III. METODE PENELITIAN
A.Materi, lokasi, dan waktu penelitian
1. Materi penelitian
1.1.Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah labu Erlenmeyer, beaker glass, tabung reaksi, cawan petri, tangkai Drugalsky, pipet ukur, pipet tetes, mikropipet, tip, filler, spatula, jarum inokulasi, kompor gas, timbangan analitik,
hot plate and magnetic stirer, kulkas standar, burret, autoclave, oven, kertas cakram, shaker incubator, inkubator, blender, saringan, corong, dandang, pembakar spirtus, gunting, mikroskop, sprayer alkohol, tabung ependorf, baki, penggaris, spectrophotometer, dan pH universal.
1.2.Bahan
Bahan-bahan yang digunakan terdiri susu kedelai, kultur bakteri
Bacillus cereus (koleksi Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Biologi Unsoed), isolat terbaik kultur Bifidobacterium sp. (koleksi Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Biologi Unsoed) dari penelitian sebelumnya, kultur
Lactobacillus bulgaricus dan kultur Streptococcus thermophillus (koleksi Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Biologi Unsoed), indikator phenolptalein, susu bubuk skim, sukrosa, ekstrak ragi 0,1%, NaOH 0,1 N, Media Nutrient Agar (NA), media Nutrient Broth (NB), media de Mann Rogosa Sharpe Agar
(MRSA), media de Mann Rogosa Sharpe Broth (MRSB), anaerob jar,
alumunium foil, spirtus, kapas, tissue, label, wrapper, akuades steril, alkohol 70%.
2. Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman Purwokerto selama bulan Juli – Desember 2014.
7 B.Metode Penelitian
1. Rancangan percobaan
Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode eksperimental menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) pola faktorial. Faktor pertama yaitu lama inkubasi soyghurt yang diberi penambahan Bifidobacterium sp. pada suhu 37oC dan faktor kedua adalah perbandingan konsentrasi Bifidobacterium sp. pada soyghurt. Setiap perlakuan diulang sebanyak 3 kali.
a. Lama inkubasi soyghurt pada suhu 37oC:
b. Konsentrasi Bifidobacterium sp. pada soyghurt :
K0 = S. thermophillus : L. bulgaricus : Bifidobacterium sp. (1:1:0)
K1 = S. thermophillus : L. bulgaricus : Bifidobacterium sp. (1:1:1)
K2 = S. thermophillus : L. bulgaricus : Bifidobacterium sp. (1:1:2)
sehingga diperoleh 21 kombinasi sebagai berikut:
Tabel 3.1. Dua puluh satu Kombinasi Rancangan Percobaan
Konsentrasi
2. Variabel dan parameter penelitian
Variabel bebas yang digunakan adalah lama inkubasi soyghurt dengan penambahan Bifidobacterium sp. dan konsentrasi Bifidobacterium sp. pada
soyghurt, ada pun variabel tergantung adalah aktivitas antimikroba soyghurt
dengan penambahan Bifidobacterium sp. terhadap B. cereus. Parameter utama yang diamati adalah: daya hambat soyghurt dengan tambahan Bifidobacterium sp. terhadap B. cereus (Uji difusi) dengan parameter pendukung yaitu kadar asam laktat dan uji organoleptik.
8 3. Bagan Alir Penelitian
Pembuatan Media
Pembuatan suspensi biakan S. thermophillus, L. bulgaricus, dan Bifidobacterium sp.
Peremajaan S. thermophillus, L. bulgaricus, dan Bifidobacterium sp.
(Kusnawati, 2004 dalam Akmar, 2006). Peremajaan B. cereus
Produksi kultur starter
Pembuatan starter S. thermophillus (Koroleva, 1991).
Pembuatan starter L. bulgaricus dan Bifidobacterium sp. (Koroleva, 1991).
Produksi Soyghurt
Soyghurt standar S. thermophillus : L. bulgaricus (1:1) (modifikasi Bagiastra, 1984)
Soyghurt dengan penambahan Bifidobacterium sp. dengan berbagai konsentrasi
Penambahan 3 mL total starter
S. thermophillus : L. bulgaricus : Bidifobacterium sp. (1:1:2) (K2)
Penambahan 3 mL total starter
S. thermophillus : L. bulgaricus : Bifidobacterium sp. ( 1:1:1) (K1)
Aroma agak tajam pada lama inkubasi 24 jam pada lama inkubasi 24 jam
dengan konsentrasi L. bulgaricus : S. thermophillus
: Bifidobacterium sp. (1:1:2) yaitu 0,786%
Zona jernih yang terbentuk paling luas yaitu pada lama inkubasi 24 jam dengan perbandingan L. bulgaricus
: S. thermophillus : Bifidobacterium sp. (1:1:1)
sebesar 9,17 mm. Data dianalisis menggunakan analisis ragam Uji F dan dilanjutkan uji Beda Nyata Jujur (BNJ).
9 4. Cara kerja
4.1 Pembuatan media (Lampiran 1)
Media yang digunakan dalam penelitian ini adalah deMann Rogosa
SharpeAgar (MRSA), deMann Rogossa SharpeBroth (MRSB), Nutrient Agar
(NA), dan medium Nutrient Broth (NB).
4.2 Peremajaan S. thermophillus, L. bulgaricus, dan Bifidobacterium sp. (Modifikasi Kusnawati dalam Akmar, 2006)
Isolat S. thermophillus, L. bulgaricus, dan Bifidobacterium sp. masing-masing diambil sebanyak 1 ose kemudian digoreskan secara zig-zag (streak goresan) ke dalam tabung reaksi yang berisi deMann Rogossa Sharpe Agar
(MRSA) miring secara aseptis, lalu diinkubasi pada suhu 37oC selama 2 hari. 4.3 Peremajaan B. cereus
Kultur B. cereus sebelum diregenerasi ke media Nutrient Broth (NB), ditumbuhkan terlebih dahulu pada media Nutrient Agar (NA) dengan cara digoreskan (streak plate) maupun metode sebar (spread plate).
4.4 Pembuatan suspensi biakan S. thermophillus, L. bulgaricus dan
Bifidobacterium sp. (Oxoid, 1980)
S. thermophillus, L. bulgaricus, dan Bifidobacterium sp. masing-masing diinokulasikan pada media MRS Broth sebanyak 1 ose secara terpisah dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 1-2 hari hingga terbentuk kekeruhan pada media. Kultur murni pada media deMann Rogosa Sharpe Broth (MRSB) inilah yang akan digunakan dalam tahapan pembuatan starter soyghurt.
4.5 Produksi starter (Lampiran 2)
Pembuatan starter S. thermophillus, L. bulgaricus dan
Bifidobacterium sp. memerlukan 3 tahapan yaitu kultur induk, feed starter, dan
bulk starter.
4.5.1 Pembuatan starter S. thermophillus (Koroleva, 1991)
Proses pembuatan starter S. thermophillus sebanyak 8,5 g susu bubuk skim, 10 g sukrosa, 0,1 g ekstrak ragi, dan akuades 100 mL
disterilisasi dengan autoklaf kemudian ditambah dengan 1%
S. thermophillus yang telah diukur OD ± 0,5 ( = 600 nm) dan
10
12 jam dengan suhu 37oC dan kultur tersebut disebut kultur induk. Proses selanjutnya membuat feed starter yaitu dengan cara menambahkan 3 mL kultur induk kedalam media tumbuh baru (Media B) sebanyak 97 mL kemudian diinkubasi selama 6 jam dengan suhu 37oC sampai terkoagulasi. Kultur ini selanjutnya akan dijadikan bulk starter yaitu dengan cara menambahkan 3 mL feed starter ke dalam media tumbuh baru (Media C) sebanyak 97 mL selanjutnya diinkubasi selama 8 jam pada suhu 37oC.
4.5.2 Pembuatan starter L. bulgaricus dan Bifidobacterium sp. (Koroleva, 1991)
Proses pembuatan starter yaitu 8,5 g susu bubuk skim dan 100 mL akuades dicampur lalu sterilisasi menggunakan autoklaf, kemudian ditambah dengan 1% L. bulgaricus dan Bifidobacterium sp. yang telah diukur OD ± 0,5 ( = 600nm) dan dinamakan media tumbuh baru (Media A). Kemudian diinkubasi selama 24 jam dengan suhu 37oC dan kultur tersebut disebut kultur induk. Proses selanjutnya membuat feed starter
yaitu dengan cara menambahkan 3 mL kultur induk ke dalam media tumbuh baru (Media B) sebanyak 97 mL kemudian diinkubasi selama 29 jam dengan suhu 37oC sampai terkoagulasi. Kultur ini yang selanjutnya akan dijadikan bulk starter yaitu dengan cara menambahkan 3 mL feed starter ke dalam media tumbuh baru (Media C) sebanyak 97 mL lalu diinkubasi selama 9 jam yang bersuhu 37oC.
4.6 Produksi soyghurt memakai starter S. thermophillus, L. bulgaricus, dan Bifidobacterium sp. (Lampiran 3)
4.6.1 Soyghurt standar (modifikasi Bagiastra, 1984)
Susu kedelai yang telah disiapkan dalam botol bening, ditambahkan dengan susu skim 5% dan sukrosa sebanyak 5% dilarutkan hingga volume akhir 1000 mL, diaduk sampai larut. Kemudian dipasteurisasi pada suhu 80-90oC selama 30 menit dan dilakukan pendinginan sampai suhu 45oC. Selanjutnya diinokulasi dengan starter yoghurt sebanyak 3 mL dengan perbandingan S. thermophillus dan L. bulgaricus sebanyak 1:1. Kemudian di kocok beberapa kali, lalu inkubasi pada suhu 37oC selama 24 Jam (K0).
11
4.6.2 Soyghurt dengan penambahan Bifidobacterium sp. pada berbagai konsentrasi
Perlakuan K1 dan K2 dilakukan pekerjaan yang sama seperti 3.6.1.
hanya :
a. Penambahan 3 mL total starter, dengan perbandingan
S. thermophillus : L. bulgaricus : Bifidobacterium sp. sebanyak 1 : 1 : 1 diinokulasikan kedalam susu kedelai (K1).
b. Penambahan 3 mL total starter, dengan perbandingan
S. thermophillus : L. bulgaricus : Bifidobacterium sp. sebanyak 1 : 1 : 2 diinokulasikan kedalam susu kedelai (K2).
Kemudian ketiga produk soyghurt dengan berbagai konsentrasi tersebut dikocok beberapa kali, lalu diinkubasi dengan suhu 37oC selama 1 X 24 jam.
4.7 Pengujian aktivitas antimikroba produk soyghurt yang ditambah kultur Bifidobacterium sp. pada B. cereus
4.7.1 Pembuatan suspensi bakteri B. cereus
Sebelum uji hambat, kultur B. cereus diregenerasi dalam 100 mL
Nutrient Broth (NB) steril pada Erlenmeyer 200 mL. Selanjutnya diinkubasi dalam inkubator bergoyang (shaker incubator) dengan kecepatan 150 rpm selama 24 jam.
4.7.2 Daya hambat soyghurt Bifidobacterium sp. terhadap B. cereus
(Uji difusi) (modifikasi Yang et al., 1992 dan Biswas et al., 1991)
Masing-masing soyghurt standar dan soyghurt yang diberi penambahan Bifidobacterium sp. diambil 4,5 mL. Soyghurt disentrifuge dengan kecepatan 13.000 rpm selama 15 menit. Masing-masing supernatan diukur pH, sampai pH-nya 6,5. Kemudian dipanaskan pada suhu 100oC selama 15 menit.
Sebanyak 0,1 mL suspensi B. cereus diinokulasikan pada medium
Nutrient Agar (NA) (spread plate) kemudian diratakan. Selanjutnya 0,2 µl dari supernatan B. cereus diteteskan di atas kertas cakram steril dengan diameter 6 mm, diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC, ada tidaknya penghambatan ditandai dengan terbentuknya daerah bening pada bekas tetes (spot) supernatan.
12
Pengamatan uji aktivitas antimikroba dilakukan denga mengukur diameter daerah hambat (DDH) pertumbuhan bakteri yang terbentuk di sekitar kertas cakram dengan penggaris. Pengukuran dilakukan dalam satuan milimeter (mm) dengan menggunakan rumus :
... (3-1)
Keterangan :
D1 : Diameter zona jernih horizontal
D2 : Diameter zona jernih vertikal
4.8 Pengukuran kadar asam laktat soyghurt (AOAC, 1995)
Soyghurt standar dan soyghurt yang diberi penambahan
Bifidobacterium sp. telah siap, maka masing-masing kadar asam laktat yang terkandung dihitung setiap 4 jam sekali selama 1 x 24 jam. Sampel diambil sebanyak 10 mL dan dimasukkan kedalam labu Erlenmeyer lalu ditambahkan 90 mL akuades untuk dititrasi dengan NaOH 0,1 N. Indikator yang digunakan adalah phenolphtalein 1% sebanyak 3 tetes dengan perubahan warna dari tak berwarna menjadi merah muda. Menurut syarat mutu yoghurt pada SNI 01-2981-1992, jumlah asam laktat adalah 0,5-2%. Konsentrasi total asam laktat dihitung dengan persamaan :
... (3-2)
Keterangan :
Vol. NaOH : Volume NaOH yang terpakai (mL) N NaOH : Konsentrasi NaOH (N)
Mr. As. Laktat : 90g/ekivalen
Vol. Sampel : Volume sampel yang dianalisis (mL) 4.9 Uji Organoleptik (Soekarto, 1985)
Pengujian organolpetik soyghurt S. thermophillus : L. bulgaricus :
Bifidobactreium sp. (1:1:0, 1:1:1, 1:1:2) dilakukan dengan uji mutu hedonik kepada 10 panelis. Masing-masing soyghurt dimasukan kedalam wadah dan diberi label, lalu diambil satu sendok. Soyghurt
yang diberi perlakuan diuji mutu hedonik terhadap tingkat keasaman, kesukaan, aroma, dan warna, kemudian para panelis diberi lembar
13
penilaian. Penilaian dilakukan menggunakan skala numerik sebagai berikut :
Tabel 3.2. Skala numerik uji hedonik tingkat keasaman
Skala Hedonik Skala Numerik
Tidak asam 1 Agak asam 2
Asam 3
Sangat Asam 4
Tabel 3.3. Skala numerik uji hedonik kesukaan
Skala Hedonik Skala Numerik
Tidak Suka 1 Agak Suka 2
Suka 3
Sangat Suka 4
Tabel 3.4. Skala numerik uji hedonik aroma
Skala Hedonik Skala Numerik
Tidak Tajam 1 Agak Tajam 2
Tajam 3
Sangat Tajam 4
Tabel 3.5. Skala numerik uji hedonik warna
Skala Hedonik Skala Numerik
Putih 1
Putih kekuningan 2 Kuning pucat 3
Kuning 4
14 C.Metode Analisis
Data yang diperoleh dianalisis menggunakan analisis ragam (ANOVA) atau uji F pada tingkat kesalahan 1 % dan 5 %, hasil perlakuan menunjukkan berpengaruh nyata dan sangat nyata sehingga dilanjutkan uji Beda Nyata Jujur (BNJ) (Steel dan Torrie, 1993).
