Laporan 3 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

(1)

Laporan Praktikum KI2221 Pemisahan dan Elektrometri

Percobaan 3

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Nama : Airlangga Diandra Putra

NIM : 10512038

Kelompok : 4

Tanggal Percobaan : 22 April 2014 Tanggal Pengumpulan : 29 April 2014

Asisten, NIM : Kurniawan

LABORATORIUM KIMIA ANALITIK PROGRAM STUDI KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG

(2)

I. Tujuan Percobaan

Menentukan konsentrasi kafein dalam sampel kopi dan teh

II. Teori Dasar

Kromatografi merupakan suatu teknik pemisahan berdasarkan partisi senyawa analit terhadap fasa diam dan fasa gerak. Metoda kromatografi cair kinerja tinggi (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) merupakan metoda kromatografi dimana digunakan tekanan yang tinggi untuk mendorong pelarut (fasa gerak) menuju suatu kolom (fasa diam) yang berisi partikel-partikel pengemasnya.

Kafein adalah senyawa polar yang larut dalam metanol. Apabila kadar kafein ingin ditentukan dengan kromatografi, kafein harus diekstrak dari sampel ke pelarut yang lebih non-polar. Tetapi, apabila fasa diam yang digunakan bersifat non-polar dengan fasa gerak yang polar, ekstrasi tersebut tidak perlu dilakukan. Pada monitor kromatogram akan terbentuk dimana tingginya berbanding lurus dengan konsentrasi kafein, sehingga konsentrasinya dapat ditentukan.

III. Alat dan Bahan

a. Bahan b. Alat

1. Larutan standar kafein 500 ppm 1. Gelas kimia 2. Larutan asam fostfat 5% 2. Gelas ukur 3. Metanol(aq) 3. Pipet tetes

4. Aqua Bidest 4. Instrumen HPLC 5. Produk minuman ber-kafein 5. Labu takar 6. Aqua DM 6. Syringe

(3)

IV. Cara Kerja

Dimasukkan 140 mL Aqua Bidest ke dalam gelas kimia lalu ditambahkan 1.4 mL H3PO4 5% dan 60 mL metanol, dihilangkan gas terlarut dengan ultrasonic bath.

Dibuat 5 mL larutan standar kafein 20, 40, 60, 80, dan 100 ppm dari larutan standar kafein 500 ppm dengan eluen sebagai penanda-batas pada labu takar. Dilarutkan sampel serbuk kopi dan teh celup dalam air dan dipanaskan dilanjutkan dengan pengenceran hingga 25 mL (eluen sebagai penanda-batas). Dilakukan analisis terhadap kelima larutan standar kafein dan terhadap kedua sampel dengan kromatografi cair kinerja tinggi. Dilakukan pembilasan terhadap syringe dan tempat injeksi syringe yang akan dipakai terlebih dahulu menggunakan aqua DM dan larutan yang akan diuji. Ditentukan waktu retensi dari larutan analit dan ditentukan konsentrasi kafein di dalam sampel.

V. Data Pengamatan

Fasa diam : C-18

Panjang kolom : 12.5 cm

Ukuran partikel : 5.0 µm

Fasa gerak : Metanol-air (65%-35%) Laju alir : 1.0 mL/menit

Volum injeksi : 20.0 µL Tekanan gas : 180.0 barr Panjang gelombang UV : 280.0 nm

(4)

1 0.994 BB 0.0873 22.19830 3.53165 2.2758 2 1.179 BV 0.1225 34.01767 3.59002 3.4875 3 1,348 VB 0,0813 919,20111 174,96242 94,2367

Total 975.41708 182.08409

2. Larutan standar kafein 40 ppm

Puncak ke- tr (menit) Tipe Puncak w (menit) Luas area (mAU*s) Tinggi puncak (mAU) %Luas area 1 0.998 BB 0.0744 16.58859 3.10160 0.9144 2 1.182 BV 0.1188 39.20728 4.36484 2.1613 3 1.350 VB 0.0819 1758.28345 331.32278 96.9243 Total 1814.07932 338.78922

(5)

3. Larutan standar kafein 60 ppm Puncak ke- tr (menit) Tipe Puncak w (menit) Luas area (mAU*s) Tinggi puncak (mAU) %Luas area 1 1.000 BB 0.0713 16.16898 3.29210 0.6679 2 1.186 BV 0.1161 41.82574 4.68939 1.7276 3 1.352 VB 0.0813 2363.00488 449.92599 97.6045 Total 2420.99960 457.90749

(6)

1 0,772 BV 0,1213 103,18629 12,12074 3,0456 2 1,000 VB 0,0677 19,324430 4,197310 0,5704 3 1,186 BV 0,114 42,561270 4,894970 1,2562 4 1,352 VB 0,0804 3222,92432 622,59247 95,1277

Total 3387,99631 643,80538

5. Larutan standar kafein 100 ppm

Puncak ke- tr (menit) Tipe Puncak w (menit) Luas area (mAU*s) Tinggi puncak (mAU) %Luas area 1 1.002 BB 0.0616 13.85685 3.257185 0.3136 2 1.190 BV 0.1105 46.66743 5.526670 1.0560 3 1.353 VB 0.0809 4358.54736 834.61401 98.6304 Total 4419.07164 843.39787

(7)

6. Larutan sampel teh Puncak ke- tr (menit) Tipe Puncak w (menit) Luas area (mAU*s) Tinggi puncak (mAU) %Luas area 1 1.114 BV 0.5172 5794.49609 548.89172 53.6271 2 1.353 VV 0.0890 3728.34521 630.58948 34.5052 3 1.608 VB 0.3159 1282.31665 55.848860 11.8676 Total 1.08052-E4 1235.33006

(8)

1 1.148 BV 0.1204 1.27686-E4 1544.72083 53.2653 2 1.350 VV 0.0879 1.01700-E4 1800.25854 42.4250 3 1.525 VB 0.0924 686.20221 110.51438 2.86260 4 1.744 BB 0.0878 137.87712 25.199636 0.57520 5 2.531 BV 0.0974 42.105380 6.513920 0.17560 6 2.698 VBA 0.1792 166,94238 14.84260 0.69640 Total 2.39717-E4 3502.04963

(9)

VI. Pengolahan Data

1. Pembuatan kurva kalibrasi larutan standar kafein

[Kafein] (ppm) Luas area (mAU*s) Tinggi puncak (mAU)

20.0 919.201110 174.96242 40.0 1758.28345 331.32278 60.0 2363.00488 449.92599 80.0 3222.92432 622.59247 100.0 4358.54736 834.61401 y = 41.717x + 21.392 R² = 0.9886 900 1650 2400 3150 3900 4650 20 40 60 80 100 Lu as ar e a (m A U*s) Konsenrasi kafein (ppm)

Kurva kalibrasi luas vs konsentrasi kafein

y = 8.0529x - 0.4883 R² = 0.9897 150 250 350 450 550 650 750 850 20 40 60 80 100 Ti n gg i p u n ca k (m A U) Konsentrasi kafein (ppm)

(10)

Kopi 10170.0000 1800.25854

a. Berdasarkan luas kromatogram

y = 41.717x + 21.392 ; (y adalah luas puncak, x adalah konsentrasi kafein) Teh → 3728.34521 = 41.717 [Kafein] + 21.392

[Kafein]sampel = 88.8595 ppm x faktor pengenceran

[Kafein]sampel = 88.8595 ppm x 5 = 444.2975 ppm

Kopi → 10170.0000 = 41.717 [Kafein] + 21.392

b. Berdasarkan tinggi puncak kromatogram

y = 8.0529x - 0.4883 (y adalah tinggi puncak, x adalah konsentrasi kafein) Teh → 630.589480 = 8.0529 [Kafein] - 0.4883

Kopi → 1800.25854 = 8.0529 [Kafein] - 0.4883

Sampel Konsentrasi kafein1 (ppm) Konsentrasi kafein2 (ppm)

Teh 444.2975 391.8326

Kopi 1216.3635 1118.0735

Keterangan. 1Pengukuran berdasarkan luas kromatogram

(11)

VII. Pembahasan

Pada percobaan kali ini, dilakukan penentuan kadar kafein di dalam larutan sampel teh dan sampel kopi dengan metoda pemisahan kromatografi cair kinerja tinggi (High Performance Liquid Chromatography, HPLC). Metoda kromatografi ini merupakan analisis kualitatif sekaligus kuantitatif, dengan variabel kualitatifnya adalah waktu retensi dari sampel. Prinsip kerja dari HPLC adalah menggunakan suatu pompa bertekanan tinggi untuk mendorong fasa geraknya yan berupa pelarut agar dapat melewati fasa diam yang berupa kolom berisikan partikel pengemas. Pada percobaan ini digunakan HPLC dengan jenis fasa terbalik, yaitu fasa diamnya non-polar (C-18) dan fasa geraknya non-polar (metanol:air = 65:35). Pada instrumen HPLC, pelarut-pelarut harus dihilangkan komponen gasnya untuk menghalangi pembentukan gelembung-gelembung, dan penghilangan ini dapat dilakukan menggunakan

ultrasonic bath.

C-18 merupakan senyawa silika yang pada permukaannya diberikan lapisan Xilena, sehingga fasa diam ini bersifat non-polar. Komposisi metanol-air yang digunakan sebagai eluen dipilih 65-35 dikarenakan komposisi tersebut yang memberikan hasil pemisahan kromatogram yang baik dengan waktu analisis yang se-sebentar mungkin (dengan pembanding hasil percobaan pada komposisi lain). Metoda peng-elusi-an analit yang dilakukan adalah elusi isokratik, yaitu komposisi eluen yang dipakai selama proses elusi adalah tetap (65-35), tidak berubah, sedangkan metoda elusi lainnya adalah elusi gradien, komposisi eluen berubah selama proses elusi. Air merupakan fasa gerak yang lemah dan memiliki retensi yang besar, sedangkan metanol memiliki kekuatan elusi yang lebih besar dibandingkan dengan air, pelarut-pelarut ini sering digunakan karena harga yang lebih murah dibandingkan pelarut-pelarut organik lain dan tidak terlalu berbahaya jika dibuang ke lingkungan. Pada percobaan ini digunakan metoda elusi isokratik dikarenakan sudah diketahui bahwa komponen penyusun sampel tidaklah terlalu banyak sehingga tidak perlu dilakukan pemisahan yang banyak dengan metoda elusi gradien.

Suatu komponen dapat terpisah dari komponen penyusun senyawa lainnya dalam kromatografi dikarenakan perbedaan interaksi antara komponen tersebut dengan fasa gerak dan fasa diam. Interaksi yang dimaksudkan dalam HPLC ini adalah interaksi kemiripan sifat kepolaran, komponen suatu senyawa memiliki sifat kepolaran yang berbeda-beda, sifat tersebut dapat dimanfaatkan untuk dilakukan pemisahan. Kemiripan sifat kepolaran akan menyebabkan suatu komponen akan lebih

(12)

mempercepat waktu analisis. Kafein yang bersifat polar akan lebih terlarut dalam fasa diam dan akan memiliki waktu retensi yang lebih rendah dibandingkan komponen lainnya yang lebih bersifat non-polar namun akan memiliki waktu retensi yang lebih besar dibandingkan komponen lainnya yang bersifat lebih polar dibandingkan kafein. Waktu retensi akan bervariasi tergantung kepada: tekanan yang digunakan (mempengaruhi laju alir pelarut); sifat fasa diam (komponen dan ukuran partikel); komposisi pelarut; dan suhu kolom.

Detektor yang digunakan pada instrumen HPLC kali ini adalah spektrofotometer UV-VIS, sebuah metoda umum yang mudah untuk menjelaskan menggunakan penyerapan ultra-violet. Banyak senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa panjang gelombang. Jika seberkas sinar UV dilewatkan pada aliran cairan yang keluar dari kolom, dan detektor UV berada pada bagian berlawanan dari berkas cahaya, maka dapat didapatkan pembacaaan langsung berapa banyak cahaya yang diserap. Jumlah cahaya yang diserap bergantung kepada jumlah senyawa tertentu yang melewati sinar pada saat itu. Pelarut yang digunakan juga menyerap sinar UV, tetapi senyawa yang berbeda akan menyerap sinar terkuat dalam bagian berbeda pada spektrum UV. Metanol menyerap pada panjang gelombang dibawah 205 nm dan air dibawah 190 nm. Sehingga jika digunakan campuran metanol-air sebagai pelarut harus digunakan panjang gelombang yang lebih besar dari 205 nm untuk mencegah pembacaan pelarut dalam analit. Output akan direkam sebagai rangkaian puncak, masing-masing puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melewati detektor dan menyerap sinar UV. Tinggi dan luas puncak dapat digunakan untuk mengukur jumlah dari senyawa ini.

Konsentrasi kafein dalam percobaan ini ditentukan dengan cara metoda kurva kalibrasi (penggunaan serangkaian larutan standar sebagai pembanding). Perbedaan nilai konsentrasi dari kafein yang diperoleh berdasarkan perhitungan dengan menggunakan luas kromatogram maupun tinggi kromatogram dapat disebabkan oleh adanya udara yang masuk ke dalam kolom sehingga mempengaruhi tekanan dalam kolom.

(13)

VIII. Kesimpulan

Konsentrasi kafein dalam sampel teh dan kopi berdasarkan hasil kurva dari luas area kromatogram adalah 444.2975 ppm dan 1216.3635 ppm dan dari tinggi puncak kromatogram sebesar 391.8326 ppm dan 1118.0735 ppm.

IX. Daftar Pustaka

www.scimedia.com/chem-ed/sep/lc/hplc.htm, diakses 21/04/2014 20:37 WIB http://hplc.chem.shu.edu/NEW/HPLC_Book/Detectors/det_uv.html,

diakses 22/04/2014 21:31 WIB

www.sciencelab.com/msdsList.php, diakses 19/04/2014 15:11 WIB www.chem-is-try.org/materi_kimia, diakses 19/04/2014 15:18 WIB