nomor Induk Program Studi

Ketua

Ketua Program Studi

Dr.rer:medig dr.M.Ichwan. M.Sc, Sp.KKLP NrP 19790111 200312 1 001

Rizky Amalia Siregar 187008002

Magister Ilmu Biomedik

Menyetujui, Komisi Pembimbing

Anggota

NIP 19760709 200312 2 001 NIP ^19681009 1999032 002

$ffi

Tanggal lulus: 25 Februari 2021

PANITIA PENGUJI TESIS

Ketua: dr. Tri Widyawafi, M.Si, PhD

Anggota: 1. Dr.dr. Bettyo M.Ked (PA), Sp. PA (K)

2. dr. Zulham, M.Biomed, Ph.D 3. Dr,dr. Yetti Machrinan M.Kes

-l

"EFEK EKSTRAK DAUN GAMBIR (Uncaria Gambir Roxb) SEBAGAI ANTIINFLAMASI TER}IADAP KOLITIS YANG DIINDUKSI

DEXTRAN SULFATE SODIUfuf'

Dengan

ini

penulis menyatakan bahwa tesis

ini

disusun sebagai syarat

untuk memperoleh gelar Magister Biomedik pada Program Studi Magister Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara adalah benar merupakan hasil karya penulis _sendiri.

Adapun pengutipan-pengutipan yang penulis lahlkan pada bagian-bagian tertentu dari hasil karya orang lain dalarn penulisan ini, telah penulis cantumkan sumbernya secara jelas sesuai dengan nonna, kaidah, dan etika penulisan ilmiah.

Apabila dikemudian hari ternyata ditemukan seluruh atau sebagian tesis

ini bukan hasil karya penulis sendiri atau adanya plagiat dalam bagian-bagian tertentu, penulis bersedia menerima sanksi pencabutan gelar akademik yang penulis sandang dan sanksi-sanksi lainnya sesuai dengan peraturan perundangan yang berlaku.

Medan, Februari 2021 Penulis,

Rizky Amalia Siregar

Abstrak

Kolitis ulseratif (KU) merupakan inflamasi yang dapat mengenai sebagian dan seluruh kok:n. Terapi konvensional masih belum sepenuhnya mampu mencegah kekambuhan. Salah satu antiinflamasi yang berasal dari tanaman yang sering digunakan adalah daun gambir (Uncaria gambir Roxb).Penelitian ini bertujuan untuk mengkaji efek antiinflamasi daun gambir pada tikus kolitis ^yang diinduksi

dextran

sulphate

sodium (DSS) melalui

pemeriksaan

kadar

enzim myeloperoxidase (MPO) dan histopatologr jaringan kolon. Penelitian ini adalah eksperimental murni dengan desain penelitian posttest with cantrol group. Tikus (n:24) diberi pakan normal selama 7 han, kemudian dibagi menjadi 4 kelompok yaitu:

I:

:normal; II: DSS l% (blv) _{4000 mw) + carboxy metil celtulose (CMC) la/a (blv);

III:

DSS l%+ ekstrak daun gambir (EDG) 100 mg/kgbb;

IV:

DSS 17o+EDG 200 mg/kgbb selama I

I

^hari ad libitum. Pada hasil pemeriksaan kadar myeloperioxidase (MPO), kelompok perlakuan

III

(12,66*1,49)

dan

IV (11,96*3,58) memiliki kadar MPO yang lebih rendah dibandingkan dengan kelompok

II

(15,01*2,83), tetapi masih lebih tinggi jika dibandingkan dengan kelompok I (9"83*4,04). Analisis data dengan one way Anova menunjuli{<an tidak terdapat perbedaan yang signifikan antara kelompok kontrol dan perlakuan.

Rerata skor kerusakan epitel dan skor infiltrasi sel inflamasi pada kelompok

III (l*0;

1,66*0,51) dan kelompok tV (1,3*0,51;1,3*0,51) lebih kecil dibandingkan dengan kelompok II (1,83*0,75;2,33+0,51). Pada hasil pemeriksaan histopatologi untuk menilai kerusakan jaringan kolon dan infiltrasi sel inflamasi, dilakukan analisis data dengan Kruskal Walis dan didapatkan perbedaan yang signifikan antara ketompok kontrol dan perlakuan (p:0,004; p0,001). Tidak terdapat perbedaan dalam penunrnan derajat kerusakan kolon antara kelompok perlakuan

(III

dan

IV)

dengan kelompok kontrol (II). Kesimpulan: Ekstrak daun gambir memiliki potensi sebagai antiinflamasi yang berperan dalam menurunkan kadar MPO dan proses perbaikan sel epitel dan menurunkan infiltrasi sel inflamasi pada gambaran histopatolo gi.

Kata kunci :kolitis, ekstrak daun gambir, MPO, histopatologi kolon

Abstract

Ulcerative colitis (UC) is an inflammation that can affect part and

all

of the eolon. Conventional therapy is still not fully ^{able to prevent} reeurcence. One

of

the anti-inflammatory derivedfrom plants that is often used is the leaf of gambier (Uncaria gambir Roxb). This study aims ta examine the anti-tnflammatory

ffict

of

^gambir leaves on colitis induced by dextran sulphate sodium ^(DSS) by

examining

the

levels

of the

enzyme myeloperoxidase (MPO)

and

tissue histopathologt. colon. This research is a purely experimental research design with posttest control group. Rats (n

:

_{24) were} given _normal food for ^{7 days, then}

divided into 4 groups, namely:

I::

normal;

IL

,S,S

I%

^(w

/ fl

ft000 mw) ⁺ carbory metl4til cellulose (CMC) 1% (w

/

v);

III:

^DSS 1% + _Gambir leaf extract (EDG) 100 mg /kgbw; IV: ^DSS I% + EDG 200 mg /kgbwfor 1I days ad libitum.

On the results

of

examination

of

myeloperioxidase (MPO) levels, treatment groups

III

_Q2.66 ⁺ 1.49) and IV (11.96 + 3.58) had lower MPo levels eompared to group

n

^(]5.0]

*

2.83).

),

^{but it was still higher} when compared to group

I

(9.83

*

4.04). Data analysis using one w€ry Anova showed thot there was no

significant dffirence ^between the control and treatment groups. The mean epithelial damage score and infiammatary cell infiItration score in group

III

^{(1 +}

0; 1.66

*

0.51) and group IY (1.3

*

0.51; 1.3

*

0.51 were smoller than the group.

n

^(1.83

*

0.75; 2.33

*

0.51). The results of histopathological examinstions to assess colonic tissue damage and inflammatory cell infiltration, data analysis was performed with Krusknl Walis and obtained signtficant dffirences between the control and treatment groups (p

:

_0.0a4i

_p :

_0.0a$ There was no dffirence in the decrease in the degree of colonic damage between the treatment group

(III

and IV) and the cantrol group (II). Conclusion: Gambir leaf extract has potential as cn anti-inflammatory which plays a role in reducing MPO levels and the repair process of epithelial cells and decreasing the infilnation of inflammatory cells in

the his t opathol o gi c ol pi c tur e.

Keywords: colitis, gambier leaf extract, MPO, colon histopathologt

memberikan rahmat dan kasih sayangNya kepada penulis _sehingga penulis dapat menyelesaikan penulisan tesis ini.

Selama melakukan penulisan tesis ini penulis banyak memperoleh bantuan

moril dan matenl dari berbagai pihak. Oleh karena itu, ^pada kesempatan ini penulis menyampaikan ucapan terima kasih yang tulus kepada:

1.

Dr. Muryanto Amin, S.Sos, M.Si, sel*u Relctor Universitas Sumatera Utara

2.

Prof. Dr.dr.Aldy Safruddin Rambe, Sp.S. (K), selaku Dekan FK USU

3.

Dr.rer.medic. dr.

M.

Ichwan, M.Sc. selaku Ketua Program Studi Magister

Ilmu

Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara atas bimbingan dan arahan selama masa studi

4.

dr. Tri Widyawati, M.Si, Ph.D selaku Ketua Komisi Pembimbing yang telah memberikan aratran dan bimbingan kepada penulis selama proses penelitian dan penyusunan tesis ini

5"

Dr.dr. Betty, M.Ked (PA), Sp.PA (K) selaku Anggota Komisi Pembimbing yang telah memberikan arahan dan bimbingan kepada penulis selama proses penelitian dan penyusunan tesis ini

6.

dr. Zulham, M.Biomed, Ph.D dan Dr.dr. Yetty MachrinA M.Kes selaku Komisi Pembanding atas saran dan masukan yang telah diberikan

7.

Seluruh staf pengajar, laboran, dan administrasi Prodi Ilmu Biomedik FK

USU"

8.

TALENTA USU yang telah memberikan _dana penelitian _sehingga penelitian ini dapat terlaksana dengan baik

9.

Staf Laboratorium Hewan Coba Fakulks MIPA dan Staf Laboratorium Terpadu Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara yang telah membantu dan mendampingi penulis selama proses penelitian

10. Seluruh keluarga besar penulis, Terutama kedua orang tu4 Anna wati Dewi Purba dan M.Hanis Siregar serta adik Fachrul Amanullah Siregar. Terima kasih atas kasih sayang dan pengertian yang luar biasa, dukungan moril dan materil serta doa yang tidak henti dipanjatkan selama penulis menempuh masa studi.

llr

Penulis menyadari tesis ini masih banyak memiliki kekurangan dan jauh dari sempurna.Namun, harapan penulis semoga tesis

ini

bermanfaat kepada seluruh pembaca.

Medan, Februari 2021 Penulis,

Rizky Amalia Siregar

lv

Biodata Pribadi

Nama Lengkap

NIM

Tempat/Tanggal Lahir Jenis kelamin

Bangsa Agama

Status Perkawinan Tempat Tinggal

EmaiVNo.HP Nama Ayah Nama Ibu

Riwayat Pendidikan

a.

SD

Ijaza;hTahun

b.

^SMP

Ijazah Tahun

c.

^SMA

Ijazah Tahun

d.

Strata Pertama (Sl)

Ijazah Tahun

Rizky Amalia Siregar 187008002

Medan

i

13 April 1993 Perempuan

Indonesia Islam

Belum Menikah

Jl. Pendidikan Gg. Kasih No.60 Kecamatan Percirt Sei Tuan Kabupaten Deli Serdang Sumatera Utara rizkyamaliasrg@.ernail.com / 08 I I 603 8 I 2

M. Harris Siregar, SH

Hj. Anna Wati Dewi Purba" S.Psi, M.Si

SD Negeri rcn66 Bandar Setia 2044

SMP Negeri I Percut Sei Tuan 2407

SMA Kartika

I-l

Medan 2010

Fakultas Kedokleran Universitas _Syiah Kuala 2014

Riwayat Pekerjaan

a.

^Dokter Internship RSUD Dr. Fauziah Bireun (2017-2015)

b.

Dol;ter Umum FKTP Tiara Medistra (2019-sekarang)

ABSTRAK...

ABSTRACT

KATA PENGANTAR..

DAFTAR TABEL...

DAF'TAR GAMBAR DAFTAR SINGKATAN

BAB

I

PENDAHULUAN

1.1.

Latar Belakang.

1.2.

Rumusan Masalah

1.3.

Kerangka Konsep

1.4.

HipotesaPenelitian

1.5.

^{Tujuan Penelitian}

1.5.1. TujuanUmum 1.5.2. Tujuan Khusus I .6. Manfaat Penelitian

BAB

II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Anatomi dan Fisiologi Kolon...

2.2

Peradangan

2.3. Emimdan Protein Inflamasi 2.4. Kolitis Ulseratif

2.4.1 Definisi ...

2.4.2 Patofisiologi

Induksi Dextran Sulphate Sodium (DSS) untuk Model Kolitis Ulseratif....

Perubahan Histologi pada Kolitis yang Diinduksi DSS...

Myeloperoksidase...

Gambir: Kandungan dan Manfaat sebagai Antilnflamasi

2.8.1 Morfologi dan Taksonomi 2.8.2 Garrftir Sebagai Anti Inflamasi Kerangka Teori

Kerangka Konsep...

Hipotesa Penelitian.

METODE PENELITIAN

I u ll vl lx x xl

1

4 4 4 4

4 4 5

6 7

I

8

l0

13

t4 l5 t7

17

t9

20 2.5

2.6 2.7 2.8

2.9

2.ta

2.tl

3.1.

3.2.

J.J.

Tempat dan Waktu Penelitian Jenis Penelitian

Populasi dan Sampel

2t

22 23 23 23 23

vl BAB

III

25 25 27 27 27 27 27 27 28 29 29 29 30 31 32 33 34

35

35

36 3.8.

3.9 3.10

Rancangan Penelitian.

Defenisi Operasional Variabel Penelitian.

3.6.1. Variabel bebas 3.6.2. Variabel terikat Alat dan Bahan 3.7.1. Alat ^...

3.7.2. Bahan Prosedur Penelitian 3.8. 1. Pembuatan ekstrak

3.8.2. Persiapan hewan coba ...

3.8.3. Pembuatan sediaan histopatologi kolon ...

3. 8.4. Interpretasi histopatologi ...

3.8.5. Pembacaan myeloperoksidase...

3.8.6. Preeliminary Analisis Penelitian..

Alur Penelitian...

BAB

IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1

^Hasil

4.1.1. Skrining fitokimia ekstrak daun gambh (Uncaria gambir Roxb)

4.1.2.

Efek Ekstrak Daun Gambir {Uncaria ^gambir Roxb) terhadap kadar

MPO

^pada tikus model kolitis yang di induksi Dextran Sulphate Sodium..

4.1.3. Efek Ekstrak Daun Gambir (Uncaria gambir Roxb) terhadap kerusakan permukaan epitel pada

tikus model kolitis ^yang

di

^{induksi Dextran}

Sulphate Sodium

4.1.4. Efek Ekstrak Daun Gambir (Uncaria gambir Roxb) terhadap infiltrasi sel inflamasi pada tikus model kolitis yang

di

induksi Dextran Sulphate Sodium

4.1.5. Efek Ekstrak Daun Gambir (Uncaria gambir

Roxb)

^terhadap derajat kerusaka kolon pada

tikus model

kolitis

^yang

di

induksi Dextran Sulphate Sodium

Pembahasan

4.2.1. Skrining fitokimia ekstrak daun gambir (Uncaria gambir Roxb)

4.2.2.

Efek Ekstrak Daun Gambir

^(Uncaria

gambirRoxb) terhadap kadar

MPO

pada tikus model kolitis yang di induksi Dextran Sulphote Sodium

4.2.

37

38

4A

vll

42

Sulfate Sodium...

Keterbatasan Penelitian

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

5.1.

Kesimpulan

LAMPIRAN

4.3.

43 44

45 45 46

vlll

Halaman

Tabel

3.1

^Rancangan

penelitian..

25

Tabe13.2 Defenisi

operasional

²⁶

Tabel4.1

Hasil skrining fitokimia ektrak simplisia ^(Jncaria gambir

Roxb

³⁵

Tabel4.2

Rerata jumlah _kadar MPO _i'ang diamati dalam berbagai

perlakuan..

Tabel

4.3

Rerata skor kerusakan permukaan

Tabel4.4

Rerata skor infiltrasi sel inflamasi ...

36 37 38

1X

Halaman Gambar 2.1

Galrtbar 2.2

Gambar 2.3 Gambar 2.4

Gambar 2.5 Gambar 2.6 Garr,&rar2.7

Gambar 2.8 Gambar 2.9 Gambar 2.10 Gambar 3.1 Gambar 4.1 Gambar 4.2

Gambaran Eksternal dari Usus 8esar...

Perbedaan Gambaran Lesi pada Penyakit Chron dan Kolitis Ulseratif

Skema Inflamasi pada Penyakit Chron dan Kolitis ulseratif Histomorfologi Jaringan Kolon Distal pada Tikus yang diinduksi DSS ...

Keterlibatan MPO dalam Fungsi Neutrofil Neutrofil MPO menekan fungsi sel dendritik

Uncaria gambir Roxb...

Efek Antioksidan Katekin Kerangka Teori

Kerangka Konsep Preeliminary ...

Bagian Kolon Distal Pembesaran 40x ...

Bagian Kolon Distal Pembesaran 200x ...

9 13

t5 t6 t7

18

19

2t

32 39

DSS :

^Dextran sulphate sodium

ELISA :

^{Enzyme linked} immunosorbent assay

IBD :

Infiammatory bowel disease

IFN1 :

Interferon gamma

III- :

Interleukin

KU :

_{Kolitis ulseratif}

MPO :

Myeloperolaidase

Nf-kB :

Nuclear Factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells

PC :

_{Penyakit Crohn}

ROS :

Reactive orygen species

Th :

_T-helper

TLR :

Toll like reseptor

TNFa =

^Tumor necrosisfactor alpha

TGf'p :

Transforming growthfuctor _beta

NO :

_{Nitric axide}

SIL-6R :

_Soluble Interleukin-6 Receptor

STAT

3 -

^Sigrcal Transducer snd Activator of Transcription 3

CO =

^{Carbon Monoxide}

NLRs :

Nucleotide-bindingoligomerizationdomain-LikeRecept

xi

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Kolitis Ulseratif merupakan peradangan kronik yang mengenai bagian distal kolon, submukosa dan mukosa rektum, dan dapat mengenai seluruh kolon bahkan sampai ke bagian terminal ileum. Secara umum, penyakit inflamasi kronik yang mengenai saluran cerna disebut dengan Inflammatory Bowel Disease (IBD).

Secara garis besar IBD terdiri dari Kolitis ulseratif (KU) dan Penyakit Chron (PC).Bila terdapat kesulitan dalam membedakan kedua jenis tersebut, maka IBD itu dimasukkan dalam kategori Indeterminate colitis (Djojoningrat, 2014).

IBD banyak di temukan di daerah barat seperti di Amerika Utara, Eropa, dan Oseania. Prevalensi IBD di daerah Eropa dan Amerika adalah sekitar 50-200 per 100.000 orang untuk PC dan 120–200 per 100.000 orang untuk KU. Data prevalensi mengenai IBD di Indonesia sendiri berdasarkan survey Mustika dan Triana (2017) di Rumah Sakit Dr.Saiful Anwar Malang, sejak Januari 2010 hingga Desember 2014, dari 2170 pasien yang menjalani kolonoskopi, total pasien dengan KU adalah 176 pasien. Prevalensi KU sejak 2010-2014 adalah 8.2%

dengan frekuensi tahun 2010 sejumlah 36 pasien, tahun 2011 sejumlah 27 pasien, tahun 2012 sejumlah 36 pasien, tahun 2013 sejumlah 37 pasien dan tahun 2014 sejumlah 41 pasien.

Angka kejadian dan prevalensi IBD juga telah menunjukkan tren peningkatan di Asia dan Afrika. Selain itu, tingkat kejadian terus meningkat pada daerah epidemi rendah seperti Asia, Afrika, Eropa Timur, Eropa Selatan, Amerika Selatan dan sebagian besar negara berkembang (Chou et al., 2019). Asia-Pacific

Crohn's dan Colitis Epidemiology Study melaporkan bahwa di tahun 2011 - 2013, 8 negara di Asia mengalami kejadian IBD dengan kasus di setiap negara berkisar antara 0,5 hingga lebih dari 3 per 100.000 orang dimana insiden kolitis ulseratif adalah sekitar 1 per 100.000 di Asia (Ng, 2016). Dengan adanya data tersebut, kini IBD telah dianggap sebagai penyakit global.

Gejala yang ditimbulkan oleh penyakit ini bervariasi tergantung pada keparahan penyakit. Gejala khas pada KU adalah buang air besar yang disertai darah. Gejala ini ditemui pada lebih dari 90% pasien KU (Park et al., 2014).

Pemberian obat golongan aminosalisilat seperti Mesalazine merupakan pengobatan lini pertama pada kasus ini. Selain itu pemberian kortikosteroid juga dilakukan untuk mengurangi peradangan, terutama pada kasus yang berulang.

Tujuan terapi KU adalah perbaikan secara klinis dan endoskopi, perbaikan yang dalam dan berkelanjutan tanpa penggunaan kortikosteroid, pencegahan rawat inap dan operasi, dan peningkatan kualitas hidup (Teixeira, Hosne and Sobrado, 2015).

Dalam berbagai penelitian beberapa tahun terakhir ini, obat tradisional dari ekstrak tumbuhan telah terbukti efektif secara klinis dan relatif rendah memiliki toksisitas yang lebih kecildibanding obat yang telah ada (Al-rifai et al., 2017). Salah satu tumbuhan yang sering digunakan di masyarakat adalah gambir.

Uncaria gambir Roxb. Gambir adalah anggota keluarga Rubiaceae dan mengandung senyawa farmakologis yang telah diakui. Gambir banyak ditemukan di daerah Sumatra Barat. Selain di Sumatra Barat, Gambir juga banyak dikembangkan di Sumatera Utara. Penghasil gambir di Sumatera Utara adalah Kabupaten Tapanuli Utara, Kabupaten Tapanuli Tengah, Kabupaten Deli Serdang dan Kabupaten Pakpak Bharat. Di Pakpak Bharat, gambir adalah salah satu

komoditas utama setelah kopi, nilam dan dupa (Rauf and Zuliyanti, 2015).

Gambir mengandung catechin yang berfungsi sebagai anti-oksidan dan anti- inflamasi (Anggraini and Asben, 2019). Menurut (Yimam et al., 2015) gabungan ekstrak daun gambir dan ekstrak akar murbei memiliki efek terhadap resistensi nyeri dan pengurangan edema pada tikus yang diinduksi oleh karaginan sebagai model osteoartritis .

Untuk membuat model hewan coba pada penyakit kolitis, ada beberapa model induksi kimia yang dapat digunakan. Salah satu induksi kimia yang sering dilakukan adalah dengan menggunakan Dextran sodium sulfate (DSS). Model tikus KU yang diinduksi DSS telah banyak digunakan untuk penelitian KU dikarenakan kecepatan, kesederhanaan, reproduktifitas, dan kemampuan nya untuk dikontrol. DSS adalah sejenis polisakarida tersulfasi yang larut dalam air, bermuatan negatif, dengan berat molekul sangat bervariasi, mulai dari 5 hingga 1400 kDa. Inflamasi usus akut, kronikmaupun relaps dapat dibuat modelnya dengan memodifikasi konsentrasi dan frekuensi pemberian DSS (Chassaing et al., 2014).

Akumulasi neutrofil pada mukosa usus yang meradang adalah gambaran yang menonjol pada KU. Granul granulosit neutrofil mengandung sejumlah enzim, salah satunya yaitu myeloperoxidase yang penting dalam memerangi bakteri. Enzim granul ini beberapa di antaranya bersifat proteolitik, dapat dilepaskan dengan stimulasi bersama dengan metabolit oksigen sitotoksik. Oleh karena itu neutrofil yang diaktifkan dapat berkontribusi dalam kerusakan jaringan di tempat peradangan (Access, 2011). Aktivitas MPO dapat diukur dalam neutrofil sebagai indeks degranulasi dengan penghitung Coulter dan sitometri dan

peredaran MPO oleh Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Dengan melakukan pemeriksaan ELISA dan histopatologi pada kolon tikus yang diinduksi oleh DSS, maka dapat dinilai aktivitas ekstrak daun gambir sebagai antiinflamasi terhadap KU pada tikus yang diinduksi DSS.

1.2 Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang di atas, rumusan masalah penelitian ini adalah apakahekstrak daun gambir (Uncaria gambir Roxb) memiliki aktifitas antiinflamasi pada tikus KU yang diinduksi DSS?

1.3 Tujuan Penelitian 1.3.1 Tujuan umum

Tujuan penelitian ini adalah untuk mengevaluasi efek antiinflamasi ekstrak daun gambir (Uncaria gambir Roxb) pada tikus KU yang diinduksi DSS.

1.3.2 Tujuan khusus

Tujuan khusus penelitian adalah untuk:

1. Mengetahui efek ekstrak daun gambir terhadap kadar MPO pada tikus KU yang diinduksi DSS.

2. Mengetahui efek ekstrak daun gambir terhadap kerusakan permukaan epitel pada tikus KU yang diinduksi DSS.

3. Mengetahui efek ekstrak daun gambir terhadap infiltrasi sel inflamasi pada tikus kolitis yang diinduksi DSS.

4. Mengetahui derajat kerusakan kolon pada tikus kolitis yang diinduksi DSS.

1.4 Manfaat Penelitian

1. Mengetahui manfaat ekstrak daun gambir (Uncaria gambir Roxb) sebagai potensi sumber daya alam dalam mencegah terjadinya kolitis ulseratif.

2. Memberi informasi ilmiah dan referensi tentang ekstrak daun gambir (Uncaria gambir Roxb) dalam mengobati KU.

3. Sebagai pertimbangan masyarakat mengenai ekstrak daun gambir (Uncaria gambir Roxb) dalam mencegah terjadinya KU sehingga dapat menjadi alternatif pendamping terapi.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Anatomi dan Fisiologi Kolon

Usus besar juga dikenal sebagai kolon, adalah bagian dari saluran pencernaan. Saluran pencernaan meliputi mulut, kerongkongan, lambung, usus kecil, usus besar, dan dubur. Kolon berukuran kurang lebih seperlima dari panjang saluran gastrointestinal. Secara umum, kolon bertanggung jawab untuk memproses bahan makanan yang tidak bisa dicerna setelah sebagian besar nutrisi diserap di usus kecil dan berperan dalam penyerapan air, vitamin, dan elektrolit.Kolon terdiri dari 4 bagian yang terdiri dari sekum dan kolon asendens, kolon transversal, kolon desendens, dan kolon sigmoid (Mahadevan, 2017).

Gambar 2.1. Gambaran eksternal dari Usus Besar (Mahadevan, 2017).

2. 2. Peradangan

Peradangan adalah respons sistem kekebalan terhadap stimulus yang berbahaya, seperti adanya patogen, kerusakan sel, senyawa racun, atau radiasi.

Peradangan bekerja dengan menghilangkan stimulus dan memulai proses penyembuhan (Medzhitov, 2010). Pada tingkat jaringan, peradangan ditandai dengan kemerahan, pembengkakan, panas, nyeri, dan kehilangan fungsi jaringan, yang dihasilkan dari respon sel imun, vaskular dan, inflamasi lokal terhadap infeksi atau cedera (Zhou, Hong and Huang, 2016). Meskipun proses respon inflamasi bergantung pada stimulus awal dan lokasinya di dalam tubuh, semua nya memiliki mekanisme yang sama, yang dapat diringkas sebagai berikut: 1) reseptor permukaan sel mengenali adanya rangsangan yang merugikan; 2) aktivasi jalur inflamasi; 3) penanda inflamasi dilepaskan; dan 4) sel inflamasi direkrut (Chou et al., 2019;Chen et al., 2018).

Stimulus inflamasi mengaktifkan jalur sinyal intraseluler yang kemudian mengaktifkan produksi mediator inflamasi. Stimulus inflamasi primer, termasuk produk mikroba dan sitokin seperti interleukin-1β (IL-1β), interleukin-6 (IL-6), dan tumor necrosis factor-α (TNF-α), memediasi inflamasi melalui interaksi dengan TLRs,IL-1 reseptor (IL-1R), reseptor IL-6 (IL-6R), dan reseptor TNF (TNFR) (Kaminska, 2005). Aktivasi reseptor memicu jalur pensinyalan intraseluler yang penting, termasuk mitogen-activated protein kinase (MAPK), nuclear factor kappa (NF-κB), dan Januskinase (JAK) - signal transducer and activator of transcription (STAT) pathways. Stimulus mengaktifkan sel-sel inflamasi seperti makrofag dan adiposit, serta menginduksi produksi sitokin, protein dan enzim inflamasi. Molekul-molekul ini berpotensi sebagai biomarker

untuk diagnosis penyakit, prognosis, dan pengambilan keputusan terapeutik (Chen et al., 2018).

2.3 Enzim dan Protein Inflamasi

Protein inflamasi di dalam darah membantu memulihkan homeostasis dan mengurangi pertumbuhan mikroba selama trauma, stres, atau infeksi. Aktivasi abnormal enzim-enzim tertentu seperti high-mobility group box 1 (HMGB1), superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GPx), NADPH oxidase (NOX), inducible nitric oxide synthase (iNOS) dan cyclooxygenase (COX)-2 memainkan peran penting dalam pengembangan penyakit yang terkait peradangan, seperti penyakit kardiovaskular dan kanker (Chen et al., 2018).

Selain enzim-enzim dan protein-protein tersebut diatas, enzim antioksidan yang mempengaruhi stres oksidatif juga berperang penting dalam proses terjadinya peradangan. Peningkatan stres oksidatif menginduksi produksi reactive oxygen species (ROS), malondialdehyde (MDA), 8-Hydroxy-2-deoxyguanosine (8-OHdG) dan isoprostanes, yang masing-masing dapat mengaktifkan berbagai faktor transkripsi dan meningkatkan ekspresi gen yang mengkode faktor pertumbuhan, sitokin inflamasi dan kemokin (Chen et al., 2018).

2. 4. Kolitis Ulseratif 2.4.1. Definisi

Kolitis ulseratif (KU) adalah kelainan peradangan idiopatik kronis yang melibatkan bagian usus besar hingga rektum secara terus menerus dengan gejala seperti perdarahan saluran cerna, nyeri perut dan perdarahan pada rektum. KU didiagnosis berdasarkan gejala klinis dan bukti endoskopi peradangan pada usus

besar yang dimulai dari rektum hingga kolon. Telah diketahui bahwa faktor-faktor lingkungan juga memainkan peran penting dalam patogenesis IBD. Beberapa hal yang terjadi di awal kehidupan seperti kurangnya masa menyusui, paparan antibiotik dan faktor-faktor lain seperti polusi udara, merokok, keadaan psikologis, olahraga, dan diet adalah kontributor potensial untuk faktor pengaruh lingkungan dari perkembangan dan aktivitas penyakit IBD (Keshteli, Madsen and Dieleman, 2019;Tripathi and Feuerstein, 2019).

Gambar 2.2 Distribusi lesi pada penyakit radang usus. Lesi pada kolitis ulseratif terbatas pada usus besar dan rektum dan peradangan meluas hanya ke mukosa dan submukosa. Sebaliknya, pada penyakit chron yang juga disebut sebagai enteritis regionaldapat melibatkan area mana pun dari saluran pencernaan dan peradangan bersifat transmural. (Kumar et al., 2017)

2.4.2 Patofisiologi

1. Barier epitel

Barier epitel yang ditutupi oleh lapisan mukosa merupakan lini pertama sistem kekebalan mukosa karena menjadi pemisah antara sel imun host dan mikroba luminal. Pada KU, sintesis dan perubahan sulfasi dari beberapa subtipe musin di kolon menurun. Kerusakan pada barier epitel menyebabkan peningkatan permeabilitas yang diakibatkan karena regulasi dari tight junction. Kehilangan barrier ini memungkinkan peningkatan penyerapan antigen luminal, namun apakah mekanisme ini merupakan penyebab awal dari kolitis ulseratif masih belum jelas. Selain menciptakan barier, epitel usus juga berkontribusi sebagai pertahanan host dengan memproduksi peptida antimikroba (misal: defensin), sehingga membatasi invasi bakteri. Ekspresi dari human beta defensin mengalami upregulasi pada sampel kolon pasien KU. Tidak jelas apakah peningkatan produksi defensin ini diinduksi sebagai respons terhadap mikroorganisme, sitokin inflamasi, atau keduanya (Ordás et al., 2012).

2. Mikroflora Komensal

Terdapat interaksi yang kompleks antara sel epitel usus inang (intestinal epithelial cells), sel imun pejamu dan mikrobiota usus. Perubahan keseimbangan mikrobiota patogen komensal dapat menyebabkan kondisi pro-inflamasi yang memperburuk peradangan usus (Eichele and Kharbanda, 2017). Biasanya, sistem kekebalan usus mempertahankan keseimbangan antara toleransi terhadap flora komensal dan antigen makanan dan responsif terhadap patogen enterik. Studi yang dilakukan pada manusia juga mendukung pentingnya mikroflora enterik, tidak hanya dalam patogenesis penyakit, tetapi juga berpotensi dalam keparahan

peradangan usus dan fenotipe penyakit (kolitis ulseratif vs penyakit Crohn). Oleh karena itu, KU tampaknya merupakan hasil dari terganggunya keseimbangan homeostatik antara imunitas mukosa host dan mikroflora enterik, yang menghasilkan respons imun yang melawan bakteri komensal non-patogen (Ordás et al., 2012).

3. Pengenalan Antigen

Antigen mengaktifkan respon imun bawaan melalui interaksi dengan makrofag dan sel dendritik. Lamina propria diisi oleh makrofag dan sel dendritik yang menyajikan antigen kepada sel B dan sel T sehingga terjadi aktivasi respons imun adaptif. Pada pasien KU, terjadi peningkatan jumlah sel dendritik aktif dan matur. Peningkatan jumlah ini berkorelasi dengan aktivitas penyakit dan berperan penting dalam memulai dan mempertahankan inflamasi. Sel-sel dendritik mengekspresikan berbagai reseptor, termasuk diantaranya Toll like reseptor (TLR) dan Nucleotide-binding Oligomerization Domain-Like Receptors (NLRs). Peran utama pensinyalan TLR adalah untuk memberikan pertahanan terhadap patogen dan perlindungan dari cedera epitel, sehingga berkontribusi pada homeostasis usus dan pemeliharaan barier epitel. (Ordás et al., 2012).

Polimorfisme pada TLR dapat mengubah kerentanan terhadap infeksi enterik atau mengubah kemampuan respons imun adaptif menjadi toleran terhadap bakteri komensal. Dilaporkan bahwa polimorfisme D299GTLR4 kemungkinan menjadi faktor risiko penting pada kejadian KU pada ras kulit putih.

Aktivasi TLR memicu respons imun bawaan dan adaptif yang mengarah pada aktivasi nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NF-κB) dan faktor transkripsi lainnya yang penting dalam aktivasi kaskade inflamasi.

Pada peradangan usus kronis, NF-kB tidak hanya meregulasi fungsi-fungsi proinflamasi dan kelangsungan hidup sel di makrofag dan sel T, tetapi juga berperan dalam proteksi sel epitel, sehingga membuat perannya dalam peradangan usus menjadi cenderung rumit (Ordás et al., 2012)

4. Disregulasi respons imunologis

Pada mukosa kolon pasien dengan KU, keseimbangan homeostatik antara regulator dan efektor sel-T (mis: T-helper (Th)1, Th2, dan Th17) terganggu. Bukti menunjukkan bahwa KU dikaitkan dengan respons Th2 atipikal yang dimediasi oleh sel non classic natural killer (NK) T cell yang memproduksi interleukin 5 dan 13. Interleukin 13 sangat penting karena memberikan fungsi sitotoksik terhadap sel-sel epitel, termasuk induksi apoptosis dan perubahan dari komposisi protein dari tight junction (Ordás et al., 2012).

Gambar 2.3 Skema inflamasi pada Penyakit Krohn dan Kolitis Ulseratif . IBD adalah hasil dari efek gabungan dari perubahan interaksi host dengan mikrobiota usus, disfungsi epitel usus, gangguan respon imun mukosa dan komposisi mikrobioma usus yang berubah. (Kumar et al., 2017).

2.5 Induksi Dextran Sulphate Sodium (DSS) untuk Model Kolitis

Dextran Sulphate Sodium (DSS) adalah polisakarida yang larut dalam air dengan berat molekul yang bervariasi dari 5 hingga 1400 kDa. Model kolitis dengan DSS dapat diproduksi dengan pemberian DSS 40-50 kDa (4000-5000 MW) yang dicampur dalam air minum. Dalam penggunaannya pada proses induksi, polisakarida tidak secara langsung menginduksi inflamasi pada usus, tetapi berperan sebagai toksin kimia pada epitel kolon yang mengakibatkan cedera sel epitel dan kerusakan lapisan epitel usus sehingga menyebabkan masuknya bakteri luminal dan antigen ke dalam mukosa dan memungkinkan penyebaran inflamasi di jaringan (Kiesler, Fuss and Strober, 2015;Cerar, 2012).

Model induksi DSS relatif sederhana dibandingkan dengan model induksi lainnya dan memberikan tingkat keseragaman pada model lesi, terutama pada kolon distal. DSS sering digunakan untuk induksi kolitis pada tikus dengan gambaran klinis dan histologis yang mirip dengan KU. Gejala kolitis akibat DSS juga muncul dengan cepat, biasanya pada hari ke-3 dan mencapai puncaknya di hari ke-7 (Laroui et al., 2012). Induksi DSS cenderung lebih mudah karena dapat menyesuaikan dengan model akut dan kronis nya dengan mengatur dosis dan durasi pemberian. Konsentrasi DSS berkisar dari 1% (dengan gejala ringan dan onset tertunda) hingga 3% (Eichele and Kharbanda, 2017). Kolitis akut diperoleh dengan induksi selama 4-9 hari pemberian DSS dan kolitis kronis diperoleh dengan induksi secara terus menerus dengan DSS konsentrasi rendah atau pemberian DSS secara siklik, misalnya 4 siklus induksi DSS selama 7 hari diikuti dengan 10 hari air steril (Cerar, 2012).

2.6 Perubahan Histologi pada Kolitis yang Diinduksi DSS

Perubahan histopatologi merupakan penilaian penting dalam menentukan derajat kerusakan kolitis. Menurut Erben, et al., (2014) penilaian histologis akibat inflamasi kolon yang diinduksi secara kimia didasarkan pada 2 parameter:

1) Infiltrasi sel inflamasi:

1 (ringan): mukosa;

2 (sedang): mukosa dan submukosa;

3 (berat): inflamasi hingga transmural.

2) Struktur intestinal:

1: erosi fokal;

2: erosi ± ulserasi fokal;

3: ulserasi ekstensif ± granulasi jaringan ± pseudopolips.

Skor ditambahkan untuk memberikan gambaran histologis dengan 6 sebagai skor maksimum.

Gambar 2.3 Histomorfologi jaringan kolon distal pada kolitis yang diinduksi DSS pada mencit wild type C57BL / 6 pada hari ke-2 setelah DSS. A. Jumlah skor 1:

infiltrat sel inflamasi mukosa ringan (skor 1: 1) dengan epitel utuh (skor 2: 0); B.

Jumlah skor 2: sel inflamasi menyusup ke dalam mukosa dan submukosa (skor 1:

2) dengan epitel yang tidak rusak (skor 2: 0); C. Jumlah skor 3: infiltrat mukosa (skor 1: 1) dengan ulserasi fokal (skor 2: 2); D. Jumlah skor 4: infiltrasi sel inflamasi di mukosa dan submukosa (skor 1: 2) dan ulserasi fokal (skor 2: 2); E.

Jumlah skor 5: infiltrasi sel inflamasi sedang ke dalam mukosa dan submukosa (skor 1: 2) dengan ulserasi ekstensif (skor 2: 3); F.Jumlah skor 6: inflamasi transmural (skor 1: 3) dan ulserasi ekstensif (skor 2: 3). Pembesaran 100x; scale bars 100 μm (Erben et al., 2014).

2.7 Myeloperoksidase

Myeloperoxidase (MPO) adalah protein lisosom yang dilepaskan ke dalam fagosom neutrofil selama proses degranulasi. Di sana, ia bereaksi dengan hidrogen peroksida dan halida untuk membentuk asam hipoklorit atau dengan tirosin untuk membentuk radikal tirosil. Produk-produk ini sangat sitotoksik dan dapat dilepaskan dari sel untuk menghancurkan mikroorganisme asing. Namun, agen toksik ini juga dapat merusak jaringan normal dan berkontribusi terhadap

peradangan. MPO sering diekspresikan dalam berbagai penyakit inflamasi, termasuk IBD (Hansberry et al., 2017).

Selain terlibat dalam pengurangan jumlah mikroba secara intraseluler melalui produksi asam hipoklorit, MPO juga berperan secara ekstraseluler melalui pelepasan neutrophil extracellular traps (NETs). Seperti yang bisa dilihat padagambar 2.5, Pelepasan NETs menyebabkan anti-neutrophil cytoplasmic antibody (ANCA) associated vasculitis. Asam hipoklorit yang diproduksi setelah pelepasan MPO menyebabkan kerusakan jaringan yang signifikan. Sebaliknya, MPO yang dilepaskan oleh neutrofil di kelenjar getah bening dapat menghambat aktivasi sel dendritik dan dengan demikian menghasilkan respons sel T adaptif sehingga mengurangi cedera organ (Odobasic, Kitching and Holdsworth, 2016)

Gambar 2.4 keterlibatan MPO dalam fungsi neutrofil dalam imunitas bawaan dan adaptif. Pelepasan NETs menyebabkan anti-neutrophil cytoplasmic antibody (ANCA) associated vasculitis. Asam hipoklorit yang diproduksi setelah pelepasan MPO menyebabkan kerusakan jaringan yang signifikan. Sebaliknya, MPO yang dilepaskan oleh neutrofil di kelenjar getah bening dapat menghambat aktivasi sel dendritik dan dengan demikian menghasilkan respons sel T adaptif sehingga mengurangi cedera organ (Odobasic, Kitching and Holdsworth, 2016).

Pada tingkat respon imun adaptif, menunjukkan bahwa neutrofil yang menyusup dengan cepat melepaskan MPO di kelenjar getah bening setelah adanya

antigen. MPO yang terdeposit menekan berbagai aspek fungsi sel dendritik termasuk ekspresi molekul kostimulatori dan produksi juga migrasi sitokin (IL-12, IL-23), yang mengakibatkan penurunan generasi respon sel T CD4 termasuk aktivasi, proliferasi dan diferensiasi sel T menjadi Th1 (Odobasic, Kitching and Holdsworth, 2016)

Gambar 2.5 Neutrofil MPO menekan fungsi sel dendritik dan kekebalan adaptif.

Neutrofil yang menyusup dengan melepaskan MPO dalam kelenjar getah bening setelah adanya antigen. MPO menekan ekspresi molekul kostimulatori (misalnya, CD86) dan produksi juga migrasi sitokin (IL-12, IL-23), mengakibatkan penurunan aktivasi, proliferaasi dan diferensiasi CD44, Th17 dan Th1.

(Odobasic, Kitching and Holdsworth, 2016)

2.8 Gambir: Kandungan dan Manfaat Sebagai Anti Inflamasi 2.8.1 Morfologi dan Taksonomi Gambir

Gambir (Uncaria gambir Roxb.) adalah tanaman Asia Tenggara yang sudah banyak dikenal dan merupakan salah satu tanaman penting di pulau Sumatera (Rauf and Zuliyanti, 2015).

Tumbuhan Gambir pada penelitian ini di identifikasi di laboratorium Medanens Fakultas MIPA Universitas Sumatera Utara dan didapati hasil sebagai berikut:

Kingdom : Plantae

Divisi : Spermatophyta Kelas : Dicotyledoneae Ordo : Rubiales Famili : Rubiaceae Genus : Uncaria

Spesies : Uncaria gambir (W. Hunter) Roxb Nama Lokal : Gambir

Gambar 2.6 Uncaria gambir Roxb (Dokumentasi pribadi)

2.8.2 Gambir Sebagai Anti Inflamasi

Dalam pengobatan tradisional, Uncaria gambir Roxb digunakan untuk menyembuhkan peradangan, gangguan mulut, diare, penyakit lambung, luka bakar, jerawat, bahkan sebagai anti kanker (Musdja, Elvita and Rahayu, 2019) (Li et al., 2008). Gambir diketahui memiliki senyawa bernama Katekin. Taniguchi et al., (2008) telah melakukan penelitian tentang jenis-jenis katekin yang ada di Gambir dan menemukan 9 jenis katekin dalam gambir yaitu : (+) - catechin, (-) - epicatechin Gambiriin A1, Gambiriin A2, Gambiriin B1, Gambiriin B2, Catechin- (4α-8) -ent-epicatechin, Gambirflavan D1 dan Gambirflavan D2.

Katekin sendiri dikenal sebagai antiinlamasi dan antioksidan alami. Efek antioksidan katekin didapat melalui dua cara yaitu: (1) mekanisme langsung melalui penghambatan reactive oxygen species (ROS), (2) mekanisme tidak langsung melalui induksi enzim antioksidan dan menghambat enzim prooksidatif (Stress, Bernatoniene and Kopustinskiene, 2018).

Gambar 2.7 Efek antioksidan katekin. ROS-reactive oxygen species, SOD- superoxide dismutase, CAT-catalase, GSH-glutathione peroxidase, NADPH- oxidase-nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase, COX- cyclooxygenase, iNOS-inducible nitric oxide synthase, TNF-α–tumor necrosis factor alpha, NF-κB-nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (Stress, Bernatoniene and Kopustinskiene, 2018).

2.9 Kerangka Teori

Gambar 2.8 Kerangka Teori Induksi DSS

Kerusakan barier epitel

Peningkatan permeabilitas

Peningkatan penyerapan antigen luminal

Mikroflora komensal

Terganggunya homeostasis pada sel epitel

Peningkatan sel inflamasi di usus

Respon pengenalan antigen

Peningkatan fungsi sel dendritik

Aktivasi TLR

Aktivasi Nfkb

Disregulasi respon imunologis

Penurunan fungsi regulator dan efektor sel T (Th-1, Th- 2,Th17)

Penurunan IL-5 dan IL- 13

Perubahan fungsi dari tight junction Peningkatan

MPO

Peningkatan asam hipoklorit

Kerusakan jaringan

Ekstrak daun gambir (Uncaria gambir

Roxb) Peningkatan

neutrofil

ROS

Keterangan

= menginduksi = menghambat

= menghambat secara tidak langsung

2.10 Kerangka Konsep

Berdasarkan latar belakang dan perumusan masalah diatas, maka kerangka konsep penelitian ini adalah sebagai berikut .

Variabel bebas Variabel terikat

Gambar 2.9 Kerangka konsep

Ekstrak Daun Gambir - Histopatologis kolon

- Pemeriksaan MPO

2.11 Hipotesa Penelitian

Tahapan hipotesis penelitian ini adalah :

Ho: ekstrak daun gambir (U. gambir Roxb) tidak memiliki efek antiinflamasi terhadap kolitis yang diinduksi DSS.

Ha: ekstrak daun gambir (U. gambir Roxb) memiliki efek antiinflamasi terhadap kolitis yang diinduksi DSS.

BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian

3.1.1. Tempat Penelitian

Pembuatan ekstrak etanol 70% daun gambir dan uji Fitokimia dilakukan di Laboratorium Kimia Organik Fakultas MIPA Universitas Sumatera Utara.

Pemeriksaan histopatologi dilakukan di Laboratorium Departemen Histologi Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara. Hewan coba dipelihara di Laboratorium Pemeliharaan Hewan Coba Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara. Penggunaan dan penanganan hewan coba pada penelitian yang dilakukan di laboratorium sesuai dengan aturan etika penelitian hewan coba yang diatur dalam Deklarasi Helsinki untuk memperoleh Ethical clearance dari Komite Etik Penelitian Hewan FMIPA USU Medan (No.00683/KEPH-FMIPA/2020).

3.1.2 Waktu Penelitian

Penelitian dilakukan dalam periode Juni – November 2020.

3.2 Jenis Penelitian

Desain penelitian yang digunakan pada penelitian ini adalah uji eksperimental hewan dengan metode posttest with control grup.

3.3 Populasi dan Sampel

3.3.1 Populasi Penelitian

Populasi dalam penelitian ini adalah tikus Wistar jantan umur 2-3 bulan dengan berat 200-250 gram.

3.3.2 Besar Sampel Penelitian

Penentuan besar sampel hewan coba tikus dilakukan dengan menggunakan rumus Federer : (n-1) x (t-1) >15

Keterangan :

n = jumlah sampel tiap kelompok t = jumlah kelompok perlakuan

=(t-1) x (n-1) ≥ 15

= (4-1) x (n-1) ≥ 15

= 3(n-1) ≥ 15

= 3n-3 ≥ 15

= 3n ≥ 15+3

= 3n ≥ 18

= n ≥ 6

Pada penelitian ini jumlah sampel untuk masing-masing kelompok n = 6 ekor dan total sampel dalam penelitian ini adalah 24 ekor tikus wistar dalam 4 kelompok perlakuan.

3.3.3 Cara Pengambilan Sampel Penelitian

Pengambilan sampel penelitian dilakukan secara Purposive Sampling dengan kriteria :

Kriteria inklusi :

a. Tikus jantan galur Wistar sehat (bergerak aktif) b. umur 2-3 bulan

c. Berat badan 200 – 250 gr Kriteria ekslusi :

a. Tikus sakit atau mati selama penelitian

3.4 Rancangan Penelitian Tabel 3.1Rancangan penelitian

Kelompok Jumlah tikus

Perlakuan Hari

I 6 1. Tikus selama 7 hari dengan pemberian pakan standart dan air minum secara ad libitum.

7 hari

II 6 1. Pemberian pakan standart dan air minum secara ad libitum.

2. Tikus diinduksi dengan DSS 1%

(b/v) diberikan secara ad libitum agar tikus mengidap KU.

3. Tikus diberikan CMC 1% (b/v) dengan cara sonde lambung.

7 hari 4 hari 7 hari

III 6 1. Pemberian pakan standart dan air minum secara ad libitum.

2. Tikus diinduksi dengan DSS 1%

(b/v) diberikan secara ad libitum agar tikus mengidap KU.

3. Tikus diberikan ekstrak dengan dosis 100 mg/kgbb. Pemberian ekstrak dilakukan dengan cara sonde lambung.

7 hari 4 hari 7 hari

IV 6 1. Pemberian pakan standart dan air minum secara ad libitum.

2. Tikus diinduksi dengan DSS 1%

(b/v) diberikan secara ad libitum agar tikus mengidap KU

3. Tikus diberikan ekstrak dengan dosis 200 mg/kgbb. Pemberian ekstrak dilakukan dengan cara sonde lambung.

7 hari 4 hari 7 hari

3.5 Defenisi Operasional

Defenisi operasional pada penelitian ini adalah sebagai berikut (Tabel 3.2):

Tabel 3.2 Defenisi operasional

Variabel Defenisi Cara ukur Alat ukur Hasil ukur Skala ukur Ekstrak daun

gambir (Uncaria gambir Roxb)

Sediaan serbuk yang diperoleh dari daun gambir melalui pelarut ethanol 70%

Menimbang ekstrak sesuai dosis.,

100 dan 200 mg/kgbb

Timbang an elektrik

Jumlah sesuai dengan

konsentrasi 1. 100 mg/kgbb 2. 200 mg/kgbb

Nominal

Histopatologi kolon tikus

Jaringan kolon bagian distal yang dibuat sebagai preparat histopatolo gi

Melakukan pengamatan histopatologi kolon dengan menggunakan mikroskop dengan pembesaran 40x dan 200x

Mikroskop 1) Kerusakan permukaan epitel 0: tidak ada erosi 1: Erosi <1/2 dari ketebalan

mukosa + luas kerusakan <25%

2:Erosi <1/2 dari ketebalan

mukosa + luas kerusakan <50%

3: Erosi >1/2 dari ketebalan mukosa + luas kerusakan <50%

4. Erosi >1/2 dari ketebalan

mukosa + luas kerusakan >50%

2) Infiltrasi sel inflamasi 0: Inflamasi hanya di mukosa 1: Inflamasi di mukosa dan submukosa 2: Inflamasi hingga ke muskularis esterna dengan sebaran sel radang berjauhan 3: Inflamasi hingga ke muskularis

Nominal

esterna dengan sebaran sel radang masih bisa disusupi satu sel radang

4: Inflamasi hingga ke muskularis esterna dengan sebaran sel radang menyempit.

Seluruh skor dijumlahkan untuk

mencerminkan kerusakan jaringan

MPO Enzym

yang dilepaskan oleh netrofil

Diukur dalam neutrofil sebagai indeks degranulasi dengan penghitung Coulter dan sitometri dan peredaran MPO oleh ELISA

ELISA ng/ml nominal

3.6 Variabel Penelitian 3.6.1 Variabel Bebas

Variabel bebas adalah ekstrak daun gambir 100 mg/kgbb dan 200 mg/kgbb 3.6.2 Variabel Terikat

Variabel terikat dalam penelitian ini adalah histopatologi kolon dan MPO.

3.7 Alat dan Bahan 3.7.1 Alat

1. Kandang tikus 2. Timbangan digital

3. Sonde oral 4. Spuit 5. Oven

6. Seperangkat alat ekstraksi: blender, toples maserasi, oven, corong pisah, erlemeyer, rotary evaporator, cawan petri, kertas saring, kain flanel putih 7. Seperangkat alat bedah tikus: Papan wax, jarum, pinset anatomi dan chirurgis, gunting, scalpel

8. Seperangkat pembuatan preparat histopatologi : Botol placon, objek glass, cawan petri, kaki tiga dan bunsen, staining kit, holder, mikrotom 9. Mikroskop

3.7.2 Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah ekstrak daun gambir (Uncaria gambir Roxb), DSS merek Sigma (4000 mw), tikus jantan Wistar, aquabidest, pakan standar tikus, etanol 70%, pewarna Hematoksilin dan Eosin dan seperangkat kit ELISA untuk pemeriksaan MPO tikus.

3.8 Prosedur Penelitian

3.8.1 Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Gambir (Uncaria gambir Roxb)

Ekstrak merupakan sediaan kental dengan cara mengekstraksi senyawa aktif dari simplisia nabati maupun hewani dengan menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian pelarut tersebut diuapkan dan massa yang tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang telah ditetapkan (Depkes, 2000).

Bahan dalam penelitian ini menggunakan daun tanaman gambir. Sebanyak 4 kg daun basah yang diperoleh dibiarkan mengering dalam oven. Setelah dikeringkan, daun tersebut kemudian digiling menggunakan blender sehingga

menjadi bubuk kasar. Ekstrak etanol daun gambir dibuat dengan cara maserasi.

Serbuk kering daun gambir ditimbang sebanyak 250 gr per toples kemudian dimaserasi dengan 2,5 L ethanol 70% selama 5 hari sambil diaduk perhari kemudian disaring dengan kain flanel. Filtrat etanol yang diperoleh kemudian di evaporasi dengan menggunakan rotary evaporator agar diperoleh ekstrak kental.

Ekstrak kental kemudian dikeringkan dalam oven pada suhu 500 C selama 24 jam hingga diperoleh ekstrak serbuk sebanyak 10 gram. Ekstrak serbuk dilarutkan dengan menggunakan pelarut carboxy metil cellulose (CMC) 1% sehingga diperoleh ekstrak cair.

3.8.2 Persiapan Hewan Coba

Penelitian ini menggunakan 24 ekor tikus jantan Wistar, berumur 2-3 bulan dengan berat 200 – 250 gram. Selama tujuh hari tikus diadaptasi terhadap lingkungan (aklimatisasi) sebelum penelitian dengan ditempatkan di kandang dengan ukuran 50 x 40 x 25 cm yang di tutup kawat kasa. Tikus dikelompokkan menjadi 4 kelompok dan diberi makan dan minum secara ad libitum.

3.8.3 Pembuatan Sediaan Histopatologi Kolon

Pada akhir perlakuan tikus akan dianastesi dengan menggunakan ketamine xylazine dengan dosis 75-100 mg/kg secara intraperitoneal dengan durasi selama 10-30 menit, kemudian dilakukan pembedahan laparatomi untuk mengambil organ kolon untuk dibuatkan preparat kolon dengan metode pewarnaan hematoxylin, selanjutnya diperiksa secara mikroskopis. Sampel difiksasi dalam larutan formalin 10% sebelum diwarnai dengan hematoxylin.sampel difiksasi dalam larutan formalin 10% hingga seluruh jaringan terendam selama 24 jam. Selanjutnya digunakan dehidrasi bertingkat dengan

menggunakan alkohol 70%, clearing dengan xilol, infiltrasi, kemudian embedding dalam parafin. Masing-masing organ dari setiap ulangan dibuat 4 sayatan dengan interval 10 sayatan dengan menggunakan mikrotom, lalu diletakkan pada object glass.

3.8.4 Interpretasi Histopatologi

Pembacaan hasil preparat histolopatologi kolon tikus diamati dengan bantuan mikroskop cahaya pada pembesaran 10x4 dan 10x20. Pembacaan histopatologi kolon tikus dinilai oleh dokter spesialis patologi anatomi. Penilaian skor histopatologi dilakukan mengacu pada (Erben et al., 2014) dengan modifikasi. Derajat kerusakan kolon dihitung berdasarkan hasil skor kerusakan permukaan epitel ditambah infiltrasi inflamasi lalu dibagi 2.

1. Kerusakan permukaan epitel 0: Tidak ada erosi

1: Erosi < ½ dari ketebalan mukosa + luas kerusakan <25%

2: Erosi < ½ dari ketebalan mukosa + luas kerusakan <50%

3: Erosi > ½ dari ketebalan mukosa + luas kerusakan <50%

4: Erosi > ½ dari ketebalan mukosa + luas kerusakan >50%

2. Infiltrasi sel inflamasi

0: Inflamasi hanya di mukosa

1: Inflamasi di mukosa dan submukosa

2: Inflamasi hingga ke muskularis eksterna dengan sebaran sel radang berjauhan

3: Inflamasi hingga ke muskularis eksterna dengan sebaran sel radang masih disusupi satu sel radang

4. Inflamasi hingga muskularis eksterna dengan sebaran sel radang menyempit

Penilaian derajat kerusakan kolon dibagi atas ringan (<1), sedang (≥1-

<2,5) dan berat (≥2,5).

3.8.5 Pemeriksaan MPO

Uji kolon Myeloperoxidase (MPO) dengan menggunakan MPO Elisa Rats Kit dari Bioassay Technology Laboratory.

a. Timbang jaringan dan bekukan (–80°C) sampai dilakukannya analisis.

Timbang jaringan kolon (50 mg/jaringan) dan cuci bersih dua kali dalam PBS (pH 7,4) sampai bebas dari kotoran, dan simpan di −80 ° C sampai dianalisis.

b. Menghomogenisasi jaringan menggunakan homogenizer dengan kecepatan penuh selama 20 detik dalam PBS.

c. Setelah dihomogenisasi, sentrifuse dalam kecepatan 2000-3000 RPM selama 20 menit.

d. Tambahkan 50µl standard kedalam sumur standard.

e. Lepas penutup dan cuci plate 5 kali dengan wash buffer. Keringkan wells dengan 0,35 ml wash buffer selama 30 detik sampai 1 menit untuk tiap cucian. Keringkan plate dengan kertas atau material lain yang menyerap.

f. Tambahkan 50µl subtstrat solution A kedalam tiap well dan tambahkan 50µl substrat solution B kedalam tiap well. Inkubasi plate yang tertutup dengan penutup baru selama 10 menit didalam 37 C di dalam kegelapan.

g. Tambahkan 50µl stop solution, warna kebiruan kemudian berubah menjadi warna merah.

h. Periksa nilai densitas optik tiap well menggunakan microplate reader, set ke 450 nm dalam 10 menit setelah menambahkan stop solution.

3.8.6 Preeliminary

Preeliminary dilakukan dengan pemeriksaan MPO dan histopatologi pada 2 tikus sehat (T1 dan T2) dan 2 tikus yang di induksi dengan DSS selama 4 hari + CMC 1% selama 7 hari (T3 dan T4). Didapatkan peningkatan nilai MPO pada kedua tikus yang di induksi DSS dibandingkan dengan kedua tikus sehat (T1:

11,2411; T2:13,7237; T3: 16,6880; T4 17,6283). Pemeriksaan histopatologi menunjukkan adanya erosi epitel dan infiltrasi sel inflamasi hingga ke submukosa.

Data hasil preeliminary menjadi langkah awal bagi peneliti untuk melanjutkan penelitian ke tahap selanjutnya

Gambar 3.1 Bagian kolon distal dengan perbesaran 40x. T1: Tidak ada erosi pada epitel kolon dan sel inflamasi sebatas mukosa; T2: Terjadi erosi< ½ dari ketebalan mukosa + area kerusakan <50% dan infiltrasi sel inflamasi sampai ke submukosa

T1 T3

200x 200x

3.9 Analisis Penelitian

Uji statistik data MPO dilakukan dengan ANOVA dan data histopatologi dilakukan dengan Saphiro-Wilk. Data histopatologi kemudian di uji lanjut dengan Kruskal Walis.

3.10 Alur Penelitian

Gambar 3.2 Alur Penelitian Aklimatisasi selama 1 minggu dan diberi pakan/minum secara

ad libitum

Randomisasi tikus kedalam 4 grup

Sampel kontrol Sampel intervensi

I

Pakan normal

II

DSS 1% + CMC 1%

III DSS 1%

EDG

(100mg/kgBB)

IV DSS 1%

EDG (200mg/kgB B)

Pemeriksaan Post Test - Histologi jaringan - MPO

Laporan dan Penyajian Hasil Laporan Tikus 24 ekor

11 hari