LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI “PEMBUATAN MEDIA”
Nama : Zulfa Ridho Arrizqi NIM : 135040218113016 Kelompok : 2
Asisten : Yosep Minar A.M.
PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG
BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang
Menurut (Hendaryono, 1994) media merupakan faktor utama dalam perbanya-kan dengan kultur jaringan. Keberhasilan perbanyakan dan perkembang-biakan tanaman dengan metode kultur jaringan secara umum sangat tergantung pada jenis media. Media tumbuh pada kultur jaringan sangat besar pengaruhnya terhadap pertumbuhan dan perkembangan eksplan serta bibit yang dihasilkannya. Campuran media yang satu mungkin cocok dengan jenis tanaman tertentu, namun tidak cocok untuk jenis tanaman yang lain. Hal ini disebabkan karena setiap spesies tanaman dan bagian dari tanaman mempunyai kemampuan yang tidak sama dalam mensintesa atau merombak zat- zat yang menyusun media. Oleh karena itu tidak ada formulasi yang sesuai untuk semua jenis tanaman yang menyebabkan diciptakannya berbagai macam media yang disesuaikan dengan jenis tanaman yang akan dikulturkan.
1.2 Tujuan
a. Mengetahui macam-macam media untuk kultur jaringan b. Mengetahui komposisi media MS serta fungsi
c. Mengetahui teknik aseptik dalam pembuatan media d. Mengetahui jenis kontaminasi media
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Macam-macam media untuk kultur jaringan
a) Media Knop
Dapat juga digunakan untuk menumbuhkan kalus wortel. Kultur kalus, biasanya ditumbuhkan pada media dengan kosentrasi garam-garam yang rendah seperti dalam kultur akar dengan penambahan suplemen seperti glucosa, gelatine, thiamine, cysteine-HCl dan IAA.
b) Media White
Dikembangkan oleh Hildebrant untuk keperluan kultur jaringan tumor bunga matahari, ditemukan bahwa unsur makro yang dibutuhkan kultur tersebut, lebih tinggi dari pada yang dibutuhkan oleh kultur tembakau. Unsur F, Ca, Hg dan S pada media untuk tumor bunga matahari ini, sama dengan media untuk jaringan normal yang dikembangkan kemudian. Konsentrasi NO3- dan K+ yang digunakan Hildebrant ini lebih tinggi dari media white, tetapi masih lebih rendah dari pada media-media lain yang umum digunakan sekarang.
c) Media Knudson dan media Vacin and Went
NH4+ ternyata dibutuhkan untuk perkembangan protocorm. Media Nitsch & Nitsch, menggunakan NO3- dan K+ dengan kadar yang cukup tinggi untuk mengkulturkan jaringan tanaman artichoke Jerussalem. Penambahan ammonium khlorida sebanyak 0.1 mM, menghasilkan pertumbuhan jaringan yang menurun. Pertumbuhan sel dari jaringan suatu organ dibandingkan dengan jaringan tumor tanaman Venca rosea (Catharanthus roseus), menunjukkan bahwa penambahan ammonium ke dalam media White yang sudah dimodifikasi, mempunyai pertumbuhan yang lebih baik. Konsentrasi NO3-, NH4-, K+ dan H2PO4- yang diperoleh, hampir sama dengan yang dikembangkan oleh Miller.
d) Media Murashige & Skoog (media MS)
1. Lin & Staba, menggunakan media dengan setengah dari komposisi unsur makro MS, dan memodifikasi : 9 mM ammonium nitrat yang seharusnya 10mM, sedangkan KH2 PO4 yang dikurangi menjadi 0.5 Mm, tidak 0.625 mM. Larutan senyawa makro dari media Lin & Staba, kemudian digunakan oleh Halperin untuk penelitian embryogenesis kultur jaringan wortel dan juga digunakan oleh Bourgin & Nitsch (1967 dalam Gunawan 1988) serta Nitsch & Nitsch (1969 dalam Gunawan 1988) dalam penelitian kultur anther.
2. Modifikasi media MS yang lain dibuat oleh Durzan et alI (1973 dalam Gunawan 1988) untuk kultur suspensi sel white spruce dengan cara mengurangi konsentrasi K+ dan NO3-, dan menambah konsentrasi Ca2+ nya.
3. Chaturvedi et al (1978)
e) Media Gamborg B5 (media B5)
Pertama kali dikembangkan untuk kultur kalus kedelai dengan konsentrasi nitrat dan amonium lebih rendah dibandingkan media MS. Untuk selanjutnya media B5 dikembangkan untuk kultur kalus dan suspensi, serta sangat baik sebagai media dasar untuk meregenerasi seluruh bagian tanaman.. Pada masa ini media B5 juga digunakan untuk kultur-kultur lain. Media ini dikembangkan dari komposisi PRL-4, media ini menggunakan konsentrasi NH4+ yang rendah, karena konsentrasi yang lebih tinggi dari 2 mM menghambat pertumbuhan sel kedelai. Fosfat yang diberikan setelah 1 mM, Ca2+ antara 1-4 mM, sedangkan Mg2+ antara 0.5-3 mM (Gamborg et al, 1968).
f) Media Schenk & Hildebrant (media SH)
g) Media WPM (Woody Plant Medium)
Yang dikembangkan oleh Lioyd & Mc Coen pada tahun 1981, merupakan media dengan konsentrasi ion yang lebih rendah dari media MS. Media diperuntukkan khusus tanaman berkayu, dan dikembangkan oleh ahli lain, tetapi sulfat yang digunakan lebih tinggi dari sulfat pada media WPM. Saat ini WPM banyak digunakan untuk perbanyakan tanaman hias berperawakan perdu dan pohon-pohon.
h) Media N6
Media N6 mempunyai ciri perbandingan NH₄⁺ dan NO₃⁻ yang jauh perbandinganya. Amonium yang diberikan dalam bentuk (NH₄)SO₄ hanya sebanyak 363 mg/l, sedangkan KNO₃ 2830 mg/l.
(Suryowinoto, M. 1991)
2.2 Komposisi Media MS Serta Fungsi
Menurut Sriyanti (2002) dalam media MS (Murashige dan Skogg), terdiri dari beberapa macam unsur yang dikandung di dalamnya, antara lain: makronutrien, mikronutrien, vitamin, dan zat besi.
a. Unsur Nitrogen (N) karbohidrat. Maka, unsur P dibutuhkan secara besar-besaran pada waktu pertumbuhan benih, pembungaan, pemasakan buah dan biji.
c. Unsur Kalium (K)
Unsur K berfungsi untuk memperkuat tubuh tanaman, karena dapat menguatkan serabut-serabut akar sehing-ga daun, bunga, dan buah tidak mudah gugur.
d. Unsur Sulfur (S)
Unsur S berperan dalam pembentukan bintil-bintil akar, membantu pembentukan anakan sehingga pertumbuhan dan ketahanan tanaman terjamin.
e. Unsur Kalsium (Ca)
Unsur Ca berfungsi merangsang pembentukan bulu-bulu akar, mengeraskan batang dan merasang pembentukan biji.
f.Unsur Magnesium (Mg)
Kegunaan fosfat sebagai bahan mentah untuk pembentukan sejumlah protein.
g. Unsur Besi (Fe)
Pemberian unsur Fe juga berfungsi sebagai penyangga yang sangat penting untuk menyangga kestabilan pH media selama digunakan untuk menum-buhkan jaringan tanaman.
h. Unsur Sukrosa
Sukrosa sering ditambahkan pada medium kultur jaringan sebagai sumber energi yang diperlukan untuk induksi kalus.
i. Unsur Glukosa dan Fruktosa
j. Unsur Mio-inositol
Penambahan mio-inositol pada medium bertujuan untuk membantu diferensiasi dan pertumbuhan sejumlah jaringan.
k. Unsur Asam-asam Amino
Asam amino berperan penting untuk pertumbuhan dan diferensiasi kalus.
l. Unsur Zat Pengtur Tumbuh (ZPT)
Zat pengatur tumbuh sangat diperlukan sebagai komponen medium bagi pertumbuhan dan diferensiasi.
m. Sitokinin
Sitokinin berperan dalam pembelahan sel tanaman terutama mempengaruhi metabolisme asam nukleat dan sintesis protein.
n. Auksin
Auksin berperan dalam proses merubah sifat osmotik dari vakuola dan berpengalaman terhadap perpanjangan sel tanaman sedangkan sitokinin berpengaruh pada pembelahan sel dan diferensiasi sel .
2.3 Teknik Aseptik dalam Pembuatan Media
Menurut Kusdianti (2006) teknik aseptik dalam pembuatan media meliputi:
1. Sterilisasi Peralatan
Sterilisasi ini dilakukan agar alat tersebut bebas dari mikroba baik dalam bentuk vegetatif maupun spora, sterilisasi peralatan dibagi menjadi 2 :
a. Sterilisasi Basah, dengan cara pengaturan tekann dalam autoklaf. Cara ini dipakai untuk sterilisasi media yang tahan terhadap pemanasan tinggi. Biasanya dijalankan dengan menggunakan panas 120oC selama 10 – 20 menit tergantung kebutuhan .
digunakan untuk sterilisasi alat-alat laboratorium dari gelas. Misalnya : Petri, tabung, gelas, botol pipet , dll. 2. Sterilisasi Ruang
Mikroganisme dapat hidup dimana-mana bukan hanya diruang terbuka maupun tertutup. Kehidupan mikroganisme diruang tertutup lebih mudah di kendalikan dibanding ruang terbuka. Sterilisasi ruangan dilakukan dengan menyemprotkan alkaholol 90 % dengan hand-sprayer.
3. Sterilisasi Bahan Tanam
Dalam sterilisasi bahan tanam. Hal yang penting yang harus mendapat perlakuan adalah bahwa sel tanaman dan kontaminan adalah sama-sama benda hidup. Kontaminasi harus dilakukan tanpa mematikan sel tanaman. bahan sterilisasi umumnya bersifat toxic terhadap jaringan tanaman. pembiasan berkali-kali sesudah perendaman dalam pelarutan bahan sterilisasi sangat diperlukan untuk menghilangkan sisa – sisa bahan aktif yang masih menempel di permukaan.
2.4 Jenis Kontaminasi Media
garis–garis (seperti benang) yang berwarna putih sampai abu–abu. Penyebab terjadinya kontaminasi bisa diakibatkan karena kesalahan pada saat penanaman, saat sterilisasi media dan eksplan atau bahkan pada saat pembuatan media.
BAB III METODOLOGI 3.1 Alat dan Bahan
Alat
a. botol kultur : berfungsi sebagai tempat media kultur
b. karet gelang : berfungsi untuk penutup atau tali penutup plastik dan alumunium
c. Plastik : sebagai penutup botol kultur
d. Gelas ukur : untuk mengukur cairan yang di butuhkan
e. Mikro pipet : untuk mengambil larutan stok dengan ukuran terkecil mikro meter
f. Beaker glass : untuk tempat pembuatan larutan stok g. Kertas Lakmus: untuk mengukur pH larutan h. Stirer : megaduk larutan
i. Microwave : untuk memasak larutan hingga larutan mengental j. Alumanium foil : sebagai penutup botol kultur
k. Autoclave : sterilisasi botol kultur sebelum di masukkan ke ruangan pengamatan
l. Timbangan analitik : untuk menimbang berat bahan yang diperlukan
m. Oven : sterilisasi kering botol kultur Bahan
a. Aquades : 250 ml sebagai bahan media MS
b. Makro : 25 ml kepekatan (10x) sebagai bahan media MS
c. Mikro : 2,5 ml kepekatan (100x) untuk media 250 ml bahan media MS
d. Fe DTA : 2,5 ml kepekatan(100x) sebagai bahan media MS e. Vitamin : 2,5 ml (100x) sebagai bahan media MS
3.2 Langkah Kerja
Pipet larutan stok (Makro, mikro, Vitamin, Fe-Na-EDTA) sesuai kebutuhan
Masukan dalam Beaker gelas dan tambahkan Aquades sampai Volume yang di inginkan
Masukan Magnet Stirer kedalam Beaker gelas dan letakan pada Plate Magnetic Stirer Nyalakan magnetic stirrer supaya larutan homogen
dan tambahkan Sukrosa (30 g/L) sampai larut
Ukur pH Larutan sesuai ketentuan (5,8), dengan pH Meter atau Kertas pH
Universal
Jika pH sudah sesuai, tambahkan agar-agar (6,7 g/L) yang sudah di siapka
panaskan sampai mendidih dan larut sempurna
Tiriskan sampai tidak terlalu panas dan tuangkan dalam botol kultur (Masingmasing 20 mL)
Tutup botol dengan plastic yang sudah di siapkan dan media siap di sterilisasi dengan Autoclave pada tekanan 1.5 psi selama 20 menit
Setelah di autoclave botol media di pindahkan ke ruang kultur jaringan dan
3.3 Analisis Perlakuan
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Hasil
4.2 Pembahasan
disebabkan oleh tiga peristiwa. Pertama, pembelahan sel dipacu sel apeks tajuk, terutama di sel meristematik yang terletak lebih bawah,yang menumbuhkan jalur panjang sel korteks dan sel empulur.(Sachs dalam Salisbury dan Ross,1995)
Pada tabel 2. Pada perlakuan 5 ppm didapatkan berbeda nyata terhadap perlakuan 4,5 ppm, 5,5 ppm, 4 ppm dan 6 ppm dengan rerata
BAB V KESIMPULAN
Media merupakan faktor penentu dalam perbanyakan dengan kultur jaringan. Komposisi media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman yang akan diperbanyak. Media yang cocok mempengaruhi pertumbuhan eksplan yang telah ditanam untuk menjadi plantet (tanaman kecil). Media yang baik, harus memenuhi syarat nutrisi yang diperlukan eksplan untuk tumbuh dan berkembang. Oleh karena itu, di dalam media kultur jaringan ditambahkan berbagai macam zat. Berhasilnya kultur jaringan banyak ditentukan selain kondisi aseptic juga oleh media tanam. Sterilisasi media harus dilakukan dengan baik, agar tidak terjadi kontaminasi. Dan dari praktikum yang telah dilakukan, disimpulkan bahwa dari media yang telah dibuat, semuanya terkontaminasi.
DAFTAR PUSTAKA
Astuti, R. D. 2007. Penambahan Sitokinin pada Dua Macam Media In Vitro untuk Regenerasi Plantlet Anggrek Bulan (Phalaenopsis sp.). Fakultas Pertanian Universitas Brawijaya.
George, Edwin. dan Sherrington Paul. 2008. Plant Propagation by Tissue Culture Handbook and Directory of Commercial Laboratories. Inggris: Exegetics Limited.
Hendaryono dkk. 1994. Teknik Kultur Jaringan. Yogyakarta: Kanisius.
Herawan, T dan M. Na’iem. 2006. Pengaruh Jenis Media dan Konsentrasi Zat Pengatur Tumbuh Terhadap Perakaran pada Kultur Jaringan Cendana (Santalum album Linn.).
Jurnal Agrosains 19(2) : 103-109
Kusdianti. 2006. Penanaman Eksplan. Semarang : Universitas Negeri Semarang.
Salisbury, Frank dan Ross, Cleon. 1995. Fisiologi Tumbuhan, jilid 3. Bandung: Penerbit ITB Samosir. 2008. Bioteknologi Tanaman.
