BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Permen sediaan padat
Permen atau Kembang gula adalah produk yang merupakan campuran gula pasir dengan pewarna sintetis (alami, identik alami, tiruan) dan bahan tambahan makanan lainnya yang di izinkan (SNI 01-3722-1995).
Umumnya warna yang ditambahknan disesuaikan dengan cita rasa produk yang akan dibuat. Misalnya untuk rasa jeruk diberi warna orange.Warna dan rasa ditambahkan agar ada kesan dari buah asli.
Bahan pewarna sintesis yang boleh digunakan untuk minuman harus dibatasi jumlahnya karena pada dasarnya setiap benda sintesis yang masuk kedalam tubuh kita akan mempengaruhi kesehatan jika digunakan dalam dosis tertentu dalam jangka waktu tertentu, untuk itu kita harus memperhatikan ADI(Acceptable Daily Intake). ADI dinyatakan dalam mg/kg berat badan jumlah zat kimia yang masuk dalam setiap harinya (Yuliarti, 2007).
2.2 Bahan Tambahan Pangan
Penentuan mutu bahan pangan pada umumnya sangat bergantung pada beberapa faktor seperti cita rasa, tekstur, nilai gizinya juga sifat mikrobiologisnya. berdasarkan sumbernya dikenal dua jenis zat pewarna yang temasuk dalam golongan Bahan Tambahan Pangan (BTP), yaitu pewarna alami dan pewarna sintetis (Cahyadi, 2009).
Bahan tambahan pangan yang digunakan hanya dapat dibenarkan apabila :
1. Dimakasudkan untuk mencapai masing-masing tujuan penggunaan dalam pengolahan
2. Tidak digunakan untuk menyembunyikan penggunaan bahan yang salah atau yang tidak memenuhi persyaratan.
3. Tidak digunakan untuk menyembunyikan cara kerja yang bertentangan dengan cara produksi yang baik untuk pangan
4. Tidak digunakan untuk menyembunyikan kerusakan bahan pangan
Pengertian Bahan Tambahan Pangan dalam Peraturan Menteri Kesehatan RI No. 772/Menkes/Per/IX/88No.1168/menkes/PER/X/1999secara umum adalah bahan yang biasanya tidak digunakan sebagai makanan dan biasanya bukan merupakan komponen khas makanan, mempunyai atau tidak mempunyai nilai gizi, yang sengaja ditambahkan kedalam makanan untuk maksud teknologi pada pembuatan, pengolahan, penyiapan, perlakuan, pengepakan, pengemasan dan penyimpanan.
Terdiri dari golongan BTP yang diizinkan diantaranya sebagai berikut. 1. Antioksidan (antioxidant)
2. Antikempal (anticacking agent) 3. Pengatur keasaman (acidity regulator) 4. Pemanis buatan (artificial sweetener)
5. Pemutih dan pematang telur (flour treatment agent)
6. Pengemulsi, pemantap dan pengental (emulsifier, stabilizer, thickener) 7. Pengawet (preservative)
9. Pewarna (colour)
10. Penyedap rasa dan aroma, penguat rasa (flavor, flavor enhancer) 11. Sekuestran (sequestrant)
Tujuan Penggunaan bahan tambahan pangan adalah dapat meningkatkan atau mempertahankan nilai gizi dan kualitas daya simpan, membuat bahan pangan lebih mudah dihidangkan, serta mempermudah preparasi bahan pangan lebih mudah dihidangkan, serta mempermudah preparasi bahan pangan. Pada umumnya bahan tambahan pangan dapat dibagi menjadi dua golongan besar, yaitu sebagai berikut
1. Bahan tambahan pangan yang ditambahkan dengan sengaja kedalam makanan, dengan mengetahui komposisi bahan tersebut dan maksud penambahan itu dapat mempertahankan kesegaran, cita rasa, dan membantu pengolahan , sebagai contoh pengawet, pewarna, dan pengeras. 2. Bahan tambahan pangan yang tidak sengaja ditambahkan, yaitu bahan yang tidak mempunyai fungsi dalam makanan tersebut, terdapat secara tidak sengaja, baik dalam jumlah sedikit atau cukup banyak akibat perlakuan selama proses produksi, pengolahan, dan pengemasan. Bahan ini dapat pula merupakan residua tau kontaminan dari bahan yang sengaja ditambahkan untuk tujuan produksi bahan mentah atau penanganannya yang masih terus terbawa kedalam makanan yang akan dikonsumsi. (Cahyadi, 2006).
2.3 Pewarna Pangan
Pewarna makanan banyak digunakan untuk berbagai jenis makanan, terutama berbagai produk jajanan pasar serta berbagai makanan olahan yang dibuat oleh industri kecil ataupun industri rumah tangga meskipun pewarna buatan juga ditemukan pada berbagai jenis makanan yang dibuat oleh industri besar. Yang terakhir ini biasanya sengaja dilakukan oleh pabrik untuk membuat makanan atau minuman berkalori rendah yang ditujukan untuk penderita diabetes melitus. Hampir setiap makanan dan minuman olahan telah dicampur dengan pewarna sintetis. Penggunaannya secara terus menerus (berlebihan) dapat membahayakan kesehatan. Penggunaan pewarna sebenarnya boleh saja selama dalam jumlah terbatas. Namun demikian, apabila pewarna yang digunakan adalah pewarna nonmakanan, misalnya pewarna tekstil atau kertas ataupun pewarna makanan, tetapi dalam jumlah yang berlebihan, tentulah akan membahayakan kesehatan konsumen (Yuliarti, 2007).
Warna merupakan salah satu aspek yang penting terhadap kualitas suatu produk pada makanan. Kualitas warna dianggap sangat penting menunjukkan kualitas rasa dan tekstur dari suatu makanan agar makanan tersebut dapat diterima di masyarakat. Warna juga mengindikasikan bahwa telah terjadi reaksi kimia pada makanan (Deman, 1980).
Ada lima sebab yang dapat menyebabkan suatu bahan makanan berwarna, yaitu : 1. Pigmen yang secara alami terdapat pada tanaman dan hewan. Misalnya
klorofil berwarna hijau, karoten berwarna jingga, dan mioglobin menyebabkan warnamerah pada daging.
2. Reaksi karamelisasi yang timbul bila gula dipanasknan membentuk warna cokelat. Misalnya warna cokelat pada kembang gula karamel atau roti yang dibakar.
3. Warna gelap yang timbul karena adanya reaksi Mailard, yaitu antara gugus aminoprotein dengan gugus karbonil gula pereduksi. Misalnya susu bubuk yang disimpan lama akan berwarna gelap.
4. Reaksi antara senyawa organik dengan udara akan menghasilkan warna hitam atau cokelat gelap. Reaksi oksidasi ini dipercepat oleh adanya logam serta enzim, mislanya warna gelap permukaan apel atau kentang yang dipotong.
5. Penambahan zat warna, baik zat warna alami maupun zat warna sintetik, yangtermasuk dalam golongan bahan aditif makanan (Winarno, 1992).
2.3.1.Tujuan Penggunaan Pewarna Pangan
Berdasarkan survai yang telah dilakukan Walford (1980), ada beberapa tujuan penggunaan pewarna pangan, yaitu :
- Untuk memberikan penampilan yang menarik dari produk makanan yang telah berubah warna ketika proses pembuatan.
- memberikan warna kepada produk makanan sesuai dengan sifat makanan tersebut.
- menguatkan warna suatu produk makanan yang memiliki warna yang lemah.
- Untuk memastikan keseragaman suatu bets dari sumber yang berbeda
2.3.2.Klasifikasi Zat Pewarna Makanan 1.Pewarna Alami
Zat pewarna yang termasuk dalam uncertified color ini adalah zat pewarna alami (ekstrak pigmen dari tumbuh-tumbuhan) dan zat pewarna mineral, walaupun ada juga beberapa zat pewarna seperti β-karoten dan kantaxantin yang telah dapat dibuat secara sintetik. Untuk penggunaannya, zat pewarna ini bebas dari prosedur sertifikasi dan termasuk daftar yang telah tetap (Winarno, 1992).
Tabel 1.Sifat-sifat Bahan Pewarna Alami
Kelompok Warna Sumber Kelarutan Stabilitas
Karamel cokelat gula dipanaskan air Stabil Antosianin jingga, merah,
biru
tanaman air peka
terhadap panas dan Ph
Flavonoid kuning tanaman air stabil
terhadap panas Batalain Quinon Xanthon kuning, merah kuning-hitam kuning tanaman tanaman tanaman air air air sensitif terhadap panas
`Karotenoid kuning, merah tanaman/hewan air Stabil terhadap panas
Klorofil hijau tanaman lipid
air
sensitif terhadap panas
Heme merah, cokelat hewan air sensitif
terhadap panas Sumber : Cahyadi (2006)
Banyak warna cemerlang yang dipunyai oleh tanaman dan hewan dapat digunakan sebagai pewarna untuk makanan. Beberapa pewarna alami yang berasal dari tanaman dan hewan, diantaranya adalah klorofil, mioglobin dan hemoglobin, antosianin, flavonoid, tannin, quinon dan xanton, serta karotenoid seperti table diatas (Cahyadi, 2009)
Banyak sekali bahan alami yang dapat digunakan sebagai pewarna makanan, umumnya pewarna alami aman untuk digunakan dalam jumlah yang besar sekalipun, berbeda dengan pewarna sintesis yang demi keamanan penggunaanya harus dibatasi dengan melihat ADI-nya (Yuliarti, 2007)
2.Pewarna Sintetis
Zat pewarna ditambahkan kedalam makanan bertujuan untuk menarik selera dan keinginan konsumen. Zat-zat Pewarna alam yang sering digunakan misalnya, karoten, kunyit dan daun-daun pandan. Dibandingkan dengan bahan pewarna alami, maka bahan pewarna buatan mempunyai banyak kelebihan yaitu dalam hal aneka ragam warnanya, keseragaman warna, kestabilan warna, dan penyimpanannya lebih mudah dan lebih tahan lama. Selain dari pada itu bahan pewarna alami biasanya warnanya jarang yang sesuai dengan warna yang di ingini. (Winarno, 1980)
2.Kestabilan Beberapa Pewarna Tabel Sintetis
Perwarna Nomor Indeks Warna (C.I.No)
Batas Maksimum Penggunaan Amaran Amaranth: CI Food
Red 9 16185 Secukupnya Biru Berlian Brilliant Blue FCF: CI 42090 Secukupnya
Eritrosin Food red 2 Eritrosin: CI
45430
Secukupnya Hijau FCF
Food red 14 Fast green FCF: CI
42053 Secukupnya Hijau S
Food green 3 Green S: CI Food 44090 Secukupnya Indigotin Green 4 Indigotin: CI Food 73015 Secukupnya Ponceau 4R Blue I Ponceau 4R: CI 16255 Secukupnya Kuning Food red 7 74005 Secukupnya Karmoisin Carmoisine; CI Food Red 3; 14720 Secukupnya
Di Indonesia, peraturan mengenai penggunaan zat pewarna yang diizinkan dan dilarang untuk pangan diatur melalui SK Menteri Kesehatan RI Nomor 722/Menkes/Per/IX/88 mengenai Bahan Tambahan Pangan (BTP). Akan tetapi, seringkali terjadi penyalahgunaan pemakaian zat pewarna untuk sembarang bahan pangan, misalnya zat pewarna untuk tekstil dan kulit dipakai untuk mewarnai bahan pangan. Hal ini jelas sangat berbahaya bagi kesehatan karena adanya residu logam berat pada zat pewarna tersebut (Yuliarti, 2007)
Struktur beberapa pewarna sintetik terlihat pada gambar 2.1
a. Tartrazine
c.Briliant Blue d. Allura Red
Tabel 3.Kestabilan Beberapa Pewarna Sintetis
Pewarna Kestabilan terhadap
Cahaya Oksidasi pH
Eritrosin Sangat baik Rendah Sangat rendah Merah
Allura
Sangat baik Rendah Baik
Kuning FCF
Sedang Rendah Baik
Hijau FCF Rendah Sangat rendah Baik
Biru Berlian Rendah Sangat rendah Baik Indigotin Sangat rendah Sangat rendah Baik
Tartrazin Baik Rendah Baik
Zat warna yang termasuk golongan dyes telah melalui prosedur sertifikasi yang ditetapkan oleh US-FDA. Sedangkan zat pewarna lakes yang hanya terdiri dari satu warna, tidak merupakan campuran, juga harus mendapat sertifikat. Dalam certified colour terdapat spesifikasi yang mencantumkan keterangan yang penting mengenai zat pewarna tertentu, misalnya bentuk garam, kelarutan, dan residu yang terdapat didalamnya. Pada umumnya pewarna sintetis lebih stabil terhadap pH, cahaya, dan faktor lainnya selama pengolahan dan penyimpanan (Cahyadi, 2008).
Tabel 4.Golongan Pewarna Sintetik
Golongan Contoh Pewarna
Azo Dyes Allura Red (Merah Allura)
Amaranth, Azorubin (Carmoisin), Briliant Black, Brown FK, Brown HT, Litol Rubin BK, Ponceau 4R, Merah 2G, Sunst Yellow, Tartrazine
Triarylmethane Dyes Briliant Blue FCF, Fast Green FCF, Green S, Patent Blue V
Quinophthalon Dyes Quinoline Yellow (Kuning Kuinelin)
Xanthene Dyes
Indigo Dyes
Erythrosine (Eritrosin)
Tabel 5. Pewarna Sintetik yang diizinkan dan yang dilarang di Indonesia Pewarna yang Diizinkan
Pewarna Nomor Indeks Warna (C.I. No)
Amaran 16185 Biru Berlian 42090 Eritrosin 45430 Hijau FCF 42053 Hijau S 44090 Indigotin 73015 Ponceau 4R 16255 Kuning Kuinelin 15980 Sunset Yellow 15985 Tartrazin 19140 Carmoisin 14720
Pewarna yang Dilarang
Citrus Red 12156 Ponceau 3R 16155 Ponceau SX 14700 Rhodamin B 45170 Buinea Green B 42085 Magentha 42510 Chrysoidine 11270 Butter Yellow 11020 Sudan I 12055 Methanil Yellow 13065 Auramine 41000 Oil Orange SS 12100 Oil Orange XO 12140 Oil Yellow AB 11380 Oil Yellow OB 11390 Sumber : Cahyadi (2008)
Ada dua macam yang tergolong certified color yaitu dye dan lake. Keduanya adalah zat pewarna buatan. Zat warna yang termasuk golongan dye telah melalui prosedur sertifikasi dan spesifikasi yang ditetapkan oleh FDA (Food and Drug Administration) Dye adalah zat pewarna yang umumnya bersifat larut dalam air,
sehingga larutannya menjadi berwarna dan dapat digunakan untuk mewarnai bahan. Pelarut yang dapat digunakan selain air adalah propilen glikol, gliserin atau alkohol, sedangkan dalam semua jenis pelarut organik, dye tidak dapat larut. (Winarno,1992).
2.4. Efek Bahan Pewarna Terhadap Kesehatan
Sejumlah makanan yang kita konsumsi tidak mengandung zat berbahaya menurut daftar zat warna yang dinyatakan sebagai bahan berbahaya (Peraturan Menteri Kesehatan Republik Indonesia Nomor 722/Menkes/Per/IX/88). Namun demikian, penggunaan pewarna tersebut hendaknya dibatasi karena meskipun relatif aman, penggunaannya dalam jumlah yang besar tetap dapat membahayakan kesehatan masyarakat. Menurut Cahyadi (2009), zat warna diabsorbsi dari dalam saluran pencernaan makanan dan sebagian dapat mengalami metabolisme oleh mikroorganisme dalam usus. Dari saluran pencernaan dibawa langsung ke hati, melalui vena portal atau melalui sistem limpatik ke vena superior. Zat warna yang dimetabolisme dan dikonjugasi di hati, selanjutnya ada juga yang ke empedu memasuki jalur sirkulasi enterohepatik. Zat warna azo yang larut dalam air diekskresi secara kuantitatif melalui empedu, sedangkan yang larut dalam lemak diabsorpsi sempurna tanpa metabolisme dalam usus, melainkan dimetabolisme dalam hati oleh azo-reduktase membentuk amin primer yang sesuai, atau dapat juga dihidrolisis, atau diikat oleh protein-protein hati. Senyawa yang merupakan metabolit polar cepat dieliminasi lewat urine. Beberapa senyawa azo, terurai pada ikatan azo-nya membentuk aminonaftol.
Efek kronis yang disebabkan oleh zat warna azo yang dimakan dalam jangka waktu lama menyebabkan kanker hati. Selain senyawa-senyawa azo lain mengakibatkan kanker walaupun efeknya lebih kecil dan waktunya lebih lama. Para ilmuwan pada umumnya mempergunakan zat warna azo dalam penelitiannya, karena hampir 90% dari bahan pewarna pangan terdiri dari zat warna azo (Cahyadi, 2006).
2.5.Kromatografi
Kromatografi adalah suatu tehnik pemisahan molekul berdasarkan perbedaan pola pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen (berupa molekul) yang berada pada larutan.
Pembagian Kromatografi Fase Gerak dan Fase Diam sebagai berikut; 1.Kromatografi kertas
Kromatografi kertas menggunakan fase diam kertas, yakni kandungan selulosa di dalamnya, sedangkan untuk fase gerak yang digunakan adalah pelarut atau campuran pelarut yang sesuai. Kertas sebagai fase diam akan dicelupkan ke dalam sampel dan pelarut, selanjutnya sampel dan pelarut berdasarkan gaya kapilaritas akan terserap dan bergerak ke atas. Perbandingan jarak relatif antara senyawa (sampel) dengan jarak pelarut dihitung sebagai nilai Rf. Aplikasi penggunaan dari kromatografi kertas sendiri adalah untuk memisahkan diantaranya adalah tinta, zat pewarna, senyawa tumbuhan seperti klorofil , make up dan berbagai zat lainnya. Mekanisme kerja dari kromatografi kertas cukup sederhana, di laboratorium kita sering melakukan percobaan menggunaan teknik kromatografi kertas tersebut.
Prinsip Kromatografi Kertas
Senyawa partisi antara dua cairan yang saling tidak bercampur. Jadi partisi suatu senyawa terjadi antara kompleks selulosa-air dan fase gerak yang melewatinya berupa pelarut organik yang sudah dijenuhkan dengan air atau campuran pelarut.
2.Kromatografi lapis tipis
Kromatografi lapis tipis biasa menggunakan sebuah lempengan tipis yang berbalut tipis gel silica atau alumina. Silika atau alumina tersebut berfungsi sebagai fase diam materi juga digunakan sebagai fase diam asalkan mampu mengalami pendaflour (fluorsence) dalam sinar ultraviolet sementara untuk fase gerak yang digunakan adalah pelarut atau campuran pelarut yang digunakan untuk mengetahui jenis pada campuran asam amino tertentu.
Prinsip Kromatografi Lapis Tipis
Prinsipnya didasarkan atas partisi dan adsorpsi. Zat penyerap merupakan fase stasioner, berupa bubuk halus dibuat serba rata dan tipis diatas lempeng kaca. Fase diam yang umum digunakan adalah silika gel, baik yang fase normal maupun fase terbalik
3.GC ( Gas chromatography)
Kromatografi gas adalah proses pemisahan campuran menjadi komponen- komponennya dengan menggunakan gas sebagai fase bergerak yang melewati suatu lapisan serapan (sorben) yang diam.
Prinsip Kerja Kromatografi Gas
Gas pembawa (biasanya menggunakan helium, argon / nitrogen) dengan tekanan tertentun dialirkan secara konstan melalui kolom yang berisi fase diam.
4.HPLC(High Performance Liquid Chromatography) atau Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Tehnik Pemisahan HPLC memiliki banyak keunggulan di banding dengan kromatografi lainnya, diantaranya adalah cepat dalam proses dalam analisa, resolusi yang lebih tinggi, sentivitas detector yang lebih tinggi, kolom yang dipakai dapat digunakan kembali, ideal dan cocok untuk zat bermolekul besar berionik dan mudah untuk rekoveri sampel. HPLC boleh di bilang sebagai tehnik tercanggih dalam metode kromatografi. HPLC juga menggunakan sistem instrumen seperti pada kromatografi gas. Didalam ini juga digunakan tekanan dan
kecepatan yang cukup tinggi sehingga mampu dihasilkan resolusi yang lebih baik. 5.Kromatografi kolom
Kromatografi kolom menjadi tipe yang paling umum digunakan. Ciri khas dari tipe ini adalah penggunaan sebuah tabung kaca kolom dengan diameter 5 hingga 50 mm dan tinggi 5 cm hingga 1 meter sebagai wadah bahan fase stasioner. Bahan campuran (larutan) masuk melalui sisi atas tabung dan mengalir perlahan melewati bahan stasioner. Zat-zat penyusun campuran akan terpisah berdasarkan kecepatannya mengalir di dalam bahan stasioner. Zat yang paling cepat mengalir akan mencapai bagian outlet tabung terlebih dahulu, dan diikuti dengan zat-zat yang lainnya.
Prinsip Kerja Kromatografi Kolom
Pada bahan stasioner yang digunakan, yaitu berupa silica gel atau juga alumina. Serupa dengan alumina(silica gel) memiliki struktur kimia inti silikon dioksida, dimana atom silikon berikatan dengan oksigen dan membentuk struktur kovalen besar. Selanjutnya pada sisi permukaan struktur silica, setiap atom silikon terikat dengan molekul OH–. (Gritter, 1991).
Kromatografi Kertas dan Kromatografi Lapis Tipis merupakan metode kromatografi yang sederhana.Kromatografi Kertas merupakan jenis kromatografi partisi, dimana fasa diam adalah air yang disokong oleh molekul-molekul selulosa dari kertas, dan fasa gerak merupakan campuran dari satu atau lebih pelarut-pelarut organik dan air.Kromatografi Kertas sudah sering digunakan untuk mengidentifikasi pewarna sintetik pada makanan.Bahkan metode ini hingga saat ini masih digunakan oleh Balai Besar Pengawas Obat dan Makanan (POM) (Gritter, 1991).
Prosedur penyiapan sampel dari kedua metode kromatografi ini sama yakni, sejumlah cuplikan ditambahkan asam asetat encer kemudian masukkan benang wool bebas lemak secukupnya, lalu dipanaskan diatas nyala api kecil selama 30 menit sambil diaduk. Benang wool dicuci dengan air hingga bersih. Pewarna dilarutkan dari benang wool dengan penambahan ammonia 10% diatas penangas air hingga sempurna. Totolkan pada kertas kromatografi (pada Kromatografi Kertas) ataupun plat lapis tipis (pada Kromatografi Lapis Tipis), juga totolkan baku pembanding. Elusi dengan eluen yang sesuai pada suhu kamar (Cahyadi, 2009).
Menurut Sastrohamidjojo, H (1991) menyatakan bahwa apabila akan melakukan pemisahan dengan kromatografi kertas maka hal-hal seperti berikut perlu mendapatkan perhatian.
2.5.1. Metode Pemisahan
Ada beberapa metode dalam pemisahan dengan kromatografi kertas diantaranya :
- Metode penurunan yaitu berupa bejana yang terbuat dari gelas, platina atau logam tahan karat yang di atasnya ditutup untuk mencegah dari pelarut. Untuk menyangga agar kertas tak lepas perlu diberi penahan dari batang gelas. Untuk beberapa centimeter pelarut mengalir oleh gaya kapiler dan mengalir oleh gravitasi setelah permukaan pelarut melintasi batang gelas.
- Metode penaikan. Bejana yang digunakan untuk kromatografi penaikan sama seperti untuk kromatografi penurunan, tetapi pelarut diletak dibagian bawah bejana dan kertas dicelupkan di atasnya.
- Metode mendatar. Dalam cara ini kertas dibentuk bulat ditengahnya diberi lubang sebagai tempat untuk meletakkan sumbu yang terbuat baik dari gulungan kertas atau dari benang dimana melalui ini pelarut akan naik yang kemudian akan membesahikertas untuk kemudian mengembang, melingkar, membawa senyawa yang dipisahkan.
2. 5.2. Secara Kromatografi Kertas
Kromatografi kertas menggunakan kertas saring whatman no. 1 dan sampai saat ini masih dipakai.Kertas dalam pemisahan terutama mempunyai
pengaruh pada kecepatan alir pelarut.Sedangkan fungsi dari kertas sendiri sangat kompleks.Efek-efek serapan disebabkan oleh sifat polar dari gugus-gugus hidroksil dimana ini kemungkinan sangat penting dan sejumlah kecil dari gugus karboksil dalam selulosa dapat menaikkan terhadap efek-efek pertukaran ion.Kecepatan aliran naik dengan penurunan kekentalan dari pelarut (dengan kenaikan dalam suhu), tetapi aliran pelarut pada suhu yang tertentu, ditentukan oleh kerapatan dan tebalnya kertas.
2.5.3. Pelarut
Fase bergerak biasanya merupakan campuran yang terdiri atas satu komponen organik yang utama, air dan berbagai tambahan seperti asam-asam, basa atau pereaksi-pereaksi kompleks untuk memperbesar kelarutan dari beberapa senyawa atauuntuk mengurangi yang lainnya.Anti oksidan sering digunakan juga dan harus didapati dengan kemurnian yang tinggi.Pelarut harus sangat mudah menguap, karena terlampau cepat mengadakan kesetimbangan, pada keadaan yang lain volalitas yang tinggi mengakibatkan lebih cepat hilang meninggalkan lembaran kertas setelah bergerak. Kecepatan bergeraknya harus tidak cepat dipengaruhi oleh perubahanperubahan suhu. Contoh penggunaan dari pelarut yang dipilih untuk senyawa- senyawa organik yang polar akan lebih mudah larut dalam air dari pada dalam zat –zat cair organic akan terjadi gerakan-gerakan yang lambat jika fase bergerak anhidrida digunakan, penambahan air terhadap pelarut akan menyebabkan senyawa-senyawa tersebut untuk bergerak. Jadi n-butanol bukan merupakan suatu pelarut untuk asam-asam amino jika tidak dijenuhkan dengan air penambahan asam cuka disertai dengan pemberian lebih banyak air akan menjadi baik, yaitu akan menaikkan kelarutan dari asam-asam amino terutama yang
bersifat basa, campuran tiga komponen ini sangat baik untuk senyawa senyawa asam amino.
2.5.4. Cara Penempatan Cuplikan Pada Kertas
Larutan campuran yang akan dipisahkan ditempatkan pada kertas yang berupa noda. Biasanya dibiarkan untuk berkembang membentuk suatu bulatan. Bagian kertas yang ditetesi dibiarkan dalam keadaan mendatar, sehingga larutan pada keadaan kompak dalam bentuk bulatan. Dan jangan biarkan kertas tersentuh zat-zat yang lain. Biasanya diameter dari noda yang digunakan adalah 0,5 cm (Sastrohamidjojo, 1991).
2.5.5 Identifikasi Dari Senyawa-Senyawa
Menurut Sastrohamidjojo, H (1991) menyatakan bahwa dalam mengidentifikasi noda noda dalam kertas sangat lazim menggunakan harga Rf (retordation factor) yang didefenisikan sebagai :
Rf = 𝐽𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑅𝑎𝑚𝑏𝑎𝑡 𝑍𝑎𝑡 𝑇𝑒𝑟𝑙𝑎𝑟𝑢𝑡
𝑍𝑎𝑡 𝑟𝑎𝑚𝑏𝑎𝑡 𝑧𝑎𝑡 𝑃𝑒𝑙𝑎𝑟𝑢𝑡
Nilai maksimum Rf adalah 1 dan ini dicapai ketika solut mempunyai perbandingan distribusi dan faktor retensi sama dengan 0 yang berarti senyawa bermigrasi dengan kecepatan yang sama dengan fase gerak. Nilai minimum Rf adalah 0 dan ini teramati jika senyawa tertahan pada posisi titik awal dipermukaan fase diam (Rohman, 2007).
Ada beberapa faktor yang menentukan harga Rf yaitu diantaranya adalah :
1. Pelarut, disebabkan pentingnya koefisien partisi, maka perubahan-perubahan yang sangat kecil dalam komposisi pelarut dapat menyebabkan perubahan-perubahan harga Rf.
2. Suhu, perubahan dalam suhu merubah koefisien partisi dan juga kecepatan aliran.
3. Ukuran dari bejana, volume dari bejana mempengaruhi homogenitas dari atmosfer jadi mempengaruhi kecepatan penguapan dari komponen-komponen pelarut dari kertas.
4. Kertas. Pengaruh utama kertas pada harga Rf timbul dari perubahan ion dan serapan, yang berbeda untuk macam-macam kertas. Kertas mempengaruhi kecepatan aliran.ia akan juga mempengaruhi pada kesetimbangan partisi.
5. Sifat dari campuran. Berbagai senyawa mengalami partisi dan antara volume-volume yang sama dari fase tetap dan bergerak. Mereka hampir selalu
mempengaruhi karakteristik dari kelarutan satu terhadap yang lainnya hingga harga Rfnya.
